CN104337804A - 白头翁素在制备治疗骨性关节炎的药物中的应用 - Google Patents

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陈林
王祖强
谢杨丽
黄俊兰
罗凤涛
周思儒
徐伟
孙先定
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Abstract

本发明公开了白头翁素在制备治疗骨性关节炎的药物中的应用，将白头翁素处理骨性关节炎小鼠后能够抑制关节软骨降解和抑制软骨肥大化，并降低MMP13和Collagen X的表达量；本发明拓宽了白头翁素的医药用途，为通过防治软骨基质降解和软骨细胞异常肥大分化来治疗骨性关节炎提供了新药，可以从骨性关节炎发病机制上靶向治疗疾病，对临床治疗骨性关节炎具有重要意义。

Description

白头翁素在制备治疗骨性关节炎的药物中的应用
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及白头翁素在制备治疗骨性关节炎的药物中的应用。
背景技术
目前骨性关节炎(Osteoarthritis，OA)的治疗主要为物理治疗、药物治疗及手术治疗。其中手术治疗(全关节置换)是晚期骨性关节炎患者的唯一有效治疗手段，但手术费用昂贵，并发症多，并且到此阶段，患者已经历了较长时间的疼痛及功能障碍，生活质量受到严重影响。所以筛选早期干预骨性关节炎的药物靶点，进而研发相应治疗措施是防治骨性关节炎，改善患者生活质量的重要策略。目前临床治疗骨关节炎的药物主要围绕缓解疼痛、抑制炎症等方面，如口服甾体类抗炎镇痛药、物理治疗，对于持续性的疼痛则采取关节腔内注射透明质酸(HA)、类固醇激素(CS)与富含血小板的血浆(PRP)等。但这些治疗主要是对症，有效缓解症状时间较短，难以从根本上缓解OA病情的发展，今后重点发展方向是基于OA的分子机制研发分子靶向药物。目前已对多个潜在药物靶点进行研究，如IL-1受体、前列腺素E2合酶(PGES)、TNF-α、Bmp7等，但由于药物靶点本身的有效性及安全性等问题，仍需要进一步研究，离最终开发出有效防治骨性关节炎药物的目标还很远。
在骨关节炎的发生发展中，关节软骨细胞外基质代谢异常与软骨细胞异常肥大分化是两个重要的致病因素。软骨细胞外基质主要是由II型胶原(Collagen II)与软骨聚集蛋白聚糖(Aggrecan，最为丰富的蛋白聚糖)组成。软骨基质的降解主要由胞外蛋白水解酶完成。关节软骨蛋白水解酶主要分为两类，一类是降解蛋白聚糖的aggrecanases，此家族中最重要的为Adamts4和Adamts5；而另一类是主要降解胶原纤维的MMPs(Matrix Metalloproteinase)，主要包括MMP1、MMP3、MMP9与MMP13等，其中以MMP13降解II型胶原的能力最强。从上述骨关节炎发生机制的介绍中可看出，阻断软骨基质降解和防治软骨细胞异常肥大分化是防治骨关节炎的重要策略。
白头翁素(Anemonin)是从我国中草药毛莨科植物中提取，有显著的抗菌作用，对葡萄球菌、链球菌、白喉杆菌的抑菌浓度为1:12500，对结核杆菌为1:50000，对大肠杆菌也有类似抑菌作用。并且对中枢神经系统是先兴奋后麻痹，临床曾作治疗痢疾及镇静、镇痛药用。但是，未见白头翁素对骨性关节炎具有保护作用的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供白头翁素在制备促进骨性关节炎软骨修复的药物中的应用。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
白头翁素在制备治疗骨性关节炎的药物中的应用。
优选的，白头翁素在制备抑制关节软骨降解和/或软骨肥大化的药物中的应用。
优选的，白头翁素在制备下调骨性关节炎MMP13和/或Collagen X表达量的药物中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明公开了白头翁素在制备治疗骨性关节炎的药物中的应用，利用白头翁素特异性的阻断软骨基质降解和防治软骨细胞异常肥大分化，可以从骨性关节炎发病机制上靶向治疗疾病，为临床治疗骨性关节炎提供有效的药物。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
图1为DMM模型小鼠膝关节组织切片藏红固绿染色结果。
图2为免疫组化检测DMM模型小鼠膝关节软骨MMP13表达情况。
图3为免疫组化检测DMM模型小鼠膝关节软骨Collagen X表达情况。
图4为检测炎症环境中的关节软骨细胞MMP-13表达量。
图5为检测炎症环境中的关节软骨细胞Aggrecan表达量。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
本发明实施例中使用的白头翁素(Anemonin)购于美国ChromaDex公司，化学名称为：7-Dioxadispiro[4.0.4.2]dodeca-3,9-diene-2,8-dione,trans，分子式为C10H2O4，分子量为192.16。
一、内侧半月板的不稳定模型建立
采用显微外科手术实施内侧半月板的不稳定(Destabilization of the medial meniscus，DMM)手术构建小鼠膝关节炎模型。手术主要步骤如下：将小鼠固定、消毒后，用显微刀片切开髌骨韧带内侧，暴露关节腔，钝性分离股骨髁间的脂肪垫，暴露髁间区域，用显微刀片挑断内侧半月板胫骨韧带，缝合组织与皮肤。术中注意避免损伤关节软骨，术后不固定手术肢体，笼内自由活动，腹腔注射青霉素预防感染。对照组小鼠不做处理。
二、Anemonin处理DMM模型小鼠
构建的DMM模型于手术后2周向关节腔内注射Anemonin(AEN)，具体方法如下：先把Anemonin溶液(浓度为5mg/mL)或者生理盐水(对照)与纤维蛋白原溶液(3μg/μL)混合后取10μL注射在关节腔中；接着注射1μL凝血酶(0.2unit)使纤维蛋白原转变为纤维蛋白，同时按照相同的方法向对照组小鼠关节腔内注射Anemonin。然后在手术后第8周处死小鼠，取小鼠膝关节进行组织切片，将组织切片采用藏红固绿染色，并于显微镜下观察软骨组织学特征，结果如图1所示。结果显示，相比注射生理盐水的对照组，DMM手术后注射了Anemonin的小鼠的关节软骨破坏程度明显降低，表明Anemonin化合物可以使DMM模型小鼠的软骨降解过程延迟。
免疫组化(Immunohistochemistry，IHC)检测关节软骨MMP13和Collagen X表达情况：取实验组和对照组小鼠膝关节组织切片，用二甲苯脱蜡，梯度浓度的酒精复水，然后用质量分数为3％的H2O2消除内源性过氧化氢酶的活性，胰酶孵育修复抗原，山羊血清封闭，然后用兔MMP13多克隆抗体(1：100稀释；ProteinTech公司)或兔Collagen X多克隆抗体(1：150稀释；Calbiochem Merck公司)孵育过夜，磷酸盐缓冲液洗净切片，再用辣根过氧化物酶标记的二抗孵育，最后用二氨基联苯胺显色，甲基绿复染，观察MMP13和肥大化细胞标志物Collagen X(ColX)在小鼠关节软骨的表达情况，结果分别如图2和图3所示。由图2和图3可知，DMM手术后小鼠关节软骨的MMP13和Collagen X表达上调，说明在骨性关节炎进程中关节软骨降解增加并发生过度软骨肥大化，而DMM手术后注射Anemonin，MMP13和Collagen X的表达又下调，表明Anemonin对关节软骨降解和软骨肥大化具有抑制作用。
三、Anemonin处理对炎症环境中的关节软骨细胞
人类原代关节软骨组织标本取自关节置换手术后切除的正常的膝关节软骨，将其分离、消化、接种后培养至合适的细胞密度，得关节软骨细胞。将所得关节软骨细胞先用15μg/mLAnemonin处理30分钟(对照不处理)，再加入10ng/mL IL-1β后处理24小时(Anemonin仍然存在于培养基中，对照不处理)，同时将所得关节软骨细胞用等量的Anemonin和IL-1β处理分别处理，接着采用Trizol法提取原代软骨细胞总mRNA，反转录成cDNA，最后荧光实时定量PCR检测MMP-13和Aggrecan的表达，各样本目的基因的表达强度利用其对应的内参基因(GADPH)的量进行校正。荧光实时定量PCR所使用的引物如下：
GADPH基因上游引物：5’-catggagaaggctggggctc-3’(SEQ ID NO.1)；
GADPH基因下游引物：5’-atgaggtccaccaccctgtt-3’(SEQ ID NO.2)；
MMP-13基因上游引物：5’-cttcttcttgttgagctggactc-3’(SEQ ID NO.3)；
MMP-13基因下游引物：5’-ctgtggaggtcactgtagact-3’(SEQ ID NO.4)；
Aggrecan基因上游引物：5’-tggagaggactgtgtggtga-3’(SEQ ID NO.5)；
Aggrecan基因下游引物：5’-ttagatgcggttttgctgat-3’(SEQ ID NO.6)；
荧光实时定量PCR的条件为：95℃30s；95℃5s，57℃20s，72℃15s，共40个循环；95℃30s，57℃30s，95℃30s。根据检测结果计算MMP-13和Aggrecan表达量，结果分别如图4和图5所示。结果显示，在未用Anemonin处理的关节软骨细胞中，经IL-1β处理的细胞比未经IL-1β处理的细胞MMP13表达上调，但Aggrecan的表达量显著下调；提示经IL-1β处理的关节软骨细胞处于一个炎症环境之中，从而模拟了骨关节炎的软骨细胞环境。而在用IL-1β处理的关节软骨细胞中，经Anemonin处理的细胞比未经Anemonin处理的细胞MMP13表达明显下调，以及能够缓解Aggrecan降解。表明Anemonin在处于炎症环境的关节软骨细胞中起阻滞关节软骨细胞基质降解的作用。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (3)

1.白头翁素在制备治疗骨性关节炎的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：白头翁素在制备抑制关节软骨降解和/或软骨肥大化的药物中的应用。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：白头翁素在制备下调骨性关节炎MMP13和/或Collagen X表达量的药物中的应用。
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