CN104330390B - 一种定量检测癌细胞呼出二氧化碳含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种定量检测癌细胞呼出二氧化碳含量的方法，属于荧光生物传感器领域。首先，将TPP‑DMAE溶解于DMSO中，加入高糖DMEM培养基，得到混合溶液；将癌细胞传代至培养皿中，培养，洗涤，加入混合溶液和高糖DMEM培养基，培养，洗涤，加入固定剂，静置，洗涤，加入缓冲液，得到待测样品；检测待测样品的荧光强度，通过对比癌细胞自身新陈代谢产生CO2导致荧光强度‑时间变化率与失活细胞通入气体后的荧光强度‑气体体积变化率随的数值，相同的荧光强度变化率对应的时间以及通入气体的体积即为癌细胞在不同时间内自身新陈代谢产生的CO2体积。所述方法可定量检测活性细胞新陈代谢所产生二氧化碳含量，并实现对癌细胞的类型进行甄别。
Description
技术领域
本发明涉及一种定量检测癌细胞呼出二氧化碳含量的方法，属于荧光生物传感器领域。
背景技术
新陈代谢是生物维持生命活动的基本条件，生命过程中所表现出来的生长、发育、遗传和变异等特征都是以新陈代谢为基础的。机体生理功能和生化功能的正常活动完全依赖于细胞的正常生理和新陈代谢，当细胞出现病变时，人体便发生疾病，而新陈代谢一旦停止，生命也将终结。因而，实现细胞新陈代谢的记录和监控具有重大意义。其中，活性癌细胞的特点是无限制、无止境地增生，使患者体内的营养物质被大量消耗；癌细胞自身释放出多种毒素，使人体产生一系列症状；癌细胞还可转移到全身各处生长繁殖，导致人体消瘦、无力、贫血、食欲不振、发热以及严重的脏器功能受损等。若能实现对癌细胞代谢过程的定量及可视化监控，对于人类解决癌症难题具有重大意义。癌细胞在生长繁殖过程中，不断地与外界发生物质和能量交换，如果通过二氧化碳含量变化监测其代谢过程，对于癌细胞的甄别，进而实现早期诊断具有重要意义。
因而，科研人员开发了一系列荧光探针(如荧光蛋白、无机量子点等)用于细胞成像。然而，荧光蛋白的摩尔吸光系数有限、光漂白现象严重以及光稳定性差，无机量子点由于重金属离子的存在而具有高细胞毒性。这些大大限制了其实际应用，因而开发具有高生物相容性、光稳定性以及细胞成像有效发射的新型生物探针是至关重要的。
目前，大多数文献报道的荧光探针可以实现细胞成像，但由于细胞毒性问题无法实现长时间持续监测，并且这些荧光探针都对二氧化碳没有响应，无法监测细胞的新陈代谢过程。(Warburg,O.；Biochem.Z.,1924,152,319-344.Craig,F.N.；Beecher,H.K.；J.Gen.Physiol.,1943,26,473-478.Goldsmith,A.E.；Narvaez,R.；Oncology,1975,32,247-265.Wang,L.K.；Tian,Y.P.；J.Phys.Chem.C,2014,118,8531-8540.Zhang,X.Y.；Wei,Y.；Appl.Mater.Interfaces,2013,5,1943-1947.Bhunia,S.K.；Jana,N.R.；Appl.Mater.Interfaces,2014,6,7672-7679.Hong,Y.N.；Tang,B.Z.；J.Am.Chem.Soc.,2013,135,62-65.Miyake,T.；McDermott,J.C.；Gramolini,A.O.PloS One,2011,6,e28628.Neto,B.a.D.；Carvalho,P.H.P.R.；Silva,R.G.；RSC Adv.,2012,2,1524-1532.Ye,J.H.；Chen,H.C.；Bai,Y.；RSC Adv.,2014,4,6691-6695.Collado,D.；Vida,Y.；Najera,F.；RSC Adv.,2014,4,2306-2309.)。
发明内容
针对目前对癌细胞代谢过程进行检测采用的荧光探针用于活细胞成像时，不具备定量检测细胞所产生二氧化碳，不能监测癌细胞代谢过程的问题，本发明的目的在于提供一种定量检测癌细胞呼出二氧化碳含量的方法，所述方法采用一种含有4,4',4″-(1H-吡咯-1,2,5-三基)三苯甲酸(2-二甲氨基)乙酯(TPP-DMAE)荧光探针对活细胞的新陈代谢过程进行检测，所述荧光探针用于癌细胞荧光成像的同时可定量检测癌细胞新陈代谢所产生二氧化碳含量，并实现对癌细胞的类型进行甄别。
本发明的目的由以下技术方案实现：
一种定量检测癌细胞呼出二氧化碳含量的方法，所述方法具体步骤如下：
(1)将TPP-DMAE溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，得到浓度为1×10-2mol/L的溶液a；向溶液a中加入高糖DMEM培养基，得到浓度为1×10-5mol/L的溶液b；
(2)将癌细胞传代至培养皿中；将装有癌细胞的培养皿置于培养箱中培养20～24h，洗涤，向培养皿中依次加入相同体积的溶液b和高糖DMEM培养基，得到待测样品1；将待测样品1置于培养箱中培养5～10min，吸出液体，洗涤，向培养皿中加入固定剂，静置5～10min，洗涤，加入缓冲液，得到含有失活细胞的待测样品2；
(3)首先观察待测样品1中癌细胞和待测样品2中失活细胞和的成像情况；再测试待测样品1中癌细胞和待测样品2中失活细胞的荧光强度；
其中，测试待测样品1中癌细胞的荧光强度的测试方法为每间隔1h测试一次，共测试6～10次；
待测样品2中失活细胞的荧光强度的测试方法为：首先，测试待测样品2中失活细胞的初始荧光强度；随后向待测样品2中通入气体，测试通入气体后待测样品2中失活细胞的荧光强度，共通入气体20～40次，每次气体的通入量相等；
(4)根据步骤(3)待测样品1中癌细胞和待测样品2中失活细胞的荧光强度的测试结果计算癌细胞产生的CO2含量，具体为：
首先，根据测试结果绘制待测样品1中癌细胞荧光强度变化率随时间t的变化曲线，得到曲线一；绘制待测样品2中失活细胞通入气体后的荧光强度变化率随通入气体体积的变化曲线，得到曲线二；两条曲线中的荧光变化率相同时，分别得到曲线一中对应的时间t和曲线二中对应的通入气体的体积v；所述体积v中含有二氧化碳气体的体积即为癌细胞在时间t内自身新陈代谢产生的CO2的体积；
待测样品1中癌细胞荧光强度变化率＝(Ii-I0)/I0，I0表示癌细胞的初始荧光强度，Ii表示第i次检测时癌细胞的荧光强度，i为1～9的正整数；
测样品2中失活细胞荧光强度变化率＝(I′k-I′0)/I′0，I′0表示失活细胞的初始荧光强度，I′k表示第k次通入气体后失活细胞的荧光强度，k为1～40的正整数；
其中，步骤(1)所述TPP-DMAE为4,4',4″-(1H-吡咯-1,2,5-三基)三苯甲酸(2-二甲氨基)乙酯的简写，TPP-DMAE的结构式如下：
步骤(2)所述癌细胞优选子宫颈癌细胞(Hela cell)和乳腺癌细胞(MCF-7cell)；所述培养皿为激光共聚焦显微镜(confocal)专用培养皿；
培养参数优选温度为37℃，CO2体积含量为5％；
洗涤优选采用pH＝7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)，洗涤次数优选三次；
溶液b的体积优选0.1-1.0mL；
固定剂添加量优选1mL；缓冲液优选pH＝7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)；
步骤(3)所述成像情况和荧光强度均优选采用激光共聚焦显微镜；
气体优选CO2和CO2与空气体积比为1:1的混合气体中的一种；
待测样品2与每次通入的气体的体积比为1000:1；
有益效果：
(1)本发明所述方法采用荧光探针对Hela cell、MCF-7cell代谢产生的二氧化碳具有特异性荧光响应；可定量检测癌细胞新陈代谢产生的二氧化碳的含量；
(2)本发明所述方法采用荧光探针对于二氧化碳有特异性的荧光响应，可对癌细胞(人子宫颈癌细胞(Hela cell)和人乳腺癌细胞(MCF-7cell))进行细胞成像，荧光探针进入细胞迅速，能立刻在细胞内观察到荧光探针，而在细胞外无明显现象，有立竿见影的细胞成像效果；
(3)本发明所述方法采用荧光探针Hela cell、MCF-7cell代谢产生的二氧化碳荧光响应不同，说明两种癌细胞代谢产生二氧化碳量不同，可用于比较两种癌细胞代谢过程，并实现对癌细胞的类型进行甄别。
附图说明
图1为实施例1中荧光试剂分别对Hela cell、MCF-7cell在5h的细胞毒性测试；
图2为实施例1中荧光试剂分别对失活Hela cell、MCF-7cell在0h、0.5h、1h、1.5h、2h和2.5h荧光强度变化率随时间的变化；
图3为实施例1中荧光试剂分别对活Hela cell、MCF-7cell在0h、1h、2h、3h、4h和5h自身新陈代谢产生二氧化碳导致荧光强度变化率随时间变化的曲线；
图4为实施例1中荧光试剂分别对失活Hela cell、MCF-7cell通入纯二氧化碳后，荧光强度变化率随通入纯二氧化碳体积变化的曲线；
图5为实施例2中荧光试剂分别对失活Hela cell、MCF-7cell通入二氧化碳与空气体积比为1:1的混合气体后，荧光强度变化率随通入混合气体体积的变化图；
图6为实施例2中根据失活Hela cell通入二氧化碳与空气体积比为1:1的混合气体后荧光强度变化率随通入混合气体体积变化与活性Hela cell在0h、1h、2h、3h、4h和5h自身新陈代谢产生二氧化碳导致荧光强度变化率随时间的变化，计算出单个Hela cell每小时自身新陈代谢排出CO2体积；
图7为实施例2中根据失活MCF-7cell通入二氧化碳与空气体积比为1:1的混合气体后荧光强度变化率随通入混合气体体积变化与活性MCF-7cell在0h、1h、2h、3h、4h和5h自身新陈代谢产生二氧化碳导致荧光强度随时间的变化，计算出单个MCF-7cell每小时自身新陈代谢排出CO2体积；
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例来详述本发明，但不限于此。
以下实施例中提到的主要试剂信息见表1；主要仪器与设备信息见表2。
表1
实施例1
(1)将0.64mg TPP-DMAE溶解于的0.01mL二甲基亚砜(DMSO)中，得到浓度为1×10-2mol/L的溶液a；向溶液a中加入10mL高糖DMEM培养基，得到浓度为1×10-5mol/L的溶液b。
(2)①为了检测TPP-DMAE在测试时间范围内是否会导致Hela cell和MCF-7cell失活，做了如下毒性测试实验：
分别将子宫颈癌细胞(Hela cell)和乳腺癌细胞(MCF-7cell)传代至两个激光共聚焦显微镜(confocal)专用培养皿中；将已铺满培养皿底部80～90％的Hela cell、MCF-7cell用0.05％的胰蛋白酶消化变圆至50～60％的细胞脱离培养皿底部，向Hela cell、MCF-7cell的培养皿中各加入3mL高糖DMEM培养基终止消化，再分别将Hela cell、MCF-7cell悬液从培养皿中转移至两支15mL离心管中，各补加7mL高糖DMEM培养基，将两支离心管至于离心机中转速为1000rpm离心5min，去除上清液；再向两支离心管中各加入1mL高糖DMEM培养基，并将离心管底部的细胞分别混合均匀，分别加入49mL高糖DMEM培养基稀释至50mL细胞悬液，其中含细胞约2.5×106个。再将Hela cell、MCF-7cell悬液用移液枪分别注入96孔细胞培养板中，每孔加入100μL细胞悬液，其中约含5×103个细胞，另在96孔板中加入100μL无细胞的高糖DMEM培养基作为空白对照组。将96孔细胞培养板置于温度为37℃、CO2体积含量为5％的培养箱中培养24h。再向每个有细胞的孔内各加入100μL步骤(1)所述溶液b，有4个平行孔。另外空白对照组的孔内各补加100μL高糖DMEM培养基。将96孔细胞培养板继续置于温度为37℃、CO2体积含量为5％的培养箱中培养1h后，向两种活细胞的96孔细胞培养板每孔内加入20μL细胞增殖与毒性检测试剂MTS(MTS为3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium的简称)，继续置于温度为37℃、CO2含量5％的培养箱中培养4h后用酶联检测仪在492nm处检测各孔的光吸收值(OD)，根据OD值算出5h溶液对两种细胞增殖的抑制率如图1所示，可知TPP-DMAE对Hela cell、MCF-7cell在测试时间范围内的毒性很小，不会导致癌细胞死亡。
②分别将子宫颈癌细胞(Hela cell)和乳腺癌细胞(MCF-7cell)传代至两个激光共聚焦显微镜(confocal)专用培养皿中；将装有癌细胞的培养皿置于温度为37℃，CO2体积含量为5％的培养箱中培养24h，用pH＝7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤三次，向培养皿中依次加入0.5mL的溶液b和0.5mL高糖DMEM培养基，得到待测样品1；将待测样品1置于培养箱中培养5min，吸出液体，用pH＝7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤三次，向培养皿中加入1mL质量百分比为4％的多聚甲醛溶液，静置5min，用pH＝7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤三次，加入1mL pH＝7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)，得到含有失活细胞的待测样品2。
(3)①为了检测TPP-DMAE在细胞成像中的光学稳定性，做了如下实验：
每间隔0.5h用激光共聚焦显微镜观察待测样品2中失活细胞的成像情况，共测试6次。绘制时间-待测样品2中失活细胞的荧光强度曲线如图2所示，从图中可知，随着时间的延长，待测样品2中失活细胞荧光强度基本不变，说明了TPP-DMAE在细胞成像中具有一定的光学稳定性。
②首先用激光共聚焦显微镜观察待测样品1中癌细胞和待测样品2中失活细胞的成像情况；再用激光共聚焦显微镜测试待测样品1中癌细胞和待测样品2中失活细胞的荧光强度；测试待测样品1中癌细胞的荧光强度的测试方法为每间隔1h测试一次，共测试6次；待测样品2中失活细胞的荧光强度的测试方法为：测试待测样品2中失活细胞的初始荧光强度；随后每次向待测样品2中通入1μL二氧化碳气体，并测试待测样品2中失活细胞的荧光强度，共通入20次二氧化碳气体。
(4)根据步骤(3)测试结果绘制时间-待测样品1中癌细胞的荧光强度曲线如图3所示，从图中可知，随着时间的延长，两种活细胞所产生的二氧化碳量增加，TPP-DMAE的荧光强度变化率降低越明显。子宫颈癌细胞(Hela cell)和乳腺癌细胞(MCF-7cell)的荧光强度变化率随时间的变化均呈现一定的线性关系，Hela cell：(Ii-I0)/I0＝-0.16015×t+0.00752，R2＝0.99767；MCF-7cell：((Ii-I0)/I0＝-0.13495×t-0.014，R2＝0.99758。绘制待测样品2中通入二氧化碳体积-待测样品2中失活细胞荧光强度如图4所示，两种失活细胞外界通入纯二氧化碳后荧光强度的变化与通入二氧化碳含量在一定范围内有一定线性关系：Hela cell：在0-5μL范围内荧光强度变化与二氧化碳通入量呈现一定的线性关系:((Ii-I0)/I0＝-0.11005×[CO2]-0.0154，R′2＝0.99688；MCF-7cell：在0-9μL范围内荧光强度变化率与二氧化碳通入量呈现一定的线性关系：(I′k-I′0)/I′0＝-0.03786×[CO2]-0.02803，R′2＝0.98231，[CO2]为向待测样品2中通入二氧化碳的体积，R与R′均代表线性相关度；其中，i为1～5的正整数，k为1～20的正整数。
通过对比待测样品1中Hela cell自身新陈代谢产生CO2导致荧光强度变化率随时间的变化与待测样品2中失活Hela cell通入CO2气体后的荧光强度变化率随通入气体体积的变化，得到待测样品1中Hela cell自身新陈代谢产生CO2导致荧光强度变化率与待测样品2中失活Hela cell通入气体后的荧光强度变化率相同时分别对应的时间t以及通入气体的体积v；所述体积v即为Hela cell在时间t内自身新陈代谢产生的CO2的体积；
通过对比待测样品1中MCF-7cell自身新陈代谢产生CO2导致荧光强度变化率随时间的变化与待测样品2中失活MCF-7cell通入CO2气体后的荧光强度变化率随通入气体体积的变化，得到待测样品1中MCF-7cell自身新陈代谢产生CO2导致荧光强度变化率与待测样品2中失活MCF-7cell通入气体后的荧光强度变化率相同时分别对应的时间t以及通入气体的体积v；所述体积v即为MCF-7cell在时间t内自身新陈代谢产生的CO2的体积；
待测样品1和待测样品2中用血球计数板计数，Hela cell和MCF-7cell的个数均为2×105个，根据待测样品1中癌细胞荧光强度变化率随时间的变化与待测样品2中失活细胞荧光强度变化率随通入二氧化碳的体积的变化，计算出单个Hela cell和MCF-7cell每小时自身新陈代谢排出CO2体积分别为：7.5×10-6μL/h、1.75×10-5μL/h。
实施例2
(1)将0.64mgTPP-DMAE溶解于的0.01mL二甲基亚砜(DMSO)中，得到浓度为1×10-2mol/L的溶液a；向溶液a中加入10mL高糖DMEM培养基，得到浓度为1×10-5mol/L的溶液b。
(2)①为了检测TPP-DMAE在测试时间范围内是否会导致Hela cell和MCF-7cell失活，做了如下毒性测试实验：
分别将子宫颈癌细胞(Hela cell)和乳腺癌细胞(MCF-7cell)传代至两个激光共聚焦显微镜(confocal)专用培养皿中；将已铺满培养皿底部80～90％的Hela cell、MCF-7cell用0.05％的胰蛋白酶消化变圆至50～60％的细胞脱离培养皿底部，向Hela cell、MCF-7cell的培养皿中各加入3mL高糖DMEM培养基终止消化，再分别将Hela cell、MCF-7cell悬液从培养皿中转移至两支15mL离心管中，各补加7mL高糖DMEM培养基，将两支离心管至于离心机中转速为1000rpm离心5min，去除上清液；再向两支离心管中各加入1mL高糖DMEM培养基，并将离心管底部的细胞分别混合均匀，分别加入49mL高糖DMEM培养基稀释至50mL细胞悬液，其中含细胞约2.5×106个。再将Hela cell、MCF-7cell悬液用移液枪分别注入96孔细胞培养板中，每孔加入100μL细胞悬液，其中约含5×103个细胞，另在96孔板中加入100μL无细胞的高糖DMEM培养基作为空白对照组。将96孔细胞培养板置于温度为37℃、CO2体积含量为5％的培养箱中培养24h。再向每个有细胞的孔内各加入100μL步骤(1)所述溶液b，有4个平行孔。另外空白对照组的孔内各补加100μL高糖DMEM培养基。将96孔细胞培养板继续置于温度为37℃、CO2体积含量为5％的培养箱中培养1h后，向两种活细胞的96孔细胞培养板每孔内加入20μL细胞增殖与毒性检测试剂MTS(MTS为3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium的简称)，继续置于温度为37℃、CO2含量5％的培养箱中培养4h后用酶联检测仪在492nm处检测各孔的光吸收值(OD)，根据OD值算出5h溶液对两种细胞增殖的抑制率，由荧光试剂分别对Hela cell、MCF-7cell在5h的细胞毒性测试图可知TPP-DMAE对Hela cell、MCF-7cell在测试时间范围内的毒性很小，不会导致癌细胞死亡。
②分别将子宫颈癌细胞(Hela cell)和乳腺癌细胞(MCF-7cell)传代至两个激光共聚焦显微镜(confocal)专用培养皿中；将装有癌细胞的培养皿置于温度为37℃，CO2体积含量为5％的培养箱中培养20h，用pH＝7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤三次，向培养皿中依次加入0.1mL的溶液b和0.5mL高糖DMEM培养基，得到待测样品1；将待测样品1置于培养箱中培养10min，吸出液体，洗涤，向培养皿中加入1mL4％的多聚甲醛溶液，静置10min，用pH＝7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤三次，加入1mLpH＝7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)，得到含有失活细胞的待测样品2。
(3)①为了检测TPP-DMAE在细胞成像中的光学稳定性，做了如下实验：
每间隔0.5h用激光共聚焦显微镜观察待测样品2中失活细胞的成像情况，共测试6次。由荧光试剂分别对失活Hela cell、MCF-7cell在0h、0.5h、1h、1.5h、2h和2.5h荧光强度变化率随时间的变化曲线可知，随着时间的延长，待测样品2中失活细胞荧光强度基本不变，说明了TPP-DMAE在细胞成像中具有一定的光学稳定性。
②首先用激光共聚焦显微镜观察待测样品1中癌细胞和待测样品2中失活细胞的成像情况；再用激光共聚焦显微镜测试待测样品1中癌细胞和待测样品2中失活细胞的荧光强度；测试待测样品1中癌细胞的荧光强度的测试方法为每间隔1h测试一次，共测试6次；待测样品2中失活细胞的荧光强度的测试方法为：测试待测样品2中失活细胞的初始荧光强度；随后每次向待测样品2中通入1μL二氧化碳与空气体积比为1:1的混合气体，并测试待测样品2中失活细胞的荧光强度，共通入20次二氧化碳与空气体积比为1:1的混合气体。由荧光试剂分别对活Hela cell、MCF-7cell在0h、1h、2h、3h、4h和5h自身新陈代谢产生二氧化碳导致荧光强度随时间的变化曲线可知，随着时间的延长，两种活细胞所产生的二氧化碳量增加，待测样品1中癌细胞的荧光降低越明显。
(4)根据步骤(3)测试结果绘制待测样品2中通入二氧化碳与空气体积比为1:1的混合气体的体积-待测样品2中失活细胞荧光强度如图5所示，两种失活细胞通入二氧化碳与空气体积比为1:1的混合气体后荧光强度的变化与通入二氧化碳与空气体积比为1:1的混合气体的含量在0～20μL范围内有一定线性关系：Hela cell：(I′k-I′0)/I′0＝-0.0159×V-0.0106，R′2＝0.9953；MCF-7cell：(I′k-I′0)/I′0＝-0.0071×V-0.0049，R′2＝0.9963，其中，V为向待测样品2中通入二氧化碳与空气体积比为1:1的混合气体的体积。
通过对比待测样品1中Hela cell自身新陈代谢产生CO2导致荧光强度变化率随时间的变化与待测样品2中失活Hela cell通入二氧化碳与空气体积比为1:1的混合气体后的荧光强度变化率随通入气体体积的变化，得到待测样品1中Helacell自身新陈代谢产生CO2导致荧光强度变化率与待测样品2中失活Hela cell通入气体后的荧光强度变化率相同时分别对应的时间t以及通入气体的体积v(如图6)；所述体积v中含有二氧化碳气体的体积即为Hela cell在时间t内自身新陈代谢产生的CO2；
通过对比待测样品1中MCF-7cell自身新陈代谢产生CO2导致荧光强度变化率随时间的变化与待测样品2中失活MCF-7cell通入二氧化碳与空气体积比为1:1的混合气体后的荧光强度变化率随通入气体体积的变化，得到待测样品1中MCF-7cell自身新陈代谢产生CO2导致荧光强度变化率与待测样品2中失活MCF-7cell通入气体后的荧光强度变化率相同时分别对应的时间t以及通入气体的体积v(如图7)；所述体积v中含有二氧化碳气体的体积即为MCF-7cell在时间t内自身新陈代谢产生的CO2的体积；
待测样品1和待测样品2中用血球计数板计数，Hela cell和MCF-7cell的个数均为5×105个，根据待测样品1中癌细胞荧光强度变化率随时间的变化与待测样品2中失活细胞荧光强度变化率随通入二氧化碳与空气体积比为1:1的混合气体的体积的变化，计算出单个Hela cell和MCF-7cell每小时自身新陈代谢排出CO2体积分别为：9.2×10-6μL/h、2.2×10-5μL/h。
实施例3
(1)将0.64mg TPP-DMAE溶解于的0.01mL二甲基亚砜(DMSO)中，得到浓度为1×10-2mol/L的溶液a；向溶液a中加入10mL高糖DMEM培养基，得到浓度为1×10-5mol/L的溶液b。
(2)①为了检测TPP-DMAE在测试时间范围内是否会导致Hela cell和MCF-7cell失活，做了如下毒性测试实验：
分别将子宫颈癌细胞(Hela cell)和乳腺癌细胞(MCF-7cell)传代至两个激光共聚焦显微镜(confocal)专用培养皿中；将已铺满培养皿底部80～90％的Hela cell、MCF-7cell用0.05％的胰蛋白酶消化变圆至50～60％的细胞脱离培养皿底部，向Hela cell、MCF-7cell的培养皿中各加入3mL高糖DMEM培养基终止消化，再分别将Hela cell、MCF-7cell悬液从培养皿中转移至两支15mL离心管中，各补加7mL高糖DMEM培养基，将两支离心管至于离心机中转速为1000rpm离心5min，去除上清液；再向两支离心管中各加入1mL高糖DMEM培养基，并将离心管底部的细胞分别混合均匀，分别加入49mL高糖DMEM培养基稀释至50mL细胞悬液，其中含细胞约2.5×106个。再将Hela cell、MCF-7cell悬液用移液枪分别注入96孔细胞培养板中，每孔加入100μL细胞悬液，其中约含5×103个细胞，另在96孔板中加入100μL无细胞的高糖DMEM培养基作为空白对照组。将96孔细胞培养板置于温度为37℃、CO2体积含量为5％的培养箱中培养24h。再向每个有细胞的孔内各加入100μL步骤(1)所述溶液b，有4个平行孔。另外空白对照组的孔内各补加100μL高糖DMEM培养基。将96孔细胞培养板继续置于温度为37℃、CO2体积含量为5％的培养箱中培养1h后，向两种活细胞的96孔细胞培养板每孔内加入20μL细胞增殖与毒性检测试剂MTS(MTS为3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium的简称)，继续置于温度为37℃、CO2含量5％的培养箱中培养4h后用酶联检测仪在492nm处检测各孔的光吸收值(OD)，根据OD值算出5h溶液对两种细胞增殖的抑制率，由荧光试剂分别对Hela cell、MCF-7cell在5h的细胞毒性测试图可知TPP-DMAE对Hela cell、MCF-7cell在测试时间范围内的毒性很小，不会导致癌细胞死亡。
②分别将子宫颈癌细胞(Hela cell)和乳腺癌细胞(MCF-7cell)传代至两个激光共聚焦显微镜(confocal)专用培养皿中；将装有癌细胞的培养皿置于温度为37℃，CO2体积含量为5％的培养箱中培养22h，用pH＝7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤三次，向培养皿中依次加入1.0mL的溶液b和0.5mL高糖DMEM培养基，得到待测样品1；将待测样品1置于培养箱中培养8min，吸出液体，洗涤，向培养皿中加入1mL4％的多聚甲醛溶液，静置8min，用pH＝7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤三次，加入1mL pH＝7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)，得到含有失活细胞的待测样品2。
(3)①为了检测TPP-DMAE在细胞成像中的光学稳定性，做了如下实验：
每间隔0.5h用激光共聚焦显微镜观察待测样品2中失活细胞的成像情况，共测试6次。由荧光试剂分别对失活Hela cell、MCF-7cell在0h、0.5h、1h、1.5h、2h和2.5h荧光强度变化率随时间的变化曲线可知，随着时间的延长，待测样品2中失活细胞荧光强度基本不变，说明了TPP-DMAE在细胞成像中具有一定的光学稳定性。
②首先用激光共聚焦显微镜观察待测样品1中癌细胞和待测样品2中失活细胞的成像情况；再用激光共聚焦显微镜测试待测样品1中癌细胞和待测样品2中失活细胞的荧光强度；测试待测样品1中癌细胞的荧光强度的测试方法为每间隔1h测试一次，共测试6次；待测样品2中失活细胞的荧光强度的测试方法为：测试待测样品2中失活细胞的初始荧光强度；随后每次向待测样品2中通入1μL二氧化碳与空气体积比为1:1的混合气体，并测试待测样品2中失活细胞的荧光强度，共通入20次二氧化碳与空气体积比为1:1的混合气体。
(4)根据步骤(3)的测试结果绘制相应曲线，由荧光试剂分别对活Hela cell、MCF-7cell在0h、1h、2h、3h、4h和5h自身新陈代谢产生二氧化碳导致荧光强度随时间的变化曲线可知，随着时间的延长，两种活细胞所产生的二氧化碳量增加，TPP-DMAE的荧光降低越明显。由荧光试剂分别对失活Hela cell、MCF-7cell通入纯二氧化碳后，荧光强度变化率随通入纯二氧化碳体积的变化曲线可知，待测样品2中两种失活细胞通入纯二氧化碳后荧光强度的变化与通入二氧化碳的体积在一定范围内呈现一定线性关系。
通过对比待测样品1中Hela cell自身新陈代谢产生CO2导致荧光强度变化率随时间的变化与待测样品2中失活Hela cell通入二氧化碳与空气体积比为1:1的混合气体后的荧光强度变化率随通入气体体积的变化，得到待测样品1中Helacell自身新陈代谢产生CO2导致荧光强度变化率与待测样品2中失活Hela cell通入气体后的荧光强度变化率相同时分别对应的时间t以及通入气体的体积v；所述体积v中含有二氧化碳气体的体积即为Hela cell在时间t内自身新陈代谢产生的CO2的体积；
通过对比待测样品1中MCF-7cell自身新陈代谢产生CO2导致荧光强度变化率随时间的变化与待测样品2中失活MCF-7cell通入二氧化碳与空气体积比为1:1的混合气体后的荧光强度变化率随通入气体体积的变化，得到待测样品1中MCF-7cell自身新陈代谢产生CO2导致荧光强度变化率与待测样品2中失活MCF-7cell通入气体后的荧光强度变化率相同时分别对应的时间t以及通入气体的体积v；所述体积v中含有二氧化碳气体的体积即为MCF-7cell在时间t内自身新陈代谢产生的CO2的体积；
待测样品1和待测样品2中用血球计数板计数，Hela cell和MCF-7cell的个数均为5.2×105个，根据待测样品1中癌细胞荧光强度变化率随时间的变化与待测样品2中失活细胞荧光强度变化率随通入二氧化碳与空气体积比为1:1的混合气体的体积的变化，计算出单个Hela cell和MCF-7cell每小时自身新陈代谢排出CO2体积分别为：8.8×10-6μL/h、2.1×10-5μL/h。
本发明包括但不限于以上实施例，凡是在本发明精神的原则之下进行的任何等同替换或局部改进，都将视为在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种定量检测癌细胞呼出二氧化碳含量的方法，其特征在于：所述方法具体步骤如下：
(1)将TPP-DMAE溶解于二甲基亚砜中，得到浓度为1×10-2mol/L的溶液a；向溶液a中加入DMEM培养基，得到TPP-DMAE的浓度为1×10-5mol/L的溶液b；
其中，TPP-DMAE为4,4',4″-(1H-吡咯-1,2,5-三基)三苯甲酸(2-二甲氨基)乙酯的简写，TPP-DMAE的结构式如下：
(2)将癌细胞传代至培养皿中；将装有癌细胞的培养皿置于培养箱中培养20～24h，洗涤，向培养皿中依次加入相同体积的溶液b和DMEM培养基，得到待测样品1；将待测样品1置于培养箱中培养5～10min，吸出液体，洗涤，向培养皿中加入固定剂，静置5～10min，洗涤，加入缓冲液，得到含有失活细胞的待测样品2；
(3)测试待测样品1中癌细胞和待测样品2中失活细胞的荧光强度；
其中，测试待测样品1中癌细胞的荧光强度的测试方法为每间隔1h测试一次，共测试6～10次，其中，第一次的测试结果记为癌细胞的初始荧光强度；
待测样品2中失活细胞的荧光强度的测试方法为：首先，测试待测样品2中失活细胞的初始荧光强度；随后向待测样品2中通入CO2气体，或CO2与空气体积比为1:1的混合气体，测试通入气体后待测样品2中失活细胞的荧光强度，共通入气体20～40次，每次气体的通入量相等；
(4)根据步骤(3)待测样品1中癌细胞和待测样品2中失活细胞的荧光强度的测试结果计算癌细胞产生的CO2含量，具体为：
首先，根据测试结果绘制待测样品1中癌细胞荧光强度变化率随时间t的变化曲线，得到曲线一；绘制待测样品2中失活细胞通入气体后的荧光强度变化率随通入气体体积的变化曲线，得到曲线二；两条曲线中的荧光强度变化率相同时，分别得到曲线一中对应的时间t和曲线二中对应的通入气体的体积v；所述体积v中含有二氧化碳气体的体积即为癌细胞在时间t内自身新陈代谢产生的CO2的体积。
2.根据权利要求1所述的一种定量检测癌细胞呼出二氧化碳含量的方法，其特征在于：步骤(1)所述DMEM培养基为高糖DMEM培养基。
3.根据权利要求1所述的一种定量检测癌细胞呼出二氧化碳含量的方法，其特征在于：步骤(2)所述癌细胞为子宫颈癌细胞、乳腺癌细胞中的一种；所述培养皿为激光共聚焦显微镜用培养皿；所述培养参数为温度37℃，CO2体积含量5％。
4.根据权利要求1所述的一种定量检测癌细胞呼出二氧化碳含量的方法，其特征在于：步骤(2)所述洗涤采用pH＝7.4的磷酸盐缓冲液，洗涤次数为三次。
5.根据权利要求1所述的一种定量检测癌细胞呼出二氧化碳含量的方法，其特征在于：步骤(2)所述溶液b的体积为0.1-1.0mL；固定剂为质量百分比为4％的多聚甲醛溶液，固定剂的添加量为1mL；缓冲液为pH＝7.4的磷酸盐缓冲液。
6.根据权利要求1所述的一种定量检测癌细胞呼出二氧化碳含量的方法，其特征在于：步骤(3)所述荧光强度的测试采用激光共聚焦显微镜。
7.根据权利要求1所述的一种定量检测癌细胞呼出二氧化碳含量的方法，其特征在于：步骤(3)所述待测样品2与每次通入的气体的体积比为1000:1。
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