CN104313025A - 抑制中枢神经系统损伤后胶质疤痕形成的siRNA及其重组载体与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，本发明提供了一种可以抑制中枢神经系统损伤后胶质疤痕形成的特异性相关基因表达的干扰序列及其重组载体，以及在制备治疗胶质疤痕形成中的应用。本发明的干扰序列及其重组载体，通过体内、体外实验结果证明：可以抑制EphB2过度表达，尤其是脑(脊)膜成纤维细胞的EphB2过度表达，从而抑制中枢神经系统损伤后的胶质疤痕形成。因此本发明为临床治疗中枢神经系统损伤后胶质疤痕过度形成的药物治疗方案。

Description

抑制中枢神经系统损伤后胶质疤痕形成的siRNA及其重组载体与应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种可以抑制中枢神经系统损伤后胶质疤痕形成的特异性相关基因表达的干扰序列及其重组载体，以及在制备治疗胶质疤痕形成中的应用。

背景技术

当中枢神经系统出现损伤后，会引起一系列原发性和继发性的病理改变，其中星形胶质细胞尤为明显，它会形成三种不同的界面：神经胶质的界面、神经胶质与中胚层的界面、神经胶质与神经元的界面。而神经胶质与中胚层的界面是星形胶质细胞与脑(脊)膜成纤维细胞之间形成的疤痕组织，它虽然能对因损伤而导致中枢神经系统形成的开放创面被及时封闭，但同时也因为此界面的出现而关闭了轴突生长的通道，起到不利于轴突再生的作用(Li Y,Li D,Ibrahim A,Raisman G.Repair involves all three surfaces of the glial cell.Prog BrainRes.2012；201:199-218.)。正是它及其它一些不利因素协同作用致使损伤的中枢神经系统难以组织修复和功能重建，而造成患者终生残疾，给个人、家庭及整个社会带来沉重的经济和精神负担。

因此，寻求在中枢神经系统损伤后，胶质疤痕中星形胶质细胞与脑(脊)膜细胞的结构重排，以致形成神经胶质与神经元的界面来替代神经胶质与中胚层的界面，这也许为轴突的再生能提供必要的通道。为了要达到这一目的，首先必需了解在形成神经胶质与中胚层的界面中，各种细胞的互相作用，以找到阻断这一界面形成的有效方法。星形胶质细胞和成纤维细胞分别表达ephrin-B2配体和EphB2受体。这对受体与配体是Eph受体酪氨酸激酶家族和它们的配体ephrin中的成员之一，都是膜结合分子。Eph家族蛋白在神经系统中的功能较为显著，包括：在神经系统发育的各个方面以及成熟神经系统的可塑性调节中的作用；两系列成员在成熟哺乳类动物的神经系统内也广泛表达，并被证明参与中枢神经系统损伤时的反应。在脊髓中EphB2和ephrin-B2主要表达于成纤维细胞和星形胶质细胞上，脊髓损伤后也仅在这两种细胞中表达上调(Goldshmit Y,McLenachan S,Turnley A.Roles of Eph receptors and ephrins in the normal anddamaged adult CNS.Brain Res Rev,2006；52:327-345)。研究发现：当脊髓损伤2天时，脑(脊)膜成纤维细胞和星形胶质细胞的EphB2受体与ephrin-B2配体表达开始上调；成纤维细胞迁移侵入到损伤处，并和增殖的星形胶质细胞借这对受体和配体互相特异性结合；EphB2和ephrin-B2活化(磷酸化)，在两种细胞中产生双向信号传导，使两种细胞在损伤边缘混杂并形成含有致密细胞及突起交织的密集区域。然后，两种细胞再在接触处分成两个细胞带，并在交界处由细胞产生细胞外基质和构成基底膜，其中含硫酸软骨素蛋白聚糖等物质。到14天时，在损伤边缘处形成由星形胶质细胞整齐密集排列并被成纤维细胞紧密包裹的胶质疤痕。当然，在胶质疤痕形成中，还有许多其它物质参与其中(BundesenLQ,Scheel TA,Bregman BS,et al.Ephrin-B2 and EphB2 regulation ofastrocyte-meningeal fibroblast interactions in response to spinal cord lesions in adultrats.J Neurosci,2003；23:7789-800)。但大量的证据表明：在脊髓损伤后，成纤维细胞和星形胶质细胞的EphB2和ephrin-B2表达上调及特异性结合，是触发两种细胞协同作用开始形成胶质疤痕的最初几个关键步骤(Silver J,Miller JH.Regeneration beyond the glial scar.Nat Rev Neurosci,2004；5:146–156；Scicolone G,Ortalli AL,Carri NG.Key roles of Ephs and ephrins in retinotectal topographic mapformation.Brain Res Bull,2009；79:227-247)。

而目前能使基因表达沉默，将来又可能应用到体内的有效方法，是RNA干扰(RNAi)技术(Pecot CV,Calin GA,Coleman RL,et al.RNA interference in theclinic:challenges and future directions.Nat Rev Cancer,2011；11:59-67)。

但目前就中枢神经系统中采用RNAi技术直接干扰Eph或ephrin基因的表达，抑制胶质疤痕形成，还未见到报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抑制脑(脊)膜成纤维细胞EphB2的基因表达干扰序列，并构建含有抑制脑(脊)膜成纤维细胞EphB2的基因表达干扰序列的重组载体；本发明的另一目的是提供该siRNA和重组载体在制备治疗中枢神经系统损伤后胶质疤痕形成的药物中的应用。

本发明人设想，是否可以通过针对中枢神经系统损伤后成纤维细胞和星形胶质细胞最初反应之一是EphB2和ephrin-B2表达上调的特点，设法抑制其表达上调，使两种细胞不能彼此借EphB2和ephrin-B2特异结合，更不能磷酸化和双向信号传导，从而达到在早期消除胶质疤痕形成的目的。

根据这一设想，本发明人认为选择阻断成纤维细胞和星形胶质细胞EphB2或ephrin-B2的表达上调，可能是抑制胶质疤痕形成之初的一个最诱人靶点。使其表达不能上调以达到相应功能改变，本发明人选择通过RNAi技术直接干扰Eph或ephrin基因的表达，由于中枢神经系统中EphB2和ephrin-B2主要存在于成纤维细胞和星形胶质细胞上，在损伤时也仅在这两种细胞中表达上调；所以对它们干扰，理论上讲也仅能影响这两种细胞围绕EphB2和ephrin-B2之间的相关功能。

因此，通过siRNA干扰EphB2的基因表达，在中枢神经系统损伤之初使损伤处的脑(脊)膜成纤维细胞EphB2基因表达不能上调，从而阻止成纤维细胞和星形胶质细胞借EphB2受体和ephrin-B2配体结合形成胶质疤痕的过程，同时再结合其它促进神经再生的能力，这也许会较大幅度地提高损伤中枢神经系统修复的效果。

本发明的第一方面，是寻找能抑制脑(脊)膜成纤维细胞EphB2的基因表达干扰序列。

本发明人通过大量前期工作进一步证实：在脊髓损伤后，成纤维细胞和星形胶质细胞的EphB2和ephrin-B2表达上调及特异性结合，并触发两种细胞协同作用开始形成胶质疤痕。

本发明基于对EphB2基因(GenBank No.NM_001127319)的序列分析，设计、合成的针对EphB2片段的siRNA，能够抑制脑(脊)膜成纤维细胞EphB2基因表达。

本发明提供了一种抑制中枢神经系统损伤后胶质疤痕形成的siRNA作用的靶点序列为CCAAGAGCACACCTGTCAT(SEQ ID NO:3)。

该靶点序列即实施例中干扰效果最佳的Ephb2-RNAi(9015-1)。

进一步地，本发明提供了一种抑制中枢神经系统损伤后胶质疤痕形成的shRNA，

正义链序列为：

5’-tcaCCAAGAGCACACCTGTCATctcgagATGACAGGTGTGCTCTTGGtgttttttc-3’(SEQ ID NO:9)；

反义链序列为：

5’-tcgagaaaaaacaCCAAGAGCACACCTGTCATctcgagATGACAGGTGTGCTCTTGGtga-3’(SEQ ID NO:10)。

本发明的第二方面，是构建一种含有上述抑制中枢神经系统损伤后胶质疤痕形成的干扰序列的重组载体。

所述的重组载体可采用慢病毒载体GV118等。

本发明的第三方面，提供了上述的siRNA靶点序列、shRNA和重组载体在制备治疗中枢神经系统损伤后胶质疤痕形成的药物中的应用。

体外实验中可采取脂质体介导法转染shRNA；体内实验中可采用直接注射复制缺陷慢病毒携带目的DNA至损伤部位等，本发明今后临床应用的给药方式可包括但不限于：直接裸DNA注射法、脂质体包裹DNA直接注射法、金包被DNA基因枪轰击法、繁殖缺陷细菌携带质粒DNA法、复制缺陷腺病毒携带目的DNA法、PEG修饰蛋白药物注射法、脂质体包裹蛋白静脉注射法、蛋白微球制剂皮下注射法等(Hickman MA,Malone RW,Lehmann-Bruinsma K，et al.Geneexpression following direct injection of DNA into liver.Hum Gene Ther.

1994；12:1477-1483；Patil SD,Rhodes DG,Burgess DJ.DNA-based therapeutics andDNA delivery systems:A comprehensive review.AAPS J.2005；7(1):61-77；

Boulikas T.Nuclear localization signal peptides for the import of plasmid DNA ingene therapy.Int J Oncol.1997；1:301-309)。

本发明将GV143作为过表达目的基因EphB2的工具载体，并选择合适的酶切位点：XhoI和BamHI，转染目的细胞293T，过表达EphB2蛋白。联合应用EphB2的siRNA重组载体和EphB2的真核过表达质粒，体外筛选出有效的RNAi靶点。

体内试验，进行RNAi有效载体慢病毒包装，建立脊髓撞击损伤动物模型后，于损伤局部注射以慢病毒为载体的针对EphB2的shRNA。最终发现能在体内抑制脑(脊)膜成纤维细胞的EphB2过度表达，减少星形胶质细胞及成纤维细胞聚集现象，这样达到明显抑制胶质疤痕的形成目的。

通过体内、体外实验结果证明：本发明的重组载体可以抑制EphB2过度表达，尤其是脑(脊)膜成纤维细胞的EphB2过度表达，从而抑制中枢神经系统损伤后的胶质疤痕形成。因此本发明提供的siRNA和重组载体为临床治疗中枢神经系统损伤后胶质疤痕过度形成的药物治疗方案。

附图说明

图1为RNAi慢病毒载体图谱；

图2为目的基因过表达载体图谱；

图3为pGC-LV载体图谱；

图4为目的质粒转染293T细胞EphB2表达情况，其中A为过表达组，B为对照组；

图5为目的质粒和RNAi慢病毒载体同步转染293T细胞EphB2表达情况；

图6为Western Blot结果，组别说明如下：

1.阳性，2.control，3.nc低，4.KD₁，5.KD₂，6.KD₃，7.KD₄，8.nc高，9.KD₁，10.KD₂，11.KD₃，12.KD₄。一抗：GFP，二抗：mouse。

control：不转染任何质粒的293T细胞组(空细胞组)

nc：共转染过表达质粒和阴性对照病毒载体质粒细胞组(阴性对照组)

KD：共转染过表达质粒和RNAi病毒载体质粒细胞组

KD 1～4：含有针对目的基因的不同干扰序列的RNAi病毒载体质粒对应的干扰载体流水号分别为Ephb2-RNAi(9013-1)、Ephb2-RNAi(9014-1)、Ephb2-RNAi(9015-1)、Ephb2-RNAi(9016-2)；

图7为2周后GFP荧光观测，其中假手术组(A)、单纯撞击伤组(B)、非特异性RNAi组(C)、特异性RNAi组(D)；

图8为RNAi后EphB2及ephrin-B2 mRNA表达量，其中A为EphB2 mRNA表达量，B为ephrin-B2 mRNA表达量，★表示与假手术组相比P＜0.05，◆表示与单纯撞击伤组相比P＜0.05，■表示与非特异性RNAi组相比P＜0.05；

图9为RNAi后EphB2及ephrin-B2蛋白表达量，其中A为EphB2蛋白表达量，B为ephrin-B2蛋白表达量，★表示与假手术组相比P＜0.05，◆表示与单纯撞击伤组相比P＜0.05■表示与非特异性RNAi组相比P＜0.05；

图10为RNAi后免疫荧光染色；其中A为假手术组EphB2的表达情况，B为单纯撞击伤组EphB2的表达情况，C为非特异性RNAi组EphB2的表达情况，D为特异性RNAi组EphB2的表达情况，E为假手术组ephrin-B2的表达情况，F为单纯撞击伤组ephrin-B2的表达情况，G为非特异性RNAi组ephrin-B2的表达情况，H为特异性RNAi组ephrin-B2的表达情况，I为假手术组GFAP的表达情况，J为单纯撞击伤组GFAP的表达情况，K为非特异性RNAi组GFAP的表达情况，L为特异性RNAi组GFAP的表达情况，N为假手术组FN的表达情况，M为单纯撞击伤组FN的表达情况，O为非特异性RNAi组FN的表达情况，P为特异性RNAi组FN的表达情况；

图11为RNAi后胶质疤痕中主要成分分布区域，其中假手术组(A)、单纯撞击伤组(B)、非特异性RNAi组(C)、特异性RNAi组(D)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细描述。但下列实施例不应看作对本发明范围的限制。

本发明用慢病毒载体GV118、GV143；慢病毒载体系统由pGC-LV载体、pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体三质粒组成。

实施例1：构建EphB2基因表达的干扰序列(siRNA)及表达载体

1.1设计、合成并筛选EphB2基因表达的特异性siRNA序列。

针对目的基因EphB2序列，利用公用网站中提供的RNA干扰序列设计原则，设计多个RNA干扰靶点序列，并利用设计软件进行预评估测定，选择4个最佳的动力学参数靶点进入后续实验流程，共合成4个干扰序列，见表1。

表1.siRNA靶点的设计

1.2设计、合成并筛选EphB2基因表达的特异性shRNA序列。

构建含有抑制脑(脊)膜成纤维细胞EphB2基因表达的干扰序列的重组载体，利用慢病毒载体GV118作为工具载体，并选择合适的酶切位点HpaI和XhoI，构建4个shRNA表达质粒(如图1所示)，shRNA见表2。

表2.shRNA设计

1.3对EphB2基因表达的特异性shRNA序列进行慢病毒包装。

慢病毒载体系统由pGC-LV载体、pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体三质粒组成。pGC-LV载体中含有HIV的基本元件5’LTR和3’LTR以及其他辅助元件，通常根据启动子活性、基因表达或RNA干扰等研究的不同实验目的对pGC-LV载体进行改造，如用RNA干扰的pGC-LV载体并带有GFP标记。pHelper 1.0载体中含有HIV病毒的gag基因，编码病毒主要的结构蛋白；pol基因，编码病毒特异性的酶；rev基因，编码调节gag和pol基因表达的调节因子。pHelper 2.0载体中含有单纯疱疹病毒来源的VSV-G基因，提供病毒包装所需要的包膜蛋白。(如图3所示)

制备编码慢病毒颗粒的重组病毒质粒及其两种辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，按Invitrogen公司Lipofectamine 2000使用说明进行共转染293T细胞，转染后8 h更换为完全培养基，培养48h后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液，在293T细胞中测定并标定病毒滴度。一般情况下慢病毒颗粒的适当滴度范围基本能满足大部分体内、外实验需求。

实施例2：体外细胞实验

2.1建立过表达EphB2基因的质粒，和上述RNAi表达载体共转染细胞，抑制该细胞的EphB2过表达。

将慢病毒载体GV143作为过表达EphB2的工具载体，并选择合适的酶切位点：XhoI和BamHI(如图2所示)，转染目的细胞293T，过表达EphB2蛋白。

结果如图4所示：经GV143转染目的细胞293T后，细胞明显过表达EphB2蛋白(通过同步表达的GFP可显示)

2.2 Western Blot外源筛选有效RNAi载体。

将构建好含有目的基因的表达克隆质粒和针对靶基因不同干扰靶点的RNAi病毒载体质粒，根据Invitrogen公司的lipofectamine 2000使用说明共转染培养好的工具细胞(即293T细胞)，转染24h荧光显微镜下观测转染效果，转染36h收集细胞抽提蛋白，采用Western blot检测目的蛋白EphB2的表达情况，进而判断不同靶点的干扰效果，筛选出有效的RNAi载体。

结果如图5所示：经转染培养的293T细胞，在转染24h后荧光显微镜下观测转染显示过表达的EphB2蛋白受到抑制。

结果如图6所示：经转染培养的293T细胞，在转染36h后Western blot结果可以看出，Ephb2-RNAi(9013-1)、Ephb2-RNAi(9014-1)、Ephb2-RNAi(9015-1)靶点对目的基因的表达有敲减作用，因而是有效靶点。

实施例3：体内模拟治疗实验

选择干扰效果最好的Ephb2-RNAi(9015-1)，委托生物公司合成shRNA，

正义链序列为：

5’-tcaCCAAGAGCACACCTGTCATctcgagATGACAGGTGTGCTCTTGGtgttttttc-3’，(SEQ ID NO:9)

反义链序列为：

5’-tcgagaaaaaacaCCAAGAGCACACCTGTCATctcgagATGACAGGTGTGCTCTTGGtga-3’，(SEQ ID NO:10)

进行慢病毒包装，病毒滴度为1.5×10⁹ TU/ml，用于脊髓损伤动物模型实验。

成年雌性Sprague-Dawley大鼠，体重200-220g，SPF级。共四组，分别为假手术组、单纯撞击伤组、非特异性RNAi组及特异性RNAi组，其中假手术组共6只，其余各组又分为2d、4d、7d、2w、3w、1M六个时间点，每个时间点6只大鼠。

[1]假手术组：仅打开椎板，不损伤脊髓。

[2]单纯撞击伤组：打开椎板后建立脊髓撞击伤模型(在脊髓打击器上对脊髓进行撞击，撞击力道为145千达因)，不注射任何液体。

[3]非特异性RNAi组：建立脊髓撞击伤模型(同前)后于损伤局部注射以慢病毒为载体的乱序的shRNA(注射部位为损伤正中头侧、尾侧各1.25mm处两个点，注射深度为1mm，注射速度为0.3μl/min，每个点注射1μl(病毒滴度为5×10⁷TU/ml)，每个点注射完成后留针10min)。

[4]特异性RNAi组:建立脊髓撞击伤模型(同前)后于损伤局部注射以慢病毒为载体的针对EphB2的shRNA(注射方法同前，病毒滴度为5×10⁷ TU/ml)。

体内实验结果：

1.慢病毒感染情况：各组动物经模型制备2w后荧光显微镜下观察损伤处GFP荧光情况。结果如图7所示：假手术组和单纯撞击伤组无GFP荧光，非特异性RNAi组和特异性RNAi组均有大量GFP荧光，说明非特异性RNAi组和特异性RNAi组大量细胞被慢病毒感染，shRNA成功进入细胞中，而假手术组和单纯撞击伤组细胞内无shRNA(图7)。

2.RNAi后EphB2及ephrin-B2 mRNA表达量：2w后通过RT-PCR技术对假手术组、单纯撞击伤组、非特异性RNAi组及特异性RNAi组的EphB2及ephrin-B2mRNA表达量进行相对定量，结果如图8所示：单纯撞击伤组、非特异性RNAi组及特异性RNAi组与假手术组相比EphB2及ephrin-B2 mRNA表达量均显著增多(P＜0.01)，但单纯撞击伤组与非特异性RNAi组EphB2及ephrin-B2 mRNA表达量差异无统计学意义(P＞0.05)。与单纯撞击伤组和非特异性RNAi组相比，特异性RNAi组EphB2 mRNA显著减少(P＜0.01)，但ephrin-B2 mRNA表达量无显著性差异(P＞0.05)(图8)。结果说明特异性针对EphB2 shRNA的应用能使EphB2mRNA水平上调被成功抑制。

3.RNAi后EphB2及ephrin-B2表达量(Western Blot)：2w后对假手术组、单纯撞击伤组、非特异性RNAi组及特异性RNAi组的EphB2及ephrin-B2表达量进行Westren blot定量分析，结果如图9所示：特异性RNAi组与单纯撞击伤组和非特异性RNAi组相比EphB2显著下降(P＜0.01)，但ephrin-B2差异无统计学意义(P＞0.05)。特异性RNAi组EphB2及ephrin-B2较假手术组仍增多(P＜0.01)(图9)。结果说明特异性针对EphB2 shRNA的应用能使EphB2蛋白水平上调被成功抑制。

4.RNAi后免疫荧光分析：2w后对各组进行免疫荧光单标，结果如图10所示：RNAi后EphB2显著下降，但ephrin-B2未见减少，星形胶质细胞和成纤维细胞数量也未见降低(图10)。虽然EphB2在RNAi后上调被抑制，但是其相应的配体ephrin-B2的表达却未有改变，由此可见，ephrin-B2表达量与EphB2之间没有必然的联系。当脊髓损伤累及脊膜时，脊膜上的成纤维细胞会浸润到损伤脊髓的深处，虽然RNAi抑制EphB2表达，但并不影响成纤维细胞的迁移；同样此干扰也不影响星形胶质细胞的激活和增殖。

5.RNAi后胶质疤痕形成情况：2w后通过观察胶质疤痕主要成分即硫酸软骨素蛋白聚糖形成情况推断胶质疤痕大小，结果如图11所示：NG2为硫酸软骨素蛋白聚糖中的一种，在损伤处边缘阳性范围作为反映胶质疤痕形成情况的一个重要的指标。2w后免疫荧光观察发现，RNAi后NG2显著下降，继而说明损伤处边缘胶质疤痕主要成分形成减少(图11)。

综上，本发明通过实验已充分证明了利用RNAi技术抑制脊髓损伤后EphB2的上调可以有效减少胶质疤痕的形成，从而为脊髓损伤的临床治疗提供新的思路，同时，该方法也可以供整个中枢神经系统损伤后的胶质疤痕的抑制所借鉴。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (8)

1.一种抑制中枢神经系统损伤后胶质疤痕形成的siRNA，其特征在于，所述的siRNA作用的靶点序列如SEQ ID NO:3所示。

2.一种抑制中枢神经系统损伤后胶质疤痕形成的shRNA，其特征在于，所述的shRNA的正义链序列如SEQ ID NO:9所示；

所述的shRNA的反义链序列如SEQ ID NO:10所示。

3.一种重组载体，其特征在于，含有如权利要求1所述的抑制中枢神经系统损伤后胶质疤痕形成的siRNA。

4.一种重组载体，其特征在于，含有如权利要求2所述的抑制中枢神经系统损伤后胶质疤痕形成的shRNA。

5.根据权利要求3或4所述的重组载体，其特征在于，该重组载体为慢病毒载体GV118。

6.一种如权利要求1所述的抑制中枢神经系统损伤后胶质疤痕形成的siRNA在制备治疗中枢神经系统损伤后胶质疤痕形成的药物中的应用。

7.一种如权利要求2所述的抑制中枢神经系统损伤后胶质疤痕形成的shRNA在制备治疗中枢神经系统损伤后胶质疤痕形成的药物中的应用。

8.一种如权利要求3至5任一所述的重组载体在制备治疗中枢神经系统损伤后胶质疤痕形成的药物中的应用。