CN104311589B - 对羧酸基丙酰胺苯基氧化硅、其共固定化l‑乳酸脱氢酶复合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种对羧酸基丙酰胺苯基氧化硅、其共固定化L‑乳酸脱氢酶复合物及其制备方法。该化合物是以带有规则排列羧基的对羧酸基丙酰胺苯基氧化硅为骨架，接枝L‑乳酸脱氢酶和辅因子NADH而形成的。本发明的这类新型有机/无机复合二维层状化合物克服了现有蒙脱土和水滑石类层状材料的难以控制层空间环境的缺点，通过发展合成这类具有功能性酶的有机/无机复合层状化合物，将能大大扩展功能性酶的应用范围，发展出一系列具有各种性能的新型生物功能性复合材料。
Description
技术领域
本发明涉及一种带有规则排列羧基的对羧酸基丙酰胺苯基氧化硅、其共固定化L-乳酸脱氢酶复合物及其制备方法。
背景技术
乳酸脱氢酶（英语：Lactate dehydrogenase；EC 1.1.1.27）是一个广泛存在于各种生物体中的NAD-依赖型酶，包括了植物与动物。L-乳酸脱氢酶（LDH）催化丙酮酸与乳酸之间还原与氧化反应，在碱性条件下促进乳酸向丙酮酸方向的反应，而在中性条件下促进丙酮酸向乳酸的转化（为逆反应）。LDH是参与糖无氧酵解和糖异生的重要酶。由于LDH几乎存在于所有体细胞中，而且在人体组织中的活性普遍很高，因此LDH在各组织中含量的高低对于疾病的诊断有着非常重要的临床意义，如癌症、心肌疾病、艾滋病等。近年来，由于生物技术和材料科学的发展，研究者们将其应用在生物传感、生物合成、生物分离材料等众多领域，并且取得了一定的成果。
NAD-依赖型乳酸脱氢酶是酶家族中的一个重要组成部分，在氧化还原型生物转化中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD(H)）作为一种电子的载体，然而NAD(H)非常昂贵，并且每获得一当量产物就需要消耗一当量的NAD(H)，这就限制了脱氢酶在工业中的应用。因此NAD(H)的再生和重复利用对NAD-依赖型乳酸脱氢酶的应用至关重要。
对酶和辅因子进行同时固定是实现催化剂重复使用的有效方法，然而研究表明，这种共固定方法的催化效率并不高，很多时候还会导致催化剂失活，这可能是由于固定后不利于NADH与酶活性位点的作用，从而酶无法从NADH获得电子，催化丙酮酸钠转化成乳酸。因此，构建一个活性界面，该界面能将NADH和酶同时固定上去，并且实现两者在空间上的自由作用是一个非常有意义的工作。
在二维层状纳米空间中，功能性分子在层空间中的排列方式，决定了层状-功能性分子复合材料的性能，而调节和控制分子在二维空间中排列的关键，是控制和设计二维空间的结构和环境。我们在新型具有规则排列氨苯基的层状有机氧化硅（APhTMS-DS） 基础上，通过与丁二酸酐反应，DS基本被丁二酸酐取代，生成了一种新型的具有规则排列羧基的二维分子空间材料（对羧基丙酰胺苯基氧化硅，CPAPhS）。通过该反应，把重要的官能团（羧基）引入了层空间内，改变了层空间环境，这为在微空间内控制和影响化学反应过程奠定了基础，也为二维分子空间内多步可控反应奠定了基础。CPAPhS在活化剂（例如EDC/NHS）的活化下，与带有-NH2官能团的生物分子在层空间内进行酰胺化反应。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种对羧酸基丙酰胺苯基氧化硅。
本发明的目的之二在于提供以该带有规则排列羧基的对羧酸基丙酰胺苯基氧化硅为骨架的共固定化L-乳酸脱氢酶复合物。
本发明的目的之三在于提供其制备方法。
为达到上述目的，本发明采用如下反应机理：
CPAPhS-LDH的制备方法
① -SiO1.5C6H4NHCOCH2CH2COOH + (C3H3N2)2CO
-SiO1.5C6H4NHCOCH2CH2CON2H3C3（缩写为CPAPhS）
② CPAPhS + EDC/NHS CPAPhS-NHS
CPAPhS-NHS + LDH CPAPhS-LDH
NADH-CPAPhS-LDH的制备方法
① -SiO1.5C6H4NHCOCH2CH2COOH + (C3H3N2)2CO
-SiO1.5C6H4NHCOCH2CH2CON2H3C3（缩写为CPAPhS）
② CPAPhS + NADH+EDC/NHS NADH-CPAPhS-NHS
NADH-CPAPhS-NHS + LDH NADH-CPAPhS-LDH
根据上述反应机理，本发明采用如下技术方案：
一种对羧酸基丙酰胺苯基氧化硅，其特征在于该化合物的结构式为：
。
一种共固定化L-乳酸脱氢酶复合物，以上述的对羧酸基丙酰胺苯基氧化硅为骨架，其特征在于该复合物是在所述的带有规则排列羧基的对羧酸基丙酰胺苯基氧化硅上接枝有L-乳酸脱氢酶，其中所述的L-乳酸脱氢酶和所述的带有规则排列羧基的对羧酸基丙酰胺苯基氧化硅的质量比为：1:100～1:50。
一种制备上述的共固定化L-乳酸脱氢酶复合物的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：
a.合成带有规则排列羧基的对羧酸基丙酰胺苯基氧化硅；
b.将步骤a所得带有规则排列羧基的对羧酸基丙酰胺苯基氧化硅同L-乳酸脱氢酶进行酰胺化接枝反应，从而得到共固定化L-乳酸脱氢酶复合物。
上述的步骤b的具体步骤为：将带有规则排列羧基的对羧酸基丙酰胺苯基氧化硅分散在磷酸缓冲溶液（PBS）中，用0.1M水性偶联试剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和0.1M N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化，室温下搅拌反应12小时；最后离心分离，使用PBS洗涤除去未反应的EDC和NHS，然后将该产物分散在PBS中，加入0.01μM L-乳酸脱氢酶，反应4小时，离心分离，冷冻干燥，最终得产物共固定化L-乳酸脱氢酶复合物。
一种共固定化L-乳酸脱氢酶复合物，以上述的带有规则排列羧基的对羧酸基丙酰胺苯基氧化硅为骨架，其特征在于该复合物是在所述的带有规则排列羧基的对羧酸基丙酰胺苯基氧化硅上接枝有L-乳酸脱氢酶和辅因子烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH，其中所述的L-乳酸脱氢酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和所述的带有规则排列羧基的对羧酸基丙酰胺苯基氧化硅的质量比为：1:5:100～1:10:50。
一种上述的共固定化L-乳酸脱氢酶复合物的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：
a.合成带有规则排列羧基的对羧酸基丙酰胺苯基氧化硅；
b.将步骤a所得带有规则排列羧基的对羧酸基丙酰胺苯基氧化硅同L-乳酸脱氢酶和辅因子NADH进行酰胺化接枝反应，从而得到稳定的含有L-乳酸脱氢酶和辅因子NADH的有机/无机复合层状化合物。
是那个述的步骤a的具体步骤为：
a-1.将十二烷基硫酸钠与对氨基苯基三甲氧基硅烷按1:0.9~1:1的摩尔比溶解于去离子水中得到混合溶液，调节该混合溶液的pH值到1.5~2.5，搅拌反应10~14天；最后抽滤，分别用去离子水、乙醇洗涤，真空干燥得到对氨基苯基氧化硅-十二烷基硫酸层状化合物；其化学式为：-SiO1.5C6H4NH3C12H25OSO3，结构式为：
a-2. 将步骤a-1所得对氨基苯基氧化硅-十二烷基硫酸和丁二酸酐按1:2~1:4的摩尔比分散在THF中，在50℃，搅拌反应12~32小时；最后抽滤，用乙醇洗涤，真空干燥，最终得产物带有规则排列羧基的对羧酸基丙酰胺苯基氧化硅。
上述的步骤b的具体方法为：将带有规则排列羧基的对羧酸基丙酰胺苯基氧化硅分散在磷酸缓冲溶液（PBS）中，用0.1M水性偶联试剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和0.1M N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化，然后先加入10μM辅因子NADH，室温下搅拌反应12小时；最后离心分离，使用PBS洗涤除去未反应的NADH，EDC和NHS，然后将该产物分散在PBS中，加入0.01μM L-乳酸脱氢酶，反应4小时，离心分离，冷冻干燥，最终得产物共固定化L-乳酸脱氢酶复合物。
本发明提供了一种全新类型的CPAPhS-LDH和NADH-CPAPhS-LDH两种有机/无机复合层状化合物。这类新型有机/无机复合二维层状化合物克服了现有蒙脱土和水滑石类层状材料的难以控制层空间环境的缺点，通过发展合成这类具有功能性多肽的有机/无机复合层状化合物，将能大大扩展功能性酶的应用范围，发展出一系列具有各种性能的新型生物功能性复合材料。
附图说明
图1为本发明的有机/无机复合层状化合物CPAPhS-LDH的结构示意图。
图2为本发明的有机/无机复合层状化合物NADH-CPAPhS-LDH的结构示意图。
图3为X射线粉末衍射图。其中(a)为对氨基苯基氧化硅-十二烷基硫酸化合物，(b)为对氨基苯基氧化硅-八烷基硫酸化合物，(c) 为对氨基苯基氧化硅-氯化合物。
图4为对氨基苯基氧化硅-十二烷基硫酸化合物的13C CP/MAS核磁共振图（以四甲基硅烷为0ppm）
图5为对羧酸基丙酰胺苯基氧化硅化合物的13C CP/MAS 核磁共振谱图（以四甲基硅烷为0ppm）
图6为对羧酸基丙酰胺苯基氧化硅化合物的X射线粉末衍射图。
图7为对氨基苯基氧化硅-十二烷基硫酸化合物的29Si HPDEC/MAS核磁共振图（以四甲基硅烷为0 ppm）
图8为UV-vis光谱图。
图9为XPS谱图。其中(a) 为CPAPhS，(b) CPAPhS-LDH，(c) 为NADH-CPAPhS-LDH。
图10为层状化合物CPAPhS-LDH和游离的LDH催化丙酮酸钠转化成乳酸的反应动力学曲线。
图11为重复利用CPAPhS-LDH催化丙酮酸钠转化成乳酸的活性保留状况图。
具体实施方式
现将本发明的具体实施例叙述于后。
实施例一：CPAPhS-LDH和NADH-CPAPhS-LDH层状化合物，参见图1和图2，的制备；
（1）事先制备好对氨基苯基氧化硅-十二烷基硫酸层状化合物；其制备方法为：首先将2.88mmol的十二烷基硫酸钠溶解到250ml的去离子水中，然后加入2.74mmol的对氨基苯基三甲氧基硅烷，接着缓慢滴加0.5mol/L的盐酸调节混合溶液的pH值到2，并且在室温下磁力搅拌12天进行溶胶-凝胶过程；最后抽滤，分别用去离子水、乙醇洗涤，真空干燥，得到对氨基苯基氧化硅-十二烷基硫酸层状结构化合物；
为了证明对氨基苯基氧化硅-十二烷基硫酸纳米复合层状结构化合物的化学及立体结构，进行了一系列分析实验。首先使用八烷基硫酸阴离子，氯阴离子同对氨基苯基氧化硅-十二烷基硫酸化合物进行阴离子交换反应，得到对氨基苯基氧化硅-八烷基硫酸和对氨基苯基氧化硅-氯化合物，然后进行X射线粉末衍射分析。X射线粉末衍射的结果显示，参见图3，根据阴离子的不同，对氨基苯基氧化硅-十二烷基硫酸化合物， 对氨基苯基氧化硅-八烷基硫酸化合物和对氨基苯基氧化硅-氯化合物显示了位置不同的X射线衍射峰，其衍射峰对应的结构间距分别为4nm，3.2nm，1.6nm，可见，对氨基苯基氧化硅化合物具有某种规则结构，且随着阴离子的不同，这种规则结构可伸缩，这是典型的层状结构的特征；另外，这些结构间距值同对氨基苯基氧化硅-十二烷基硫酸化合物（说明书中所示）， 对氨基苯基氧化硅-八烷基硫酸化合物和对氨基苯基氧化硅-氯化合物结构中氧化硅层间的理论间距一致。
为了确认化学结构，对对氨基苯基氧化硅-十二烷基硫酸化合物还进行了13C CP/MAS 核磁共振分析，从图4中可见，70-10ppm 为十二烷基硫酸中甲基和亚甲基的共振峰，135和125ppm为苯环上碳的重叠峰，由此证明对氨基苯基氧化硅-十二烷基硫酸化合物具有很完好的的化学结构。
对对氨基苯基氧化硅-十二烷基硫酸化合物进行29Si HPDEC/MAS核磁共振分析，参见图7，只在72.5ppm 和80ppm处观察到两个硅峰，说明在对氨基苯基氧化硅-十二烷基硫酸化合物中只存在两种氧化硅结构，一种为RSi(OH)(OSi)2，另一种为RSi (OSi)3；没有未水解的硅烷基存在，硅烷基全部水解成为氧化硅结构。
对氨基苯基氧化硅-十二烷基硫酸化合物进行元素分析显示，N含量为 0.0307 g/g （约2.2 x 10-3mol/g）；S含量为0.0708 g/g（约2.2 x 10-3mol/g）， 可见在对氨基苯基氧化硅-十二烷基硫酸化合物结构中，对氨基苯基氧化硅同十二烷基硫酸的比例为1：1。
对氨基苯基三甲氧基硅烷化合物，在硅烷水解形成氧化硅时只有三个水解连接点，因此其水解后只能形成二维结构，另外考虑到同硅连接的苯基的分子尺寸，同硅连接的苯基在氧化硅层单面的排列可能性很小；且如果同硅连接的苯基仅排列在氧化硅层的单面，对氨基苯基氧化硅-十二烷基硫酸化合物的X射线粉末衍射图中应该有2nm的结构间距峰出现，但是在对氨基苯基氧化硅-十二烷基硫酸化合物的X射线粉末衍射图中，只观察到有4nm的结构间距峰；且良好的X射线衍射结果显示对氨基苯基氧化硅-十二烷基硫酸化合物的二维层结构保持良好，而且同硅层连接的苯胺在层间排列是比较规则的，因为如果同硅层连接的苯胺在层间排列混乱，将导致没有X射线衍射峰的出现。综上所述，对氨基苯基氧化硅-十二烷基硫酸化合物的化学和立体结构为说明书结构图所示的具有规则胺基的二维层状化合物；更为具体的分析请见发明人的有关论文：Ion-exchangeable LayeredAminophenylsilica Prepared with Anionic Surfactant Templates；(发明人：姚建（笔名： Yao Ken)）Chemistry Letters, Vol.33, Page 1112, (2004)，以及论文TheFunctional Layered Organosilica Materials Prepared with Anion SurfactantTemplates(发明人：姚建（笔名： Yao Ken)）Journal of Colloid and InterfaceScience, Vol.285，Page 259, (2005)
（2）对羧酸基丙酰胺苯基氧化硅层状化合物的制备：将0.1mol对氨基苯基氧化硅-十二烷基硫酸分散在50ml THF中，然后再加入0.3mol的丁二酸酐，加热至50℃，磁力搅拌24小时；最后抽滤，用乙醇洗涤，真空干燥，最终得产物对羧酸基丙酰胺苯基氧化硅层状化合物；
对产物进行进行13C CP/MAS 核磁共振分析，与对氨基苯基氧化硅-十二烷基硫酸的13C CP/MAS图进行比较，对氨基苯基氧化硅-十二烷基硫酸化合物中十二烷基硫酸中甲基和亚甲基在70-10ppm之间有复杂的共振峰（参见图4），而在对羧酸基丙酰胺苯基氧化硅化合物的13C CP/MAS 核磁共振谱图中消失（参见图5），代之为在29.3ppm出现对羧酸基丙酰胺苯基氧化硅化合物中两个亚甲基的共振峰，可见，在对羧酸基丙酰胺苯基氧化硅化合物中没有十二烷基硫酸的存在；另外在178ppm和173ppm出现了两个等高的共振峰，这两个峰分别为酰胺基和羧酸基中的羰基的共振峰，显然13C CP/MAS 核磁共振分析也证明了丁二酸酐中的一个羰基同对氨基苯基氧化硅-十二烷基硫酸中的氨基反应生成了酰胺，同时丁二酸酐中另一个羰基转化成了羧酸基，从而形成了对羧酸基丙酰胺苯基氧化硅层状化合物。
对产物对羧酸基丙酰胺苯基氧化硅层状化合物还进行了X射线粉末衍射分析，对氨基苯基氧化硅-十二烷基硫酸化合物的衍射峰对应的结构间距为4nm（参见图3a），而对羧酸基丙酰胺苯基氧化硅化合物的结构间距为2.3nm（参见图6）；这些结构间距值同对氨基苯基氧化硅-十二烷基硫酸化合物和对羧酸基丙酰胺苯基氧化硅化合物（说明书中所示）的理论结构中硅层的间距一致，这说明在对羧酸基丙酰胺苯基氧化硅化合物中，二维结构保持完好并且同模型图一致；更为具体的分析请见发明人的有关论文：Two-DimensionalMolecular Space with Regular Molecular Structure；(发明人：姚建（笔名： Yao Ken)）Langmuir, 24 (2008) 302。
（3）CPAPhS-LDH化合物的制备：首先用水性偶联试剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）对羧酸基丙酰胺苯基氧化硅进行活化，然后先后同L-乳酸脱氢酶进行酰胺化接枝反应；其反应过程及步骤如下：取50mg CPAPhS, 使用8ml 10mM， pH=8.0 PBS，分散，然后依次加入152mg EDC和184mg NHS，室温反应12h，离心，使用PBS洗涤以除去未反应的EDC和NHS，最后抽滤。将所得物使用3ml 50mM PBS，pH=8.0分散，然后加入0.5mg的L-乳酸脱氢酶，反应4小时，离心分离，并使用PBS洗涤三次，离心分离，冷冻干燥，最终得产物L-乳酸脱氢酶丁二酰胺苯基氧化硅层状化合物。
（4）NADH-CPAPhS-LDH化合物的制备：首先用水性偶联试剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）对羧酸基丙酰胺苯基氧化硅进行活化，然后先后同L-乳酸脱氢酶和辅因子NADH进行酰胺化接枝反应；其反应过程及步骤如下：取50mg CPAPhS, 使用8ml 10mM， pH=8.0 PBS，分散，然后依次加入20mg NADH，152mgEDC和184mg NHS，室温反应12h，离心，使用PBS洗涤以除去未反应的NADH，EDC和NHS，最后抽滤。将所得物使用3ml 50mM PBS，pH=8.0分散，然后加入0.5mg的L-乳酸脱氢酶，反应4小时，离心分离，并使用PBS洗涤三次，离心分离，冷冻干燥，最终得产物L-乳酸脱氢酶和辅因子NADH丁二酰胺苯基氧化硅层状化合物。
首先对产物进行紫外光谱分析，参见图8，为对CPAPhS，CPAPhS-NHS，NADH-CPAPhS-NHS，NADH-CPAPhS-LDH和CPAPhS-LDH的紫外光谱图进行比较，从图中可见对羧酸基丙酰胺苯基氧化硅化合物在252.0nm处有一个吸收峰，当NADH和LDH接枝到CPAPhS后，该吸收峰发生了不同程度的移动，CPAPhS-LDH为261.0nm，NADH-CPAPhS-LDH为268.5nm（见表1）。
表1各种二维分子材料的紫外-可见光吸收光谱
这一方面是由于NADH和LDH与CPAPhS反应形成了新的酰胺键，另一方面是因为新的分子的引入对带入了新的分子结构，对形成的新的化合物的光谱学性质产生了影响。因此我们可以初步肯定NADH和LDH成功接枝到对羧酸基丙酰胺苯基氧化硅中。
对CPAPhS，CPAPhS-LDH和NADH-CPAPhS-LDH进行XPS分析，参见图9，相对于对羧酸基丙酰胺苯基氧化硅化合物的C1s的XPS，CPAPhS-LDH和NADH-CPAPhS-LDH在287.5eV和291.5eV两个位置出现了新的峰，这两个新峰分别归属于π-π*的跃迁和O=C-N。C1s的XPS在CPAPhS-LDH和NADH-CPAPhS-LDH中发生了改变，这是由于对羧酸基丙酰胺苯基氧化硅中羧基与LDH中氨基形成新的酰胺键并且蛋白质的骨架是一个酰胺结构，并且LDH中含有芳香氨基酸。显然化合物的C1s的XPS分析也证明了对羧酸基丙酰胺苯基氧化硅中的羧基同LDH的氨基反应生成了新的酰胺键，LDH被成功地接枝到对羧酸基丙酰胺苯基氧化硅中，形成了乳酸脱氢酶丁二酰胺苯基氧化硅化合物。同时通过对CPAPhS-LDH和NADH-CPAPhS-LDH两个XPS谱图进行模拟分峰，并计算了各种类型的碳在化学物中的比例。从表2可以看到O=C-O，O=C-N和C-N的百分比都有所降低，这是因为NADH的引入，不仅消耗了部分羧基并且由于NADH相对LDH而言，不含酰胺键和氨基，所以整体来讲都会导致这三种类型的碳比例下降。另外，π-π*的跃迁，C-O和C-C/C-H的比例都有所增加（见表2），这是因为NADH含有两个芳香体系，不饱和度较高，并且较多的羟基。综上所述，CPAPhS-LDH和NADH-CPAPhS-LDH被成功制备出来。
表2 C 1s XPS谱分解图中各种类型碳的含量
对两种层状化合物分别催化丙酮酸钠转化成乳酸的反应动力学曲线进行比较，参见图10，两者的Km值非常接近，分别为12.2和13.9μM，这是因为层状的对羧酸基丙酰胺苯基氧化硅化合物为乳酸脱氢酶的固定提供了一个开放性的平台，非常有利于底物丙酮酸钠和乳酸脱氢酶的接触。游离的乳酸脱氢酶和LDH的Kcat/Km值分别为68.4和18.9（见表3），由此可以计算出乳酸脱氢酶固定后保留的活性是游离酶的28%。固定后活性的丢失可能是由于共价键固定后导致了酶构象的改变或者酶的活性位点被阻碍了。
表 3 CPAPhS- LDH 和游离的LDH动力学参数
表 4 NADH-CPAPhS-LDH的催化性能
对重复利用CPAPhS-LDH催化丙酮酸钠转化成乳酸的活性保留状况进行测试，参见图11，经过5次重复使用后，CPAPhS-LDH的催化能力仍然保持了50%以上的。由此可见，CPAPhS-LDH不仅有利于产物的分离，而且CPAPhS-LDH的可重复使用也能降低成本。
对NADH-CPAPhS-LDH催化丙酮酸钠转化成乳酸的活性进行测试，参见表4， 使用NADH-CPAPhS-LDH直接催化丙酮酸钠合成乳酸，反应结束后，离心分离，乳酸的产率达99.4%。 由于NADH-CPAPhS-LDH催化反应结束后NADH-CPAPhS-LDH中的NADH被氧化成NAD+,通过使用乙醇脱氢酶和乙醇对NAD+进行还原，NADH-CPAPhS-LDH中的NADH再生，NADH-CPAPhS-LDH经过再生后还能催化丙酮酸钠合成乳酸，产率为65.3%。由此可见，NADH-CPAPhS-LDH是一种绿色、环保、高效的复合型生物催化剂。
CPAPhS-LDH和NADH-CPAPhS-LDH两种有机/无机复合层状化合物的性能测试：
CPAPhS-LDH活性测试：取3mg CPAPhS-LDH粉末，并使用1ml PBS混匀，制备成CPAPhS-LDH的PBS悬浮液，在每次活性测试中都使用移液枪取100微升。改变丙酮酸钠的浓度，分别为1，2，9，18，37，56，93 μM，NADH的浓度固定在186μM，在这个条件下测定CPAPhS-LDH催化丙酮酸钠转化成乳酸的动力学曲线。
CPAPhS-LDH的可重复利用测试：取3mg CPAPhS-LDH粉末，并使用4ml PBS混匀，加入一定量的丙酮酸钠和NADH使 [丙酮酸钠]= [NADH]= 10μmole，反应10min，然后离心分离，检测上清液中NADH和丙酮酸钠的含量，计算产率。重复以上步骤5次。
NADH-CPAPhS-LDH活性测试：取3mg CPAPhS-LDH粉末，并使用4ml PBS混匀，加入一定量的丙酮酸钠使 [丙酮酸钠] = 10μmole，反应30min，离心分离，上清液中丙酮酸钠的含量，计算产率。
Claims (7)
1.一种共固定化L-乳酸脱氢酶复合物，以对羧酸基丙酰胺苯基氧化硅为骨架，其结构式为：其特征在于该复合物是在所述的带有规则排列羧基的对羧酸基丙酰胺苯基氧化硅上接枝有L-乳酸脱氢酶，其中所述的L-乳酸脱氢酶和所述的带有规则排列羧基的对羧酸基丙酰胺苯基氧化硅的质量比为：1:100～1:50。
2.一种制备权利要求1所述的共固定化L-乳酸脱氢酶复合物的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：
a.合成带有规则排列羧基的对羧酸基丙酰胺苯基氧化硅；
b.将步骤a所得带有规则排列羧基的对羧酸基丙酰胺苯基氧化硅同L-乳酸脱氢酶进行酰胺化接枝反应，从而得到共固定化L-乳酸脱氢酶复合物。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的步骤b的具体步骤为：将带有规则排列羧基的对羧酸基丙酰胺苯基氧化硅分散在磷酸缓冲溶液中，用0.1M水性偶联试剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.1M N-羟基琥珀酰亚胺活化，室温下搅拌反应12小时；最后离心分离，使用磷酸缓冲溶液洗涤除去未反应的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，然后将该产物分散在磷酸缓冲溶液中，加入0.01μML-乳酸脱氢酶，反应4小时，离心分离，冷冻干燥，最终得产物共固定化L-乳酸脱氢酶复合物。
4.一种共固定化L-乳酸脱氢酶复合物，以根据权利要求1所述的对羧酸基丙酰胺苯基氧化硅为骨架，其特征在于该复合物是在所述的带有规则排列羧基的对羧酸基丙酰胺苯基氧化硅上接枝有L-乳酸脱氢酶和辅因子烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，其中所述的L-乳酸脱氢酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和所述的带有规则排列羧基的对羧酸基丙酰胺苯基氧化硅的质量比为：1:5:100～1:10:50。
5.一种制备根据权利要求4所述的共固定化L-乳酸脱氢酶复合物的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：
a.合成带有规则排列羧基的对羧酸基丙酰胺苯基氧化硅；
b.将步骤a所得带有规则排列羧基的对羧酸基丙酰胺苯基氧化硅同L-乳酸脱氢酶和辅因子烟酰胺腺嘌呤二核苷酸进行酰胺化接枝反应，从而得到稳定的含有L-乳酸脱氢酶和辅因子烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的有机/无机复合层状化合物。
6.根据权利要求2或5所述的方法，其特征在于所述的步骤a的具体步骤为：
a-1.将十二烷基硫酸钠与对氨基苯基三甲氧基硅烷按1:0.9～1:1的摩尔比溶解于去离子水中得到混合溶液，调节该混合溶液的pH值到1.5～2.5，搅拌反应10～14天；最后抽滤，分别用去离子水、乙醇洗涤，真空干燥得到对氨基苯基氧化硅-十二烷基硫酸层状化合物；其化学式为：-SiO1.5C6H4NH3C12H25OSO3，结构式为：
a-2.将步骤a-1所得对氨基苯基氧化硅-十二烷基硫酸和丁二酸酐按1:2～1:4的摩尔比分散在四氢呋喃中，在50℃，搅拌反应12～32小时；最后抽滤，用乙醇洗涤，真空干燥，最终得产物带有规则排列羧基的对羧酸基丙酰胺苯基氧化硅。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述的步骤b的具体方法为：将带有规则排列羧基的对羧酸基丙酰胺苯基氧化硅分散在磷酸缓冲溶液中，用0.1M水性偶联试剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.1M的N-羟基琥珀酰亚胺活化，然后先加入10μM辅因子烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，室温下搅拌反应12小时；最后离心分离，使用磷酸缓冲溶液洗涤除去未反应的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，然后将该产物分散在磷酸缓冲溶液中，加入0.01μM L-乳酸脱氢酶，反应4小时，离心分离，冷冻干燥，最终得产物共固定化L-乳酸脱氢酶复合物。
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