CN104293775A - 抗逆杨树的分子标记、筛选方法、试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种筛选抗逆杨树的分子标记、筛选方法、试剂盒及应用。其中，该分子标记为采用MSAP法检测的分子标记，分子标记包括MS1，MS2，MS3，MS4，MS5，MS6，MS7，MS8，MS9，MS10。应用本发明确定的筛选抗逆杨树的分子标记，可以在杨树生长的早期进行筛选出逆境胁迫适应性强、生活力高的植株，极大地缩短林木育种选择周期，对发展杨树速生丰产纸浆林、确保我国林业持续稳定地提供高得率工业纸浆原料具有重要的战略意义。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体而言，涉及一种筛选抗逆杨树的分子标记、筛选方法、试剂盒及应用。
背景技术
DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，是基因组DNA在转录水平上进行调控的一种修饰方式，它参与了基因表达、生物的生长发育和逆境响应应答等过程，其中，在基因表达调控中具有重要作用。对基因组甲基化进行研究最常用的技术是甲基敏感扩增多态性技术（Methylation sensitive amplified polymorphism，MSAP），该方法是利用识别5‘-CCGG序列的同裂酶HpaⅡ和MspⅠ对基因组DNA甲基化敏感性不同，相同序列可以扩增出不同的谱带，来检测甲基化水平以及有效区分出基因组DNA的甲基化状态。
杨树是我国北方的主要造林树种。但随着全球气候变暖，极端天气频发，严重影响杨树的生长与发育，进而影响林木生产的可持续发展。其中，小叶杨是杨树属植物中具典型抗逆特征的树种，是设施困难立地造林的主要树种。而且，利用传统育种选择抗逆性好的杨树费时而且难度大、成本高。因此，以小叶杨为材料对研究影响杨树抗逆性状的分子调控机制尤为重要，而近年来对杨树分子生物学方面的研究大多集中在群体遗传结构与遗传多样性等方面，与其适应性密切相关的DNA甲基化表观遗传变异尚未见报道。
目前，亟需开发有效的与杨树抗逆相关的分子标记。
发明内容
本发明旨在提供一种筛选抗逆杨树的分子标记、筛选方法、试剂盒及应用，以解决现有技术中利用传统育种选择抗逆性好的杨树费时而且难度大、成本高的技术问题。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种筛选抗逆杨树的分子标记。该分子标记为采用MSAP法检测的分子标记，分子标记包括碱基序列为SEQ ID NO.1的MS1，SEQ ID NO.2的MS2，SEQ ID NO.3的MS3，SEQ ID NO.4的MS4，SEQ ID NO.5的MS5，SEQ ID NO.6的MS6，SEQ ID NO.7的MS7，SEQ ID NO.8的MS8，SEQ ID NO.9的MS9，SEQ ID NO.10的MS10。
进一步地，待筛选杨树中能够检测到上述分子标记的植株的抗逆性强于检测不到上述分子标记的植株。。
根据本发明的另一个方面，提供一种筛选抗逆杨树的方法。该方法包括以下步骤：S1，提取待筛选毛白杨的基因组DNA；S2，采用MSAP法测定待筛选毛白杨的基因组DNA中是 否含有碱基序列为SEQ ID NO.1的MS1，SEQ ID NO.2的MS2，SEQ ID NO.3的MS3，SEQ ID NO.4的MS4，SEQ ID NO.5的MS5，SEQ ID NO.6的MS6，SEQ ID NO.7的MS7，SEQ ID NO.8的MS8，SEQ ID NO.9的MS9，SEQ ID NO.10的MS10的分子标记；S3，根据步骤S2中的测定结果判断待筛选毛白杨的抗逆性。
进一步地，待筛选杨树中能够检测到分子标记的植株的抗逆性强于检测不到分子标记的植株。
进一步地，MSAP法所用的EcoRI接头的序列为SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12，HpaII/MspI接头的序列为SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14，EcoRI预扩增引物的序列为SEQ ID NO：15，HpaII/MspI预扩增引物的序列为SEQ ID NO：16，筛选引物序列为SEQ ID NO：17～20。
进一步地，S2中进行MSAP法测定时的双酶切连接反应体系的总体积为20μl，包括基因组DNA200ng，Hpa II/Msp I7.5U，EcoR I7.5U，10×缓冲液2μl，50pmol的HpaII/MspI接头和5pmol EcoR I接头，T4DNA连接酶2.5U，加ddH2O至20μl，37℃保温12h。
根据本发明的再一个方面，提供一种筛选抗逆杨树的试剂盒。该试剂盒包括采用MSAP法检测权利要求1中所述的分子标记时的EcoRI接头的序列为SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12，HpaII/MspI接头的序列为SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14，EcoRI预扩增引物的序列为SEQ ID NO：15，HpaII/MspI预扩增引物的序列为SEQ ID NO：16，筛选引物序列为SEQ ID NO：17～20。
进一步地，该试剂盒包括PCR扩增试剂，扩增试剂包括PCR扩增缓冲液，25mmoll-1MgCl2，10mmoll-1dNTP，Taq DNA聚合酶和双蒸水。
根据本发明的再一个方面，提供一种碱基序列为SEQ ID NO.1的MS1，SEQ ID NO.2的MS2，SEQ ID NO.3的MS3，SEQ ID NO.4的MS4，SEQ ID NO.5的MS5，SEQ ID NO.6的MS6，SEQ ID NO.7的MS7，SEQ ID NO.8的MS8，SEQ ID NO.9的MS9，SEQ ID NO.10的MS10的MSAP分子标记在杨树分子标记辅助选择育种中的应用。
应用本发明确定的筛选抗逆杨树的分子标记，可以在杨树生长的早期进行筛选出逆境胁迫适应性强、生活力高的植株，极大地缩短林木育种选择周期，对发展杨树速生丰产纸浆林、确保我国林业持续稳定地提供高得率工业纸浆原料具有重要的战略意义。另外，本发明的分子标记可以用于进一步的抗逆候选基因筛选，可以为作为遗传标记用于抗逆性状的关联分析，也可以作为候选位点用于进一步的DNA甲基化调控基因表达研究。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了杨树MSAP技术扩增结果，其中H是采用Hpa II/EcoR I双酶切的结果， M是采用Msp I/EcoR I双酶切的结果；CK是对照组处理结果，D是经过干旱处理的结果；以及
图2示出了MS2通过回收克隆得到的DNA差异位点核甘酸序列在基因中的位置，其中，红色代表通过双酶切得到的差异条带，黄色代表甲基化修饰的CCGG位点，绿色代表5`UTR、蓝色代表外显子、粉色代表3`UTR等基因结构。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
利用传统育种选择抗逆性好的杨树费时而且难度大、成本高，稳定性差，为了解决这一技术问题，本发明开发出与筛选抗逆杨树的分子标记，可以在早期就鉴定出抗逆性好的单株，从而大大加速育种进程。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种筛选抗逆杨树的分子标记。该分子标记为采用MSAP法检测的分子标记，分子标记包括碱基序列为SEQ ID NO.1的MS1，SEQ ID NO.2的MS2，SEQ ID NO.3的MS3，SEQ ID NO.4的MS4，SEQ ID NO.5的MS5，SEQ ID NO.6的MS6，SEQ ID NO.7的MS7，SEQ ID NO.8的MS8，SEQ ID NO.9的MS9，SEQ ID NO.10的MS10，具体序列如下
>MS1（SEQ ID NO:1）
ACAAACTCGATAGGGCGATTGAGCTGCCCTTGGTCTTAGGGCGATAATCCAATTACC GGCCATAGCACCTCCTAAGCGTCTTGCCAAACGCTCAGGAAGTATTTCTTCAAGTATTTCT CGTTGATTGCTCGCTAAAGGG
>MS2（SEQ ID NO:2）
GGATAACTCTATAGGGCGATTGAGCTGCCCTTGACTGCGTACCAATTCAGCTTCGAAT TTGTAGAAAAAATGCGGGTTACTCCCTGCTACCAACACACGCCCATCTGGTAAAAGGCTA GCTGTTGAATGGTACAATCTGGGTACAGTTTCCGAGCAGGACTCATGATAAGGG
>MS3（SEQ ID NO:3）
AGCTGCCCTTATCATGAGTCCTGCTCGGAAATGAGACCGATCGACTCTCCCTGCTAG CTTTTAAGGCTCAAATTACCAATGATCCTCTTGGTAAGCTGAATTGGTACGCAGTCAAGG G
>MS4（SEQ ID NO:4）
CGGTGGCTCGTTAGGGCGATTGAGCTGCCCTTGACTGCGTACCAATTCAGCATTGTA GTGAACTTGAAGGCTTGCCTGAAGAAGGTTTCCGAGCAGGACTCATGATAAGGG
>MS5（SEQ ID NO:5）
CGGTGACTACTATAGGGCGATTGAGCTGCCCTTATCATGAGTCCTGCTCGGAAACGC AAACTCCTGGATGAATTGGTACGCAGTCAAGGG
>MS6（SEQ ID NO:6）
TACGACTCACTATAGGGCGAATTGAAGCTGCCCTTATCATGAGTCCTGCTCGGAAAA GCACTCCAATCTAATATTCATATCCAGCATGACATTTCCGTGCTTGATCCAGCTGAATTGGT ACGCAGTCAAG
>MS7（SEQ ID NO:7）
GGGAACTCTATAGGGGGCGATTGAGCTGCCCTTGACTGCGTACCAATTCATTATGCC CATGGCCTTGCTTGAGATCCCTATATCTGGATGAACTTGCTTCAGCACCTTAAAGATGTAG ATCTTGTATGTCTCTGTGCTCTTCTTCACCCTCTTTTTCTTCTTCTTTCCGAGCAGGACTCA TGATAAGGG
>MS8（SEQ ID NO:8）
TACGACTCACTATAGGGCGAATTGAAGCTGCCCTTGACTGCGTACCAATTCATCAGT GCCATAGCTTTCACCACATGCTCCGCAAGTAGCACCCTGTTCGTCATCTTCTTCTTCCTCT TCCCCACTCTCATAGTCTTCCTTGGGTGGTGCAGATACCTTTACTGCCTTAGTCTGGGACT CAGGTTTCCGAGCAGGACTCATGATAAGGG
>MS9（SEQ ID NO:9）
GGATGACTCCTATAGGGGCGGATTGAGCTGCCCTTGACTGCGTACCAATTCCCATCAT TTGCAGTTTCCGAGCAGGACTCATGATATGACTGCGTACCAATTCCCATCATTTGCAGTTT CCGAGCAGGACTCATGATAGGTGACTGCGTACCAATTCCCATCATTTGCAGTTTCCGAGC AGGACTCATGATAAGGG
>MS10（SEQ ID NO:10）
AGGATTTGTCATGAGATATCAAAAGATCTCACTAGATCCTTCACTAAAATGAAGATTA ATCACTAAGTATATGAATATCTGGCTGACGTCACATGCCTATTCATTAGC
应用本发明确定的筛选抗逆杨树的分子标记，可以在杨树生长的早期进行筛选出逆境胁迫适应性强、生活力高的植株，极大地缩短林木育种选择周期，对发展杨树速生丰产纸浆林、确保我国林业持续稳定地提供高得率工业纸浆原料具有重要的战略意义。另外，本发明的分子标记可以用于进一步的抗逆候选基因筛选，可以为作为遗传标记用于抗逆性状的关联分析，也可以作为候选位点用于进一步的DNA甲基化调控基因表达研究。
本发明所示的标记是利用MSAP技术发现的干旱处理材料与对照组DNA甲基化有差异的片段，然后再经过DNA纯化及分子克隆手段得到相关具多态性DNA片段序列，因此，待筛选杨树中能够检测到上述分子标记的植株的抗逆性强，反之亦然。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种筛选抗逆杨树的方法。该方法包括以下步骤：S1，提取待筛选毛白杨的基因组DNA；S2，采用MSAP法测定待筛选毛白杨的基因组DNA中是否含有上述分子标记（MS1-10）；S3，根据步骤S2中的测定结果判断待筛选毛白杨的抗 逆性。
本发明所示的标记是干旱处理材料与对照组DNA甲基化有差异的片段，待筛选杨树中能够检测到上述分子标记的植株的抗逆性强，反之亦然。
根据本发明一种典型的实施方式，MSAP法所用的接头、预扩增引物和筛选引物序列如表1中所示。
表1
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种筛选抗逆杨树的试剂盒。该试剂盒MSAP法所用的接头、预扩增引物和筛选引物序列如表1中所示。应用本发明确定的筛选抗逆杨树的分子标记，可以在杨树生长的早期进行筛选出逆境胁迫适应性强、生活力高的植株，极大地缩短林木育种选择周期，对发展杨树速生丰产纸浆林、确保我国林业持续稳定地提供高得率工业纸浆原料具有重要的战略意义。另外，本发明的分子标记可以用于进一步的抗逆候选基因筛选，可以为作为遗传标记用于抗逆性状的关联分析，也可以作为候选位点用于进一步的DNA甲基化调控基因表达研究。待筛选杨树中能够检测到分子标记的植株的抗逆性强，检测不到分子标记的植株的抗逆性弱。
优选地，进一步包括PCR扩增试剂，扩增试剂包括PCR扩增缓冲液，25mmoll-1MgCl2，10mmoll-1dNTP，Taq DNA聚合酶和双蒸水。
本发明对MSAP双酶切体系的反应时间、反应温度、缓冲液选择以及DNA模板使用量进行了优化，由此获得了杨树基因组通用的MSAP双酶切反应体系，该双酶切连接反应体系的总体积为20μl，包括DNA模板200ng，Hpa II或Msp I7.5U，EcoR I7.5U，10×缓冲液2μl，酶切产物4μl，50pmol的HpaII/MspI接头和5pmol EcoR I接头，2.5U T4DNA连接酶，加ddH2O至20μl，37℃保温12h。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种碱基序列为SEQ ID NO.1的MS1，SEQ ID NO.2的MS2，SEQ ID NO.3的MS3，SEQ ID NO.4的MS4，SEQ ID NO.5的MS5，SEQ ID NO.6的MS6，SEQ ID NO.7的MS7，SEQ ID NO.8的MS8，SEQ ID NO.9的MS9，SEQ ID NO.10 的MS10的MSAP分子标记在杨树分子标记辅助选择育种中的应用。
本发明中提及的分子生物学技术，本领域技术人员均可按照常规操作进行，以下对本发明优选的实验步骤做详细的描述：
筛选抗逆杨树的分子标记是通过MSAP技术得到的，其获取主要包括以下步骤：1）提取杨树基因组DNA；2）分别用EcoRI/HpaII、HpaII//MspI两组酶对林木基因组DNA进行酶切；3）分别对酶切得到的产物连接上限制性内切酶的接头；4）以接头为模板设计的预扩增引物进行PCR预扩增，得PCR预扩增产物；5）将PCR预扩增产物稀释后，加入带有选择性碱基的筛选引物进行PCR扩增；6）电泳检测PCR扩增产物，统计并分析DNA条带；7）提取多态性DNA，并纯化回收；8）进行DNA片段克隆。
本发明采用的材料是小叶杨（取自全国毛白杨种质资源库）。选取小叶杨无性系中生长势相同或相近的5株个体，进行以下处理：干旱处理，10天不浇水；对照组，按正常培育时间浇水。
步骤1）中杨树基因组DNA的提取采用传统的CTAB法（Doyle等，Phytochemistry Bulletin.(1987)9.1-15），选择纯度OD260/OD280在1.8～1.9之间的DNA样品定量，并稀释成浓度为200ng/μl，-20℃保存待用。
步骤2）和3）可以在一步中进行，双酶切连接反应体系的总体积为20μl，包括DNA模板（基因组DNA）200ng，Hpa II或Msp I7.5U，EcoR I7.5U，10×buffer2μl，50pmol的HM接头（HpaII//MspI接头）和5pmol EcoR I接头，2.5U T4DNA连接酶，加ddH2O至20μl，37℃12h。
步骤4）中，预扩反应体系为20μl，包括预扩引物各20pmol，Taq DNA酶1U，dNTPs4pmol，10×Taq缓冲液(含Mg2+33pmol)2.2μl，稀释10倍的连接产物1μl，加ddH2O至20μl；预扩反应程序：94℃30s，94℃30s，56℃30s，72℃80s，30个循环，72℃5mim，4℃保存备用。
步骤5）中，筛选扩增反应体系为20μl，包括筛选引物各30pmol，Taq DNA酶1U，dNTPs4pmol，5×Taq buffer（含Mg2+30pmol）4.0μl，稀释10倍的预扩产物3μl，加ddH2O至20μl；筛选扩增反应程序为：94℃30s，94℃30s，65℃（每循环降低0.7℃）30s，72℃1min，13个循环，94℃30s，56℃30s，72℃1min，30个循环，72℃5min。
步骤6）中，筛选扩增产物，94℃5min，采用1900V恒压进行7％聚丙烯酰胺凝胶电泳1.5h，银染。甲酰胺变性液的配方在《分子克隆试验指南》中有其详细配置方法。
步骤7）中，对聚丙烯酰胺凝胶上多态性DNA片段进行切胶回收，以此为模板进行选择性PCR扩增,再通过琼脂糖凝胶电泳得到目的条带。使用北京博大泰恒生物技术有限责任公司小分子量DNA片段高效快速纯化回收试剂盒（High Yield Nucleic Acid Purification Kit For Small DNA Fragments）进行DNA纯化回收。
步骤8）具体包括：
（1）纯化片段与克隆载体的连接反应：
采用TaKaRa公司的pMD-18T simple Vector克隆目的DNA分子，参考说明书，连接反应体系与程序稍有改进，具体为：反应体系（5μl）：2.2μl纯化回收的PCR产物，0.3μl pMD-18Simple Vector，2.5μl Solution I。反应条件16℃30min；4℃过夜。
（2）大肠杆菌转化：将新鲜制备或-70℃冻存的大肠杆TOP10感受态细胞在冰上融化；取5μl纯化片段与克隆载体的连接产物，加入到100μl感受态细胞中，并轻轻混匀，冰浴30min左右；42℃水浴中热击90sec，迅速置于冰上3～5min；加入800μl LB液体培养基，37℃，100rmp摇菌1h；4000rmp离心3min，吸掉上层800μl培养基，混匀剩余菌液；将菌液涂抹于含有Amp的LB筛选培养板上，37℃倒置培养过夜。
（3）阳性克隆筛选及测序分析：从筛选培养板上挑选单菌落接种于LB液体培养基中，37℃，250rmp摇菌过夜；直接以培养过夜的菌液为模板进行重组转化子的PCR检测，反应体系为20μl，包括筛选扩增引物各30pmol，Taq DNA酶1U，dNTPs4pmol，5×Taq buffer(含Mg2+30pmol)4.0μl，稀释10倍的预扩增产物3μl，加ddH2O至20μl；筛选扩增反应程序为：94℃30s，94℃30s，65℃（每循环降低0.7℃）30s，72℃1min，13个循环，94℃30s，56℃30s，72℃1min，30个循环，72℃5min，得到多条目的DNA片段序列。
（4）通过PCR测序，得到MS1-MS10的核苷酸序列。
另外，图1示出了杨树MSAP技术筛选部分扩增结果，从图1中可以看出本发明的杨树DNA甲基化分析可以获得的扩增条带数多、多态性丰富，染色结果清晰、分辨率高、可重复性强，在不需要预知被测DNA序列信息的情况下，便可在全基因组范围检测DNA甲基化情况，在杨树遗传育种和基因组研究中具有广泛的应用前景。
图2示出了MS2通过回收克隆得到的DNA差异位点核甘酸序列在基因中的位置。红色代表通过双酶切得到的差异条带，黄色代表甲基化修饰的CCGG位点。绿色代表5`UTR、蓝色代表外显子、粉色代表3`UTR等基因结构。
综上，本发明的MSAP分子标记具有多态性高、成本低廉、甲基化位点明确的优点，在无需预先知道DNA序列条件下，便可对全基因组范围内的甲基化程度进行解析。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
。
Claims (9)
1.一种筛选抗逆杨树的分子标记，其特征在于，所述分子标记为采用MSAP法检测的分子标记，所述分子标记包括碱基序列为SEQ ID NO.1的MS1，SEQ ID NO.2的MS2，SEQ IDNO.3的MS3，SEQ ID NO.4的MS4，SEQ ID NO.5的MS5，SEQ ID NO.6的MS6，SEQID NO.7的MS7，SEQ ID NO.8的MS8，SEQ ID NO.9的MS9，SEQ ID NO.10的MS10。
2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，待筛选杨树中能够检测到所述分子标记的植株的抗逆性强于检测不到所述分子标记的植株。
3.一种筛选抗逆杨树的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，提取待筛选毛白杨的基因组DNA；
S2，采用MSAP法测定所述待筛选毛白杨的基因组DNA中是否含有碱基序列为SEQID NO.1的MS1，SEQ ID NO.2的MS2，SEQ ID NO.3的MS3，SEQ ID NO.4的MS4，SEQ ID NO.5的MS5，SEQ ID NO.6的MS6，SEQ ID NO.7的MS7，SEQ ID NO.8的MS8，SEQ ID NO.9的MS9，SEQ ID NO.10的MS10的分子标记；
S3，根据所述步骤S2中的测定结果判断所述待筛选毛白杨的抗逆性。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，待筛选杨树中能够检测到所述分子标记的植株的抗逆性强于检测不到所述分子标记的植株。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，MSAP法所用的EcoRI接头的序列为SEQ IDNO：11和SEQ ID NO：12，HpaII/MspI接头的序列为SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14，EcoRI预扩增引物的序列为SEQ ID NO：15，HpaII/MspI预扩增引物的序列为SEQ IDNO：16，筛选引物序列为SEQ ID NO：17～20。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述S2中进行MSAP法测定时的双酶切连接反应体系的总体积为20μl，包括所述基因组DNA200ng，Hpa II/Msp I7.5U，EcoR I7.5U，10×缓冲液2μl，50pmol的HpaII/MspI接头和5pmol EcoR I接头，T4DNA连接酶2.5U，加ddH2O至20μl，37℃保温12h。
7.一种筛选抗逆杨树的试剂盒，其特征在于，包括采用MSAP法检测权利要求1中所述的分子标记时的EcoRI接头的序列为SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12，HpaII/MspI接头的序列为SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14，EcoRI预扩增引物的序列为SEQ ID NO：15，HpaII/MspI预扩增引物的序列为SEQ ID NO：16，筛选引物序列为SEQ ID NO：17～20。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，进一步包括PCR扩增试剂，所述扩增试剂包括PCR扩增缓冲液，25mmoll-1MgCl2，10mmoll-1dNTP，Taq DNA聚合酶和双蒸水。
9.碱基序列为SEQ ID NO.1的MS1，SEQ ID NO.2的MS2，SEQ ID NO.3的MS3，SEQ IDNO.4的MS4，SEQ ID NO.5的MS5，SEQ ID NO.6的MS6，SEQ ID NO.7的MS7，SEQID NO.8的MS8，SEQ ID NO.9的MS9，SEQ ID NO.10的MS10的MSAP分子标记在杨树分子标记辅助选择育种中的应用。
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