CN104271738B - 特性改善的内切葡聚糖酶 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及热稳定性内切葡聚糖酶，具体地，涉及包括与SEQ.ID NO.:2具有至少96％的同一性的氨基酸序列的具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质，以及属于GH7类并表现出活性热稳定化的具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质。

Description

特性改善的内切葡聚糖酶
背景技术
纤维素是植物材料的主要成分。它是植物结构完整性的基础，并且常常发现于由纤维素、半纤维素和木质素组成的木质纤维素基质中。采用纤维素的应用利用其结构上的特性(纤维、纺织品、纸等)或者其碳水化合物性质，产生D-葡萄糖、纤维二糖和/或纤维素低聚物。
木质纤维素很容易获自农业和林业，包括来自谷类、玉米、甘蔗、甜菜、木材等的副产品流。在不久的将来，对于其木质纤维素含量和产率经过优化的植物(“能源作物”)将可能作为重要的资源作出贡献。
纤维素酶包括在结构上和功能上不同种类的作用于纤维素的糖原水解酶。纤维素酶发现于细菌、古细菌(archea)、真菌和植物中。其对于在纤维素聚合物或低聚物中存在的糖苷键具有共同的水解切割活性，在底物特异性、作用方式和包括持续性(processivity)、pH和温度最适条件的酶参数方面有所不同。大多数纤维素酶作用于两个葡萄糖部分之间的β-1,4-键。但是，木质纤维素中发现的其他键也可以被水解。纤维素酶可以通过其作用方式细分成内切酶(endo-enzyme)和外切酶(exo-enzyme)。内切葡聚糖酶向纤维素聚合物中引入随机切割，从而降低聚合度。外切酶例如纤维二糖水解酶以连续作用方式工作，从聚合物的还原或非还原端释放出纤维二糖(D-葡萄糖-β-1,4-D-吡喃葡糖苷)。
其中CAZY数据库[Cantarel BL,Coutinho PM,Rancurel C,Bernard T,LombardV,Henrissat B(2009)The Carbohydrate-Active EnZymes database(CAZy):an expertresource for Glycogenomics.(碳水化合物活性酶数据库(CAZy)：糖基因组学专业资源)Nucleic Acids Res 37:D233-238PMID:18838391]保存有大量已知的葡糖水解酶包括纤维素降解酶(即纤维素酶)。在该数据库中，根据结构元素将酶分类成不同的GH-种类。若干GH种类包括内切葡聚糖酶，具体地，类别GH5、GH7、GH9、GH12、GH16、GH45、GH48、GH61和GH74。尽管一些GH种类中具有高度的多样性，一个GH种类的成员常常具有类似的物理和酶参数。这使得对于某个GH种类的成员来说可能进行概述，例如底物特异性、pH范围、稳定性或催化效率。
降解纤维素的微生物常常产生和分泌纤维素酶的复杂混合物。例如，在里氏木霉(Trichoderma reesei)的分泌蛋白质组(secretome)中，7种内切葡聚糖酶已经鉴别为属于6个不同的GH种类(Cel5A、Cel7B、Cel12A、Cel45A、Cel61A、Cel61B、Cel74A)。不同的内切葡聚糖酶表现出一特性范围(Karlsson J,Siika-aho M,Tenkanen M,Tjerneld F.Enzymaticproperties of thelow molecular mass endoglucanases Cel12A(EG III)and Cel45A(EG V)ofTrichoderma reesei.(里氏木霉的低分子量内切葡聚糖酶Cel12A(EG III)和Cel45A(EG V)的酶特性)J Biotechnol.2002Oct 9；99(1):63-78.PubMed PMID:12；Karlsson J,Momcilovic D,Wittgren B,Schülein M,Tjerneld F,BrinkmalmG.Enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose hydrolyzed by theendoglucanasesCel5A,Cel7B,and Cel45A from Humicola insolens and Cel7B,Cel12Aand Cel45Acore from Trichoderma reesei.(通过来自特异腐质霉的内切葡聚糖酶Cel5A、Cel7B和Cel45A和来自里氏木霉的Cel7B、Cel12A进而Cel45Acore水解的羧甲基纤维素的酶降解)Biopolymers.2002Jan；63(1):32-40.PubMed PMID:11754346.)。人们认为两种主要的内切葡聚糖酶EGI(Cel7B，GH7)和EGII(Cel5A)是其活性最强的酶。
纤维素分解酶的协同活性使得可以有效地破坏复杂底物(B.Henrissat,H.Driguez,C.Viet&M.Schülein:Synergism of Cellulases from Trichoderma reeseiin the Degradation of Cellulose(在纤维素降解中来自里氏木霉的纤维素酶的协同作用)；Nature Biotechnology 3,722-726(1985)doi:10.1038/nbt0885-722)，并且阻止了在水解效率需要同时保持在最高水平时一结构种类的组分被来自二重的酶所置换(不同EG的不等价性)。被另一GH种类的酶简单置换不总是可能的。通常来说，与GH7家族的内切葡聚糖酶相比较，来自GH5家族的内切葡聚糖酶成员(包括来自嗜热菌的EG)表现出更高的热稳定性；然而，热稳定性GH7家族蛋白质的应用常常因其高水解速率而具有优势。
报道了许多内切葡聚糖酶的应用，一部分复杂酶混合物报道为单一的酶活性。纤维素酶对于制造纤维素衍生的生物燃料来说非常重要。在切割之后，任选地，进行化学和/或物理处理，将木质纤维素与纤维素酶一起孵育，以释放出糖单体，对其进行进一步处理。需要对处理条件进行调适，以使水解速率、产率和/或稳定性最优化。在这些处理中，较高的温度常常是优选的，但这需要热稳定性更高的酶。同时糖化和水解(SSF)处理要求在发酵条件下有活性的纤维素分解酶。联合生物处理(CBP)进一步要求酶特性的组合，以便在单一步骤中完成酶产生、糖化和发酵。
内切葡聚糖酶的其他应用仅致力于纤维素纤维的部分水解或修饰(纤维修饰、生物抛光、生物石磨(stoning)等)。因此，所用的内切葡聚糖酶需要在升高的温度、极端(例如碱性、酸性)pH和化学条件(例如，洗衣、清洁剂、蛋白酶、溶剂等)下工作和/或稳定。对于这些应用，纤维损伤必须得以最小化。内切葡聚糖酶还可以在制浆过程中(纸浆和纸的制造)有助于从纤维材料中分离出非纤维素部分，或者改善工艺物料流的流变学。洗涤剂稳定性和蛋白酶耐性可以视作是酶结构稳定性增加的结果，这也是与热稳定增加有关的特性。内切葡聚糖酶还可以在食品和饲料加工(啤酒厂、葡糖酒制造、自滤饼回收油、烘焙、面团制备)中加以应用。灭菌或巴氏杀菌常常要求更高的温度。对于缩短处理时间来说，内切葡聚糖酶的操作稳定性是有利的。
来自木霉(Trichoderma)属的真菌(无性型肉座菌(anamorph Hypocrea))的内切葡聚糖酶I蛋白质(Cel7B)表现出高度的同一性，被视作是嗜中温的。来自GH家族7的内切葡聚糖酶中最稳定的成员据报道是来自特异腐质霉(Cel7B)和尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)(eg1)的天然酶(US5912157)。根据该报道，EGI在60℃以上不表现活性。因此，在该领域对于提供热稳定性更高的来自GH家族7的内切葡聚糖酶存在需求。
据报道，一些内切葡聚糖酶可以在较高的温度下被热灭活(Dominguez JM,AcebalC,Jimenez J,de la Mata I,Macarron R,Castillon MP.Mechanisms ofthermoinactivation of endoglucanase I from Trichoderma reesei QM 9414.(来自里氏木霉QM 9414的内切葡聚糖酶I的热灭活机制)Biochem J.1992Oct 15；287(Pt 2):583-8.)。所述研究的作者还尝试了对热灭活的内切葡聚糖酶的再活化，但这要求涉及8M尿素和其他试剂的苛刻条件。描述为生产性再折叠(productive refolding)的效应在内切葡聚糖酶以外的其他蛋白质中得以表现[Zhang N,Suen WC,Windsor W,Xiao L,Madison V,ZaksA.Improving tolerance of Candida antarctica lipase B towards irreversiblethermal inactivation through directed evolution.(通过定向进化提高南极假丝酵母脂肪酶对于不可逆热灭活的耐受性)Protein Eng.2003Aug；16(8):599-605.]，但是据发明者所知，其在内切葡聚糖酶特别是GH7内切葡聚糖酶中并未表现出。在本领域中据信热灭活的内切葡聚糖酶在纤维素的工业分解中几乎没有用处。另一方面，对于内切葡聚糖酶特别是真菌来源的酶，提高的热稳定性常常是所需的。目前，仅仅报道有GH12和GH45内切葡聚糖酶的一些改进。已经报道有来自GH5和GH48结构折叠的热稳定性内切葡聚糖酶。所述内切葡聚糖酶在其动力学性质和底物优先方面大大不同于GH7类的内切葡聚糖酶。
总之，对于具有优异温度特性的持续内切葡聚糖酶特别是GH7家族的酶存在需求。而且，由其表达宿主实现良好的生产力将是合乎需求的。许多工业关联过程在苛刻的条件和升高的温度下进行这一事实进一步支持了该需求。本发明要解决的问题是提供改良的内切葡聚糖酶，特别是热性能提高的内切葡聚糖酶。本发明致力并解决的其他问题从以下部分来看将是显而易见的。
发明内容
本发明涉及热稳定性内切葡聚糖酶蛋白质(多肽)。解决方案提供如下：
1.一种具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质，其属于GH7类，并表现出活性热稳定化。
2.一种具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质，其包括与SEQ.ID NO.:2具有至少96％、优选至少97％、更优选至少98％、再更优选至少99％、例如至少99.5％的同一性的氨基酸序列。
优选地，本发明的内切葡聚糖酶蛋白质在60℃下表现出大于95％的残余活性。
本发明的其他方面是编码所述多肽的核酸，以及包含在生物体中的载体骨架中的包括这些多核苷酸的表达构建体。本发明的另一方面是本发明的蛋白质用于处理木质纤维素和纤维素材料的应用。具体地，木质纤维素进料在联合的、部分联合的或非联合的处理中的糖化，或者在食品、饲料、纤维素纤维或清洁应用中的处理。
本发明还涉及用于产生本发明的蛋白质的生产/表达生物体，并涉及出于蛋白质生产目的的这些生物体的培养方法。生物体选自包括微生物(真菌、细菌或古细菌)或植物的生物体。
附图说明
图1：SDS-凝胶显示了分泌到上清液中的Seq.ID NO 8–Seq.ID NO 2变体蛋白质的表达。所表达蛋白质的条带在75至100kDa之间是可见的。
图2：里氏木霉表达质粒。在TrCBHI启动子的控制下将成熟内切葡聚糖酶基因的DNA编码序列融合克隆至TrCBHI信号肽序列。SwaI/SbfI可切除表达盒含有用于转化体选择的潮霉素抗性盒。
图3：与天然GH7蛋白质[2]相比较表现出温度稳定性增强的内切葡聚糖酶变体([6]和[3])以及温度稳定性及活性热稳定化增强的变体[1]、[4]、[5]、[7]、[8]、[9]和[10]。
图4：在Tecan Infinite M200酶标仪上将200μl份的碱性4-甲基伞形酮溶液校正至荧光读数。通过将440mg 4-甲基伞形酮(Sigma Aldrich Cat.Nr.69580)溶解在250ml的0.5M碳酸钠溶液中，制备10mM溶液。在0.5M碳酸钠中制备连续溶液。在360nm/454nm下以增益50测量荧光强度。
图5：与Seq.ID NO:4相比较，Seq.ID NO:13的热稳定化。
图6：在70℃下测定Seq.ID NO:14相比较于Seq.ID NO:4的半衰期(实施例7)。
具体实施方式
定义
“热稳定性”是用于描述根据本发明的具有内切葡聚糖酶活性的特定蛋白质的固有特性的术语。
“活性热稳定化”是用于描述根据本发明的具有内切葡聚糖酶活性的特定蛋白质的固有特性的术语。
热稳定性和/或活性热稳定化的测定：热稳定性和活性热稳定化测定如下。
1)如实施例2中所述，在毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达酶。任选地对酶进行提纯。
2)调节酶的浓度。
通过将提纯的酶或毕赤酵母培养物上清液在醋酸钠缓冲液(50mM，pH 5)中稀释至可适用的工作浓度，制成浓度适当的酶溶液。对于可适用工作浓度的确定，在醋酸钠缓冲液中制备上述步骤1中)得到的酶的连续稀释液，如实施例4中所述，在温度梯度下对10μl等份进行测试。可适用的工作浓度定义为以下浓度：其导致在Tecan Infinite M200酶标仪上在增益50下荧光信号在5,000至15,000之间，或者是在如实施例4中所述孵育之后5.4μM至19μM 4-甲基伞形酮的等同浓度。
3)如实施例4中所述，测定底物转化能力，其不同之处在于，将10μl等份的培养物上清液用10μl等份如步骤2)中定义的可适用工作浓度的酶溶液代替。
4)通过将所有的相对荧光单位(rfu)读数除以温度梯度内的最大rfu读数对测量结果进行归一化，得到在各个测试温度下测定的各蛋白质的相对底物转化率。
5)将相对底物转化率对测定的反应温度进行作图。
6)如(a)中所述测定温度稳定性，或者如下文(b)中所述测定活性热稳定化。
a.测定温度稳定性：如果相对底物转化率在60℃下为0.5或更高，优选0.7或更高，更优选0.9或更高，例如0.95或更高，蛋白质则被表征为温度稳定的。
测定活性热稳定化：对步骤5)中得到的图进行分析，在相对底物转化率上存在有平稳期，其低于最大水平(1)但至少高达0.15。
平稳期定义为相对底物转化率的水平在至少5℃的温度范围内，优选70至75℃(即，在所述温度范围内围绕平均值+/-0.1内)，基本上不变化。
b.不表现出活性热稳定化的变体相对底物转化率为0至低于0.15，通常为大约0.1。无意拘泥于任何特定理论，据信测得的相对底物转化率通常为大约0.1(而不是0.0，如在给定温度下对于无活性的酶所预计)是因为热循环仪中和/或样品混合物的处理过程中有限的温度斜坡所致。
热特性是通常用来指酶在更高温度(例如，60℃或更高)下的特性的术语。该术语可以包括上述的“温度稳定性”和上述“活性热稳定化”中的一个或二者。
内切葡聚糖酶活性在本发明的上下文中定义如下：通过蛋白质经由极性分子如水或具有其羟基或巯基或氨基官能性的有机分子的亲核进攻催化加速β-1,4-糖苷键的断裂。该定义还包括具有经由β-1,4-糖苷键与葡萄糖、纤维二糖或乳糖连接的非碳水化合物分子的合成分子的断裂。由内切葡聚糖酶催化的示例反应由Brenda Database(http://www.brenda-enzymes.info)列出(Release 2012.1(January 2012)；Enzyme data andmetabolic information:BRENDA,a resource for research in biology,biochemistry,and medicine Schomburg,I.,Hofmann,O.,Baensch,C.,Chang,A.,Schomburg,D.GeneFunct.Dis.3-4,109-18(2000))。
残余活性定义为与不经孵育步骤的活性相比较，将酶在指定(升高的)温度下孵育指定时间之后恢复的酶活性。确定残余活性的方案在实施例4中给出。
与SEQ ID NO:2的序列比对：任何第二GH7内切葡聚糖酶序列与亲代序列(SEQ IDNO 2)的成对比对均使用ClustalW算法进行(Larkin M.A.,Blackshields G.,Brown N.P.,Chenna R.,McGettigan P.A.,McWilliam H.,Valentin F.,Wallace I.M.,Wilm A.,LopezR.,Thompson J.D.,Gibson T.J.和Higgins D.G.(2007)ClustalW and ClustalX version2.Bioinformatics 200723(21):2947-2948)。成对比对将显示出SEQ ID NO:2的位置数。所述的位置数可以用于参照，例如，当提到，例如，在第二GH7内切葡聚糖酶中与SEQ ID NO:2的第2位对应的残基发生突变。对于蛋白质变体的描述来说，作为氨基酸编号和蛋白质变体命名的惯例，亲代蛋白质序列SEQ ID NO:2内的氨基酸被称作位置数1或S1或丝氨酸1。所有氨基酸的编号将根据其在SEQ ID NO:2中给出的亲代序列中相对于该位置数1的位置。
序列同一性：对于序列同一性的确定，使用来自Life Technology Corporation售出的VectorNTI软件包中的软件AlignX，使用标准设置(空位开放罚分10，空位扩展罚分0.1)。
蛋白质变体是其氨基酸序列与该亲代蛋白质在一个或多个位置处不同的多肽，其中差别可能在于一个氨基酸残基被另一个取代、单个或若干个氨基酸残基的缺失或者额外的氨基酸残基或一段氨基酸残基插入到亲代序列中。通过将点突变引入到编码核酸中，可以在指定的位置处对蛋白质加以修饰。在本文中术语修饰的蛋白质序列总是指由相应地修饰的核酸在体外或通过适当的表达宿主经由转录和翻译以及任选地翻译后修饰和易位过程而得到的蛋白质。用于产生这些蛋白质变体的方法是本领域公知的，因而不受限定，其例子包括随机或定点诱变、定点饱和诱变、基于PCR的片段组装、DNA改组、体外或体内同源重组以及基于化学DNA合成的基因合成方法。
氨基酸、肽、核苷酸和核酸的命名根据IUPAC进行。通常，在本申请文件中氨基酸根据单字母符号命名。
单个氨基酸的交换描述如下：命名原始氨基酸的单字母符号，之后是其位置编号以及取代的氨基酸的单字母符号，即，1位上的谷氨酰胺变成在该位置上的亮氨酸被称作“Q1L”。对于单个位置从序列中的缺失，取代的氨基酸的符号被三字母缩写“del”代替，从而3位上丙氨酸的缺失将被称作“A3del”。插入的额外的氨基酸接受在前位置的编号，其延伸有相对于其与其插入点的距离依字母顺序的小写字母。因此，在3位之后插入两个色氨酸被称作“3aW,3bW”。将未翻译密码子TAA、TGA和TAG引入到核酸序列中在氨基酸序列中指示为“*”，因此在氨基酸序列的4位上引入终止密码子称作“G4*”。多个突变由加号或斜杠或逗号分开。例如，分别在20和21位上将丙氨酸和谷氨酸替换成甘氨酸和丝氨酸的两个突变记作“A20G+E21S”或“A20G/E21S”“A20G,E21S”。当指定位置处的氨基酸残基被两个或更多个可选的氨基酸残基替换时，这些残基以逗号或斜线分开。例如，30位的丙氨酸被甘氨酸或谷氨酸替换记作“A20G,E”或“A20G/E”，或者“A20G,A20E”。当在本文中识别出适合修饰的位置而没有指出任何具体的修饰时，应当理解成任何氨基酸残基均可以替换在该位置处存在的氨基酸残基。因此，例如，当提到20位上的丙氨酸修饰而没有指明时，应当理解成该氨基酸可以缺失或替换成任何其他的氨基酸残基(即，R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V中的任一个)。
术语“类似的突变”或“类似的替换”是指如下氨基酸突变：其中第一突变(关于亲代序列，例如，如SEQ ID NO:2)中的氨基酸残基再次通过第二突变被取代，并且通过第二突变引入的氨基酸残基与通过第一突变已引入的氨基酸残基具有类似的性质。在本上下文中类似是指氨基酸具有类似的化学性质。例如，如果特定位置处的第一突变导致非脂肪族氨基酸残基(例如Ser)被脂肪族氨基酸残基(例如Leu)替换，在相同位置处通过第二替换的方式用不同的脂肪族氨基酸替换(例如Ile或VaI)则被称作类似的突变。其他的化学性质包括残基大小、疏水性、极性、电荷、pK值等。因此，类似的突变可以包括如下替换，例如，碱性替换成碱性、酸性替换成酸性、极性替换成极性等。出于结构上的理由，由此衍生的氨基酸的集合可能是保守的。这些集合可以以维恩图的形式描述(Livingstone CD.和Barton GJ.(1993)"Protein sequence alignments:a strategy for the hierarchical analysisof residue conservation"(蛋白质序列比对：残基保护性分类分析策略)Comput.ApplBiosci.9:745-756；Taylor W.R.(1986)"The classification of amino acidconservation"(氨基酸保守性分类)J.Theor.Biol.119；205-218)。相似的替换可以根据，例如，以下的氨基酸分组来进行：疏水的：F W Y H K M I L V A G；芳香族：F W Y H；脂肪族：I L V；极性：W Y H K R E D C S T N；带电的H K R E D；带正电：H K R；带负电：E D。
表达构建体在本文中定义为包括所有在宿主细胞中建立所包含的开放阅读框(ORF)的表达所需的序列元件的DNA序列，其包括用于转录起始(启动子)、终止和调节的序列、用于翻译起始的位点、用于稳定地复制并整合到宿主基因组中的区域以及可选择的遗传标记物。开放阅读框任选地由编码目标蛋白质的核酸与其他元件的融合物组成，特别是分泌信号、纤维素结合结构域、用于提高表达水平或促进从发酵肉汤中提纯或分离的TAG。因此功能设定可以是已经建立好的，或者通过在宿主细胞中进行排列(整合等)事件而达到。在优选的实施方式中，表达构建体包括与开放阅读框功能性连接的启动子，然后是任选的终止序列。优选的启动子是中至高强度启动子，在发酵条件下在所选择的宿主中发挥功能。为进行说明，给出如下优选启动子的例子：
●细菌(例如，大肠杆菌(Escherichia coli))：lac、tac、trp、tet、T3、T7、CP7、CP21、araBAD
●酵母(例如，毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces))：AOXI、AOXII、FMDH、GAP、TEF、PFK1、FBA1、PGK1、ADH1、ADH2、TDH3
真菌(例如，木霉属(Trichoderma))：CBHI、CBHII、EGI、PGK、BGL、XYL1、XYL2
用于异源表达的适当启动子的其他例子在文献中得以报道。表达构建体的其他部分是引入的核酸和可选择标记物的稳定继承所需的遗传元件，其包括有关抗生素抗性的遗传元件或补充宿主株的定义的营养缺陷型的遗传元件。
本发明所有核酸的序列，或编码本发明的多肽/蛋白质的核酸的序列，均可以朝向在选择的表达宿主中最优的密码子使用加以调节。对于特定表达宿主来说具有优化/最优的密码子选择的核酸也是本发明的一部分。生产宿主在本文中与表达宿主同义使用，其是指在培养时产生本发明的蛋白质的生物体。在一实施方式中，本发明的蛋白质并不是由生产宿主分泌；但是，在优选的实施方式中，其被分泌至周围的培养基中。这样的微生物优选地选自细菌、古细菌、酵母、真菌和/或植物界的范畴。一优选的表达宿主是毕赤酵母(Pichia pastoris)。
“细菌”在本文中是指原核生物。在优选的实施方式中，细菌是真细菌，再更优选地其选自埃希氏杆菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、克雷伯氏杆菌属(Klebsiella)、链霉菌属(Streptomyces)、乳球菌属(Lactococcus)和乳酸菌属(Lactobacillus)，特别是大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、植生克雷伯菌(Klebsiella planticola)、变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)。
“酵母”在本文中是指所有在其生命周期中表现出单细胞营养态的低等真核生物。其具体地包括酵母菌(Saccharomycetes)类生物体，特别是酵母属(Saccharomyces)、管囊酵母属(Pachysolen)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)、耶氏酵母属(Yarrowina)、Debaromyces属、克鲁维酵母属(Klyveromyces)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)。
“丝状真菌”或“真菌”在本文中是指所有在其生命周期中在至少一状态下表现出菌丝生长的低等真核生物。其具体包括子囊菌门和担子菌门的生物体，特别是木霉属(Trichoderma)、踝节菌属(Talaromyces)、曲霉属(Aspergillus)、青霉菌属(Penicillium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、革菌属(Phanerochaete)、热子囊菌属(Thermoascus)、伞菌属(Agaricus)、Pleutrus属、耙齿菌属(Irpex)的生物体。
“植物”在本文中是指所有属于植物界的真核生物。在优选的实施方式中，表达宿主选自以下属的植物：玉蜀黍属(Zea)、小麦属(Triticum)、大麦属(Hordeum)、黑麦属(Secale)、芒草属(Miscanthus)、甘蔗属(Saccharum)、茄属(Solanum)、甘薯属(Ipomea)、木薯(Manihot)、向日葵属(Helianthus)、山茶属(Camellia)、Aspalathus、桉属(Eucalyptus)、甜菜属(Beta)、山毛榉属(Fagus)、松科(Pinaceae)、桦木科(Betulaceae)、锦葵科(Malvaceae)、柏科(Cupressaceae)、蔷薇科(Rosaceae)、棕榈科(Arecaceae)的成员。
酶制剂是指任何含有酶作为部分的液体或固体组合物。其他组分优选包括水、多元醇、糖、洗涤剂、缓冲剂、还原剂、无机盐、固体载体、防腐剂，特别是具有抗菌或抗真菌活性的防腐剂，染料、芳香剂和/或香料。
内切葡聚糖酶的用途，例如，特别是本发明的内切葡聚糖酶的用途(非限定性例子)：用于产生单糖、二糖或寡糖的木质纤维素进料的水解；制造纸浆和纸；用于纤维、纱线或粗斜纹棉布的改良或通用处理的纺织品应用；工业清洁应用或家庭护理应用；在食品和饲料领域中营养素的释放、制造率提高或改善面团特性。
发明详述
本发明涉及具有优异特性的GH7内切葡聚糖酶。更具体地，本发明涉及热稳定的内切葡聚糖酶蛋白质(多肽)。解决方案提供如下：
1.一种具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质，其属于GH7类，并表现出活性热稳定化。
2.一种具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质，其包括与SEQ.ID NO.:2具有至少96％、优选至少97％、更优选至少98％、再更优选至少99％、例如至少99.5％的同一性的氨基酸序列。
以下对这两个实施方式加以详述。
温度稳定性如上文定义。测定温度稳定性的例子在实施例4中给出。GH7类的内切葡聚糖酶列于表1中(EC 3.2.1.4)。除了在特定权利要求中通过特定序列同一性限制排除以外，本发明涉及GH7类所有内切葡聚糖酶的变体，其中包括表1所示者的变体。
表1：已知的GH7类内切葡聚糖酶。
现在将详细描述第一方面和第二方面。
第一方面：属于GH7类并表现出活性热稳定化的具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质
在本发明的第一个方面，蛋白质具有内切葡聚糖酶活性和优异的热特性。优异的热特性定义为温度稳定性，其表现为在60℃或更高温度下孵育时相对底物转化活性高于90％(例如高于95％)，以及活性热稳定化。活性热稳定化在以下描述。
本发明的发明人出乎意料地发现，表现出活性热稳定化的蛋白质也表现出温度稳定性。
这一点通过以下例子示出。发明人生成一种GH7内切葡聚糖酶，其为如下SEQ IDNO:4的特定变体(即，SEQ ID NO:2给出者)。通过随机诱变(易错PCR，如实施例1中所述)得到编码SEQ ID NO:2的多肽的核酸。随机诱变的方法是本领域公知的。而且，现在发明人已经在此公开了由SEQ ID NO:2编码的多肽的适宜性，各个编码该蛋白质的核酸可以由本领域技术人员直接制备。其方法包括，例如，基因合成或定点诱变，其始于与SEQ ID NO:4具有高度序列同一性(例如，大于90％)的核酸，以及通过定点诱变(在一个或数个步骤中)引入突变，以得到编码SEQ ID NO:2的蛋白质的核酸。通过诱变可以得到编码SEQ ID NO.2的核酸的起始序列是来自Hypocrea pseudokonigii的Cel7B，其在此给出为SEQ ID NO.4(基因库编号ABM90986)。
本发明的发明人对SEQ ID NO:2的蛋白质的热稳定性进行了表征。从图3可以看出，该蛋白质解决了本发明的技术问题，即，具有比其亲代蛋白质(SEQ ID NO:4)更高的温度稳定性。这一点从以下事实很明显：例如，在例如60℃下相对底物转化率仍接近其最大值，而SEQ ID NO:4的蛋白质的相对底物转化率在所述温度下位于非常低的水平(参见图3)。
出人意料地，发明人发现，在再更高的温度下，例如，在68-76℃的范围内(包括70-74℃)，相对底物转化率不会随着温度升高而显著降低。这一点与SEQ ID NO:4的亲代蛋白质的特性形成鲜明对比，上述亲代蛋白质在制图中随着温度升高表现出相对底物转化率的降低，该降低不经任何中间平稳期降至本底水平。据信SEQ ID NO:4的蛋白质在暴露于更高的温度例如60℃或更高，例如70℃或更高时，不再以其活性状态存在。无意拘泥于任何特定理论，据信这是由于蛋白质的热诱导去折叠(或者非活性构象的折叠)导致。无意拘泥于任何特定理论，高温下的活性丧失效果在下文中将称作热诱导去折叠。热诱导去折叠是众所周知的几乎所有类型的蛋白质特别是酶在较高温度下的现象。因此对SEQ ID NO:4的蛋白质观察到的热诱导去折叠符合技术人员的预料。SEQ ID NO:4的蛋白质不是本发明的一部分。
对比鲜明的是，本发明该方面的蛋白质在较高的温度下，例如，在68-76℃(包括70-74℃)的范围内表现出平稳期。该平稳期低于最大相对底物转化率，但高于本底相对底物转化率。无意拘泥于任何特定理论，本发明的发明人得到以下结论：本发明的蛋白质在这些较高的温度下以与在较低温度下(例如46℃)的折叠状态不同的状态存在，但该蛋白质仍具有酶活性。因此，可以推测，在较高的温度下，本发明的该蛋白质发生活性再折叠，即再折叠得到另一活性状态(由此使得能够在较高的温度下观察到相对底物转化)。发明人因此将该特性称作“活性热稳定化”，其也在上文定义部分中加以定义。
因此，通过温度稳定性，本发明的蛋白质解决了本发明的技术问题。而且，基于本发明的公开内容，技术人员得以指导识别出根据本发明该第一方面的其他蛋白质。
这些其他蛋白质可以如下发现。首先，可以向GH7家族的任何内切葡聚糖酶中，特别是表1中所指定者中引入任何类型的突变(包括一个或若干个氨基酸残基的缺失、插入或替换，随机的或定向的)，以得到突变蛋白质或其文库。可以对由此得到的突变蛋白质或其文库进行上述活性热稳定化的筛选。以上表1中给出的已知蛋白质不是本发明的一部分，但其任何表现出活性热稳定化的突变体包括在本发明内。
重要的是，本发明第一方面的所有酶，即表现出上文定义的活性热稳定化的酶，均表现出上文定义的温度稳定性。因此，在第一个方面，活性热稳定化是本发明的问题的解决方案。任何指定的蛋白质是否落入本发明的第一个方面，其可以通过上文给出的活性热稳定化检测进行可靠的测试。
第二方面：具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质，其包括与SEQ.IDNO.:2具有至少96％、优选至少97％、更优选至少98％、再更优选至少99％、例如至少99.5％的同一性的氨基酸序列
在搜寻本发明的问题的第二个解决方案时，发明人进行了始于SEQ ID NO:2的蛋白质的诱变设计。因此，发明人已将诱变，例如点诱变引入到SEQ ID NO:2的蛋白质中(即，通过修饰相关的核酸，如下文所述)。发明人已经发现，许多这样的突变也表现出温度稳定性，因此在第二个方面解决了相关的问题。解决方案的例子在图3中给出。
因此，在第二个方面，本发明涉及具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质，其包括与SEQ.ID NO.:2具有至少96％、优选至少97％、更优选至少98％、再更优选至少99％、例如至少99.5％的同一性的氨基酸序列。该蛋白质可以典型地属于GH7类。
具体地，本发明还提供具有SEQ ID NO:2序列的蛋白质的特定突变体。由此，在一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个)位置处对SEQID NO:2给出的序列进行修饰。这样的修饰可以由替换、缺失、插入等组成。在其具体实施方式中，修饰在于替换。在再更具体的实施方式中，修饰在于在表2、3、4的最左列中一一列举的SEQ ID NO:2的任意一个或多个特定位置处的替换。
尽管在这些任意给定位置处的修饰原则上可以被任意氨基酸残基替换，但优选地，替换是被表2、3、4中任意一个或多个的第4道中给出的氨基酸残基或者被与其类似的氨基酸残基(如上文定义的类似的突变)替换。因此，可以代替所列出者而引入上文定义的类似的突变。实施例5显示了一些这样的突变。引入突变的方法是本领域已知的。示例性的指导可以取自实施例1。换言之，本发明的优选实施方式涉及GH7类内切葡聚糖酶的诱变的优选位置。优选交换的列表在表2第2道中给出。在另一优选的实施方式中，优选的突变选自表3第2道中所列。在本发明另一优选的实施方式中，优选的突变选自表4第2道中所列。也可以将这些优选实施方式中的两种或三种合并，例如，表2中给出的一种或多种优选的交换可以与表3和/或表4中给出的一种或多种优选的交换组合。
表2：关于Seq.ID NO.2的优选的氨基酸交换
表3：关于Seq.ID NO.2的优选的氨基酸交换
表4：关于Seq.ID NO.2的优选的氨基酸交换
本发明的第一个和第二个方面尽管是相同问题的不同解决方案，但并非必需相互排除。因此，本发明涉及满足以上第一个方面和第二个方面二者的条件的蛋白质。重要的是，要认识到第一个方面和第二个方面是提供温度稳定性改善的GH7酶这一问题的另外可选的解决方案。这些方案是独立的(尽管对于一些例子来说有所重合)，因此不需要必需合并。例如，与SEQ ID NO:4的蛋白质(图3中的[2])相比较，在图3中标为[6]的蛋白质表现出温度稳定性，但其并不表现出活性热稳定化。
因此，本发明可以根据以上第一个方面和/或根据以上第二个方面提供不同的酶变体。任何给定的酶是否表现出所需的热特性(温度稳定性和/或活性热稳定化)，其可以容易地通过上述题为“热稳定性和/或活性热稳定化的测定”的测试进行测试。
如上文定义部分所详细给出，以及下文实施例所一一列举，在此简要总结出怎样可以得到所需突变：
●使用clustalW算法对任意GH7内切葡聚糖酶序列与Seq ID NO 2进行成对比对；
●识别GH7内切葡聚糖酶目标序列中相应的位置(第1道)；
●根据第2道或优选第3道中给出的提出的优选交换对GH7内切葡聚糖酶目标序列中相应的位置进行修饰；
●表达修饰的序列，并对表达的蛋白质进行热特性改善的测试。
据信本发明的热稳定性酶在较高的温度下还具有降低的聚结物形成，因此沉淀减少。避免这些沉淀在存在石榴石、斜纹粗棉布或机织材料的情况下特别有优势，并且对于膜反应器的应用特别有优势，降低膜的污垢特性。
包括本发明任意蛋白质的融合蛋白也是本发明的一部分。
本发明的另一方面涉及通过在生产宿主(也称作表达宿主)中通过异源表达来产生本发明的蛋白质。异源表达的方法包括通过转化、转染、杂交或有关核酸(DNA或RNA)转移的等同方法将编码本发明蛋白质的核酸(表达构建体)转移至生产宿主中。在本发明的意义下，转化方法不受具体限制。对于许多种物种已经报道有例子，其包括电穿孔、原生质体转化、化学转化和经由弹道粒子(ballistic particles)转移、微注射、病毒感染、杂交交配或使用天然感受态株或细胞系。优选的生产宿主将本发明的内切葡聚糖酶与其他纤维素酶、半纤维素酶或果胶酶一起共分泌到培养肉汤中。因此，优选地，表达构建体上的编码序列编码本发明的内切葡聚糖酶，其次接于用于从特定宿主菌分泌的信号。这些信号是本领域公知的；例如，在真细菌中，其被称作信号肽。无意拘泥于任何特定理论，这些信号肽共同具有引导蛋白质分泌的能力，特别是以共翻译的方式。优选的表达宿主是里氏木霉。
本发明另一方面是上述的内切葡聚糖酶蛋白质的应用。其包括提纯的、部分提纯的或粗的蛋白质制剂本身或在酶制剂中的应用，以及表达目标蛋白质的整个细胞或生物体的应用。内切葡聚糖酶的应用领域可以见于发明领域部分。如在此所述，热稳定性蛋白质的用途是高度所需的。内切葡聚糖酶酶的优选应用在于酶促木质纤维素转化领域。
本文所公开序列的概述
本文所公开序列(NO：1-16)
SEQ ID NO：1
TCTCTGCAGCCAGGAACTTCTACTCCAGAGGTGCACCCAAAGCTGACCACCTACAAGTGTACCACCTCTGGTGGTTGTGTTGCTCAGAACACCTATGTTGTTCTGGACTGGAACTACAGATGGATCCACGACGCCAACTACAACTCTTGTACCGTGAACGGTGGTGTCAACACTACTCTGTGTCCAGACGAGGCTACTGGTAGCAAGAACTGCTTCATCGAGGGTGTTGACTACGCTGCTTCTGGTGTTACTGCCAATGGTTCTACCTTGACCCTGAACCAGTACATGCCATCTTCCTCTGGCGGTTACACTTCTGTGTCGCCAAGACTGTACTTGTTGGGTCCAGACGGTAAGTACGTTATGCTGAAGCTGAACGGACAGGAGCTGTCTTTTGACGTTGACCTGTCTGCTTTGCCATGTGGAGAGAACGCTTCTCTGTACCTGTCTCAGATGGACGAGAACGGTGGAGCTAACCAGTACAACACCGCCGGTGCTAACTACGGTTCTGGTTACTGTGACGCCCAGTGTCCAGTTCAGACTTGGAGAAACGGAACCCTGAACACTTCTGGCCAGGGATTCTGCTGTAACGAGATGGACATCTTGGAGGGAAACTCTAGAGCTAACGCTCTGACCCCACACTCTTGTAATGCTACCGCTTGTGACTCTGCTGGTTGCGGTTTTAACCCATACCGCTCGGGTTACCCAAACTACTTTGGCCCAGGTGGCACTGTTGACACCTCGAAGCCATTCACCATCATCACCCAGTTCAACACCGACAACGGTTCTCCATCTGGTAACCTGGTGTCGATCACCAGAAAGTACAGACAGAACGGCGTTGACATCCCATCTGCTAAACCAGGTGGCGACACCATTTCGTCTTGTCCATCTGCCTCTACTTACGGTGGATTGGCTACCATGGGAAAGGCTCTGTCCGAGGGAATGGTGCTGATCTTCTCGATCTGGAACGACAACTCGCAGTACATGAACTGGCTGGACTCTGGTGATGCTGGTCCATGTTCTTCTACCGAGGGCAACCCATCTAACATCCTGGCTAACAACCCTGGTACTCACGTGGTGTACTCGAACATTAGATGGGGCGACATTGGTTCTACCACCAACTCTACCGGTGGTAACCCACCACCACCACCTGCATCTTCTACCACCTTCTCGACCGCCAGAAGATCGTCTACCTCCTCTTCTTCTCCATCTTGTATCCAGACTCACTGGGGTCAGTGTGGTGGTATTGGCTACACCGGCTGTAAGACCTGTACCTCTGGAACCACTTGCCAGTACAGCAACGACTACTACTCTCAGTGCCTGTGA
SEQ ID NO：2
SLQPGTSTPEVHPKLTTYKCTTSGGCVAQNTYVVLDWNYRWIHDANYNSCTVNGGVNTTLCPDEATGSKNCFIEGVDYAASGVTANGSTLTLNQYMPSSSGGYTSVSPRLYLLGPDGKYVMLKLNGQELSFDVDLSALPCGENASLYLSQMDENGGANQYNTAGANYGSGYCDAQCPVQTWRNGTLNTSGQGFCCNEMDILEGNSRANALTPHSCNATACDSAGCGFNPYRSGYPNYFGPGGTVDTSKPFTIITQFNTDNGSPSGNLVSITRKYRQNGVDIPSAKPGGDTISSCPSASTYGGLATMGKALSEGMVLIFSIWNDNSQYMNWLDSGDAGPCSSTEGNPSNILANNPGTHVVYSNIRWGDIGSTTNSTGGNPPPPPASSTTFSTARRSSTSSSSPSCIQTHWGQCGGIGYTGCKTCTSGTTCQYSNDYYSQCL＊
SEQ ID NO：3
TCTCAGCAGCCAGGAACTTCTACTCCAGAGGTGCACCCAAAGCTGACCACCTACAAGTGTACCACCTCTGGTGGTTGTGTTGCTCAGGACACCTCTGTTGTTCTGGACTGGAACTACAGATGGATGCACGACGCCAACTACAACTCTTGTACCGTGAACGGTGGTGTCAACACTACTCTGTGTCCAGACGAGGCTACTTGTGGCAAGAACTGCTTCATCGAGGGTGTTGACTACGCTGCTTCTGGTGTTACTGCCTCTGGTTCTACCTTGACCCTGAACCAGTACATGCCATCTTCCTCTGGCGGTTACTCTTCTGTGTCGCCAAGACTGTACTTGTTGGGTCCAGACGGTGAGTACGTTATGCTGAAGCTGAACGGACAGGAGCTGTCTTTTGACGTTGACCTGTCTGCTTTGCCATGTGGAGAGAACGGTTCTCTGTACCTGTCTCAGATGGACGAGAACGGTGGAGCTAACCAGTACAACACCGCCGGTGCTAACTACGGTTCTGGTTACTGTGACGCCCAGTGTCCAGTTCAGACTTGGAGAAACGGAACCCTGAACACTTCTGGCCAGGGATTCTGCTGTAACGAGATGGACATCTTGGAGGGAAACTCTAGAGCTAACGCTCTGACCCCACACTCTTGTACTGCTACCGCTTGTGACTCTGCTGGTTGCGGTTTTAACCCATACGGCTCGGGTTACCCAAACTACTTTGGCCCAGGTGACACTGTTGACACCTCGAAGCCATTCACCATCATCACCCAGTTCAACACCGACAACGGTTCTCCATCTGGTAACCTGGTGTCGATCACCAGAAAGTACAGACAGAACGGCGTTGACATCCCATCTGCTAAACCAGGTGGCGACACCATTTCGTCTTGTCCATCTGCCTCTGCTTACGGTGGATTGGCTACCATGGGAAAGGCTCTGTCCTCTGGAATGGTGCTGATCTTCTCGATCTGGAACGACAACTCGCAGTACATGAACTGGCTGGACTCTGGTTCTGCTGGTCCATGTTCTTCTACCGAGGGCAACCCATCTAACATCCTGGCTAACAACCCTGGTACTCACGTGGTGTACTCGAACATTAGATGGGGCGACATTGGTTCTACCACCAACTCTACCGGTGGTAACCCACCACCACCACCTGCATCTTCTACCACCTTCTCGACCACCAGAAGATCGTCTACCACCTCTTCTTCTCCATCTTGTACCCAGACTCACTGGGGTCAGTGTGGTGGTATTGGCTACACCGGCTGTAAGACCTGTACCTCTGGAACCACTTGCCAGTACGGCAACGACTACTACTCTCAGTGCCTGTGA
SEQ ID NO：4
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SEQ ID NO：5
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SEQ ID NO：6
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SEQ ID NO：7
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SEQ ID NO：8
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SEQ ID NO：9
SLQPGTSTPEVHPKLTTYKCTTSGGCVAQNTSVVLDWNYRWMHDANYNSCTVNGGVNTTLCPDEATCCKNCFIEGVDYAASGVTASGSTLTLNQYMPSSSGGYSSVSPRLYLLGPDGKYVMLKLNGQELSFDVDLSALPCGENASLYLSQMDENGGANQYNTAGANYGSGYCDAQCPVQTWRNGTLNTSGKGFCCNEMDILEGNSRANALTPHSCNATACDSAGCGFNPYGSGYPNYFGPGGTVDTSKPFTIITQFNTDNGSPSGNLVSITRKYRQNGVDIPSAKPGGDTISSCPSASAYGGLATMGKALSSGMVLIFSIWNDNSQYMNWLDSGSAGPCSSTEGNPSNILANNPGTHVVYSNIRWGDIGSTTNSTGGNPPPPPASSTTFSTTRRSSTTSSSPSCTQTHWGQCGGIGYTGCKTCTSGTTCQYSNDYYSQCL＊
SEQ ID NO：10
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SEQ ID NO：11
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SEQ ID NO：12
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SEQ ID NO：13
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SEQ ID NO：14
SQQPGTSTPEVHPKLTTYKCTTSGGCVAQDTSVVLDWNYRWIHDANYNSCTVNGGVNTTLCPDEATCGKNCFIEGVDYAASGVTANGSTLTLNQYMPSSSGGYSSVSPRLYLLGPDGEYVMLKLNGQELSFDVDLSALPCGENGSLYLSQMDENGGANQYNTAGANYGSGYCDAQCPVQTWRNGTLNTSGQGFCCNEMDILEGNSRANALTPHSCTATACDSAGCGFNPYGSGYPNYFGPGDTVDTSKPFTIITQFNTDNGSPSGNLVSITRKYRQNGVDIPSAKPGGDTISSCPSASAYGGLATMGKALSSGMVLIFSIWNDNSQYMNWLDSGSAGPCSSTEGNPSNILANNPGTHVVYSNIRWGDIGSTTNSTGGNPPPPPASSTTFSTTRRSSTTSSSPSCTQTHWGQCGGIGYTGCKTCTSGTTCQYGNDYYSQCL＊
SEQ ID NO：15
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SEQ ID NO：16：
atgtatcggaagttggccgtcatctcggccttcttggccacagcacgggcttctctgcaaccgggtaccagcacccccgaggtccatcccaagttgacaacctacaagtgtacaacctccggggggtgcgtggcccagaacacctatgtggtccttgactggaactaccgctggatccacgacgcaaactacaactcgtgcaccgtcaacggcggcgtcaacaccacgctctgccctgacgaggcgaccggtagcaagaactgcttcatcgagggcgtcgactacgccgcctcgggcgtcacggccaatggcagcaccctcaccctgaaccagtacatgcccagcagctctggcggctacactagcgtctctcctcggctgtatctcctgggtccagacggtaagtacgtgatgctgaagctcaacggccaggagctgagcttcgacgtcgacctctctgctctgccgtgtggagagaacgcctcgctctacctgtctcagatggacgagaacgggggcgccaaccagtataacacggccggtgccaactacgggagcggctactgcgatgctcagtgccccgtccagacatggaggaacggcaccctcaacactagcggccagggcttctgctgcaacgagatggatatcctggagggcaactcgagggcgaatgccttgacccctcactcttgcaatgccacggcctgcgactctgccggttgcggcttcaacccctatcgcagcggctacccaaactacttcggccccggaggcaccgttgacacctccaagccattcaccatcatcacccagttcaacacggacaacggctcgccctcgggcaaccttgtgagcatcacccgcaagtacagacaaaacggcgtcgacatccccagcgccaaacccggcggcgacaccatctcgtcctgcccgtccgcctcaacttacggcggcctcgccaccatgggcaaggccctgagcgagggcatggtgctcatcttcagcatttggaacgacaacagccagtacatgaactggctcgacagcggcgatgccggcccctgcagcagcaccgagggcaacccatccaacatcctggccaacaaccccggtacgcacgtcgtctactccaacatccgctggggagacattgggtctactacgaactcgactggtggtccgcccccgcctgcgtccagcacgacgttttcgactgcccggaggagctcgacgtcctcgagcagcccgagctgcatccagactcactgggggcagtgcggtggcattgggtacaccgggtgcaagacgtgcacgtcgggcactacgtgccagtatagcaacgactactactcgcaatgcctttaa
实施例
实施例1：生成文库和特定变体
使用SEQ ID NO：3作为模板，使用Taq聚合酶，遵照文献方案(Joyce等人)，通过易错PCR产生基于Seq.ID NO：3的文库(“N7”文库)，PCR条件使用如下：95℃下2分钟，30个循环(95℃下1分钟，56℃下1分钟，72℃下1分钟)，72℃下5分钟。通过PCR获得的所有产物均使用QIAquick PCR提纯试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)提纯。
Seq.ID NO：3的特定变体通过改良的PCR方案制备，其使用含有突变核苷酸序列的引物(Ho，S.N.等人Gene；1989；77；51-9)。
实施例2：在毕赤酵母中表达
线性表达盒(LEC)的构建-具有Zeocin标记物和GAP启动子的LECs(Liu Z等人Chembiochem.2008 Jan 4；9(1)：58-61)通过改良的PCR方案构建。
毕赤酵母的转化和培养-如所描述制备并转化感受态细胞(Lin-Cereghino，J.等人.BioTechniques.2005，38，44-48)。在含有Zeocin 100 mg/L的YPD琼脂板上选择转化体，并通过捡取自动机(QPix2，Genetix)将其捡取至深孔板(DWP)(BMD5％250ml/孔)。将接种的DWP在28℃、湿度80％和280 rpm的条件下孵育60小时。
实施例3：在里氏木霉中表达
里氏木霉表达载体的构建
基本上如等人1997所述将SbfI/SwaI消化的线性化pV7质粒(图2)DNA转化到里氏木霉SCF41中。转化体的选择在含有潮霉素作为选择剂(100mg/l)的Mandel’sAndreotti培养板上进行。转化体通过PCR证实。
实施例4：使用4-甲基伞形花基-β-D-纤维二糖(4-methylumbellifery-β-d-cellobiosid,4-MUC)在不同的温度下测定底物转化能力指征Seq ID NO.2变体的热稳定性
出于对热稳定性的精确比较，将10μl含有分泌的内切葡聚糖酶变体的毕赤酵母培养物上清液在Eppendorff梯度热循环仪的温度梯度下与90μl 100μM 4-MUC(溶解于醋酸钠缓冲液(50mM,pH 5.0)中))一起孵育。将24个反应混合物在45℃至65℃以及从55℃至75℃的温度梯度下孵育(每个反应均保持在单一的恒定温度水平上)1小时。在向各个反应物中加入100μl 1M碳酸钠溶液并在Tecan Infinite M200酶标仪中在360nm/454nm下测量荧光强度之后，可以确定各个温度下的酶活性。为对热稳定性加以比较，通过除以一系列的最大计数(归一化至1)，确定每个温度点的荧光计数、相对酶活性。通过在测量的温度范围上对相对酶活性进行作图，产生任意指定酶的温度图谱。
实施例5：一些内切葡聚糖酶变体的活性热稳定化
该实施例描述了出人意料的活性热稳定化效应的例子。在该实施例中，使用在毕赤酵母中表达的蛋白质(培养物上清液)(下表5)。
图3说明了本发明的蛋白质测得的特性：记作[1]、[4]、[5]、[7]、[8]、[9]和[10]的蛋白质表现出热稳定化和温度稳定性，而记作[3]和[6]的蛋白质表现出热稳定性，但没有活性热稳定化。
实施例6：测定秸秆上的还原糖释放
通过将经酸预处理的小麦秸秆施以2.5％的干物质，测定秸秆上的还原糖释放。向反应混合物中加入以下酶：纤维二糖水解酶I(12.5mg/l)、β-葡糖苷酶(40CBU/mg纤维二糖水解酶I)和测试的GH7内切葡聚糖酶酶变体(12.5mg/l)。将秸秆水解物在60℃下通过持续震摇孵育48小时。
实施例7：测定Seq ID.No2变体的温度图谱
对于MUL(4-甲基伞形花基β-D-吡喃乳糖苷)活性检验，将10μl培养物上清液与pH4.8的25mM醋酸钠缓冲液中90μl 100μM MUL混合。将板密封，并以300rpm震摇分别在45℃和59℃下孵育2小时(出于再筛选，另在65℃下孵育)。通过在每孔中加入100μl Na2CO3使反应猝灭。在365nm下进行激发，在450nm下测量荧光。结果示于图5。
实施例8：测定Seq ID.No2变体的温度图谱
在70℃下在水浴中将毕赤酵母培养物的表达上清液孵育0-7分钟之后，通过使用实施例7中所述的MUL检定来测量残余活性，测定酶的半衰期。在活性检验开始之前，在精确的孵育时间之后，将样品置于冰上。

Claims (7)

1.一种具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ.ID NO.:2所示，其中所述蛋白质在温度60℃下在孵育进行1小时时表现出至少90％的残余底物转化能力。
2.一种核酸，其编码权利要求1所述的蛋白质。
3.一种表达载体，其包括权利要求2所述的核酸。
4.一种微生物，其含有权利要求3所述的表达载体。
5.一种混合物，其含有根据权利要求1所述的蛋白质和一种或更多种其他的酶。
6.根据权利要求5所述的混合物，其中所述酶选自纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶中的一种或更多种。
7.根据权利要求1所述的蛋白质或根据权利要求5所述的混合物用于木质纤维素的糖化的用途。
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