CN104267067B - 一种气味传感器对铜绿假单胞杆菌生长预测的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于气味传感器对肉品中典型腐败菌铜绿假单胞杆菌生长阶段的预测方法,属于食品质量安全快速检测和监测的无损技术。通过电子鼻的气味传感器,获取两种不同初始接种浓度的铜绿假单胞杆菌培养48h内的气味信息,以气味信息的变化构建铜绿假单胞杆菌的生长模型。与传统的微生物生长检测手段得到的生长模型相比较,该方法通过检测微生物挥发的整体气味来预测其生长状况,简单快捷,无需破坏样品,为微生物的生长预测提供了新思路和新技术,能够用于肉品质量和安全的检测、监测和控制。
Description
技术领域
本发明是一种气味传感器对肉品主要腐败菌铜绿假单胞杆菌生长预测的方法,属于食品质量安全快速无损检测、监测和控制的技术领域。
背景技术
在上个世纪关于肉品研究的发现和创新已经可以引起肉类生产、加工、销售和消费的革命性变化。近年来,肉类是最具有价值的畜产并且对很多人而言已经成为他们动物蛋白的第一选择来源。但是,肉品由于丰富的营养成分,是微生物的天然培养基,在储存过程中极易受到腐败微生物的侵染,造成极大损失。其中,假单胞菌就是引起肉品腐败的一种主要腐败菌。目前,对于微生物的预测方法主要是研究微生物形态的生理生化指标,但是需要大量的准备工作,耗时长,灵敏度也不高,而且对样品有一定的损伤,不能够及时地监测到腐败微生物。免疫学检测方法特异性好、灵敏度高,但实验前要对样品做比较繁琐且困难的处理工作。分子生物学方法主要针对核酸进行检测,与免疫学方法一样,特异性好、灵敏度高,但需要进行细胞破壁提取核酸。电子鼻作为一种对各种食品无损、快速的质量与安全分析和评估方法,较之感官评价、显微技术、微生物理化指标等其他传统方法对肉品腐败微生物的检测具有明显的优势。电子鼻直接获取样品挥发性物质的整体信息,并通过模式识别进行整体判断,来预测假单胞菌的生长状况,不需要对样品进行破坏处理,具有操作简单、方便快捷、无损、环保的优点。目前,电子鼻广泛应用于肉品质量评价、等级判定、成熟期判断、类别识别、生产过程检测与控制等方面,但并不涉及对肉中特定腐败微生物的生长预测。因此,亟需开发一种利用电子鼻实现肉中主要腐败微生物或者致病微生物生长预测的方法,为肉品质量和安全的监测和控制提供支持。
发明内容
一、技术问题
鉴于上述的技术发展现状,本发明的目的主要针对现有技术实现肉品中主要腐败微生物和致病微生物的生长预测模型构建费时费力的问题,开发基于气味传感器的快速无损检测方法,满足食品质量与安全控制的迫切需求。通过利用电子鼻检测系统,获取微生物生长过程中的气味信息,选取特征传感器的响应值,构建基于气味传感器的微生物生长预测模型。本发明的方法也可以用于其他类微生物的生长预测模型构建的应用中。
二、技术方案
1.一种气味传感器对铜绿假单胞杆菌生长预测的方法,
1)其采用的装置特征在于,系统组成包括进样系统、包含10个金属氧化物传感器的探测系统和用于数据记录和分析的模式识别软件,其中,10个传感器分别为W1C/S1:对芳香型化合物敏感);W5S/S2:对氮氧化物敏感;W3C/S3:对氨类和芳香型化合物敏感;W6S/S4:氢气敏感;W5C/S5:对烯烃和芳香型化合物敏感;W1S/S6:对烃类物质敏感;W1W/S7:对硫化氢敏感;W2S/S8:对醇类和部分芳香型化合物敏感;W2W/S9:对芳香化合物和有机硫化物敏感;W3S/S10:对烷烃敏感;软件系统包括信号预处理和模式识别两部分;通过选取的传感器阵列把气体成分的变化转化为可以测量的物理信号,其中,试验参数设置为流速300mL/min,测定时间60s,洗气时间110s,样品准备时间5s,自动调零时间5s。
2)检测步骤在于:将铜绿假单胞杆菌处于温度为37℃、相对湿度为85%条件下培养一段时间的培养基平板取出,放置于如权利要求1所述的检测系统中,获取样品气味的整体信息;利用单因素方差分析和电子鼻自带的载荷分析对获得的气味信息进行处理,获得最佳的传感器阵列;选择最佳传感器阵列,根据传感器响应信息构建铜绿假单胞杆菌的生长预测模型。
2.构建铜绿假单胞杆菌的生长模型,其特征在于,
1)铜绿假单胞杆菌初始浓度为102CFU/mL,分别提取传感器S8和S10的响应值求平均值,根据培养时间与单个传感器响应值的关系构建铜绿假单胞杆菌的生长模型为:
y(s8)=1.515+0.1086/(31.84×exp(-0.1803×x)+0.1158) (1)
y(s10)=1.059+2.424/(17.29×exp(-0.03278×x)+0.8034) (2)
其中,上述公式(1)和(2)为单个传感器,分别为S8和S10建立的浓度为102CFU/mL假单胞菌的生长模型,y为单个传感器响应值均值,x为培养时间,单位为小时。
2)铜绿假单胞杆菌初始浓度为104CFU/mL,分别提取S8和S10的响应值求平均值,根据培养时间与单个传感器响应值的关系构建铜绿假单胞杆菌的生长模型为:
y(s8)=1.479+2.203/(146.1×exp(-1.856×x)+0.917) (3)
y(s10)=1.15+5.161/(175.2×exp(-0.2067×x)+8.824) (4)
其中,上述公式(3)和(4)为单个传感器,分别为S8和S10建立的浓度为104CFU/mL假单胞菌的生长模型,y为单个传感器响应值均值,x为培养时间,单位为小时。
3)铜绿假单胞杆菌初始浓度为102CFU/mL,提取最佳传感器阵列的响应值,求最佳传感器阵列S3、S5、S6、S8和S10的第一和第二主成分得分值,根据培养时间与主成分得分值的关系构建铜绿假单胞杆菌的生长模型为:
y=1.137+0.6558/(49.98×exp(-0.2129×x)+1.113) (5)
其中,式(5)中,y为第一主成分得分值,x为培养时间,单位为小时。
y=1.92+1.894/(21.19×exp(-0.04805×x)+0.4858) (6)
其中,式(6)中,y为第二主成分得分值,x为培养时间,单位为小时。
4)铜绿假单胞杆菌浓度为104CFU/mL,提取最佳传感器传感器阵列的响应值,求最佳传感器阵列S3、S5、S6、S8和S10的第一和第二主成分得分值,根据培养时间与主成分得分值的关系构建铜绿假单胞杆菌的生长模型为:
y=1.241-5.967/(-115.7×exp(-0.1414×x)-5.44) (7)
其中,式(7)中,y为第一主成分得分值,x为培养时间,单位为小时。
y=1.358+13.53/(24.99×exp(-0.01524×x)-6.897) (8)
其中,式(8)中,y为第二主成分得分值,x为培养时间,单位为小时。3.所使用的培养基平板,其特征在于,培养基构成为牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl5g、琼脂15-20g、水1000mL、pH7.4-7.6;每个培养皿含有的培养基体积为18±2mL,培养基厚度为2.5±0.5mm。
三、有益效果
本发明利用电子鼻传感器对微生物的响应,能够不破坏微生物或者检测样本的情况下,通过微生物在不同生长阶段的传感器响应特性,在微生物生长期间的情况进行无损快速预测,能够为肉类生产、加工、销售和消费等各个环节提供微生物的生长信息,为食品质量和安全的及时检测、监测和控制提供技术支持。电子鼻作为一种对各种食品无损、快速的质量与安全分析和评估方法,较之传统的破坏性方法预测微生物的生长具有明显的优势。电子鼻直接获取样品挥发性物质的整体信息,进行整体判断,预测假单胞菌的生长状况,无需化学试剂,无需对样品进行破坏处理,具有操作简单、方便快捷、无损、环保的优点。该技术和方法新颖,研究成果不仅可以用于实验室的快速分析和检测,而且可以通过开发在线检测设备和便携式仪器,用于工业自动化生产中的肉品微生物生长情况预测和监测,也为其他类食品腐败微生物和致病微生物的生长预测提供有益的借鉴。
四、附图说明
图1:电子鼻检测系统
图2:两个浓度假单胞菌处理组培养0-48h的平板样品
图3:102CFU/mL铜绿假单胞杆菌在36h的传感器响应信号变化
五、具体实施方式
一种气味传感器检测技术对铜绿假单胞杆菌生长预测的方法,具体实施方式如下:
1.材料与方法
铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa),由南京农业大学食品科技学院实验室提供。
使用的培养基为营养琼脂培养基,具体组成为:牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl5g、琼脂15-20g、水1000mL、pH 7.4-7.6。
菌种培养方法为将4℃下保存的铜绿假单胞杆菌接种到营养琼脂培养基上,在37℃、相对湿度85%下活化培养3d之后,再次接种到营养琼脂培养基上进行二次活化2d,用生理盐水(0.9%NaCl)冲洗细菌,借助于血球计数板,调整至浓度为102和104CFU/mL的菌液,然后进行样本制备。考虑样本培养基的一致性,倾倒培养基量定为18±2mL,培养基厚度为2.5±0.5mm。准备250个培养基,50个培养基样本做空白对照,记作CK;浓度为102、104CFU/mL的铜绿假单胞杆菌的培养基样本各100个,分别计做A组和B组。250个样本同时培养两天,每12小时(0h、12h、24h、36h、48h)进行电子鼻测定。图2为两个浓度假的单胞菌处理组培养0-48h的平板样品。
2.获取电子鼻传感器响应值
铜绿假单胞杆菌的气味由便携式电子鼻(PEN 3,Win Muster Air-senseAnalytics Inc.,Germany)获得。电子鼻系统(图1)是由一个进样系统、一个包含10个金属氧化物传感器的探测系统和一个用于数据记录和分析的模式识别软件组成。每个传感器通常对不同的挥发性物质敏感,10个金属氧化物传感器分别为W1C/S1(芳香型化合物)、W5S/S2(氮氧化物)、W3C/S3(氨类和芳香型化合物)、W6S/S4(氢气)、W5C/S5(烯烃和芳香型化合物)、W1S/S6(烃类物质)、W1W/S7(硫化氢)、W2S/S8(醇类和部分芳香型化合物)、W2W/S9(芳香化合物和有机硫化物)、W3S/S10(烷烃)。测定时进样针以恒定的速率吸取样品顶端空间的气体,气体进入传感器室后,10个传感器的导电率发生改变。传感器响应值即G/G0(相对电导率),G和G0分别代表样品气体的电导率和金属传感器吸附过滤后的空气的电导率。样品气体浓度越大,G/G0越偏离1,如果样品气体浓度低于检测限或者没有样品气体,则G/G0接近甚至等于1。试验参数设为流速为300mL/min,测定时间为60s,洗气时间为110s,样品准备时间为5s,自动调零时间为5s。
将铜绿假单胞杆菌的培养皿放置于1000mL的烧杯中,并用锡箔纸封口,于30℃下顶空30min进行检测,从0h开始,每隔12h测量一次,一直测到第48h。每次两种浓度的假单胞菌平板样品各设置20个样,CK对照组设置10个样,共计50个样,一共测定五次(0h、12h、24h、36h、48h),每次测完的平板样品灭菌处理,舍弃不用。
实验共获得250个样本的电子鼻传感器响应值。电子鼻的10个传感器通常对不同的挥发性物质敏感,所以通过传感器响应值在建立假单胞菌生长模型之前先选取最佳的传感器阵列。
3.建立铜绿假单胞杆菌生长模型
使用SAS9.2软件的单因素方差分析(Fisher’s LSD,P<0.05)以及电子鼻自带的载荷分析确定各个传感器对假单胞菌气味是否有显著性差异和累计贡献率大小,选取有显著差异和贡献率较大的5个传感器作为最佳传感器阵列。一个浓度的每个时间点(0h、12h、24h、36h、48h)计20个数据,其中15个数据求平均值后用于建模,另外5个数据用于验证。因此,每个时间点都有一个传感器响应值,5个时间点共得5个数据,通过MATLAB7.1统计工具箱中Curve Fitting Tool将这5个数据建立铜绿假单胞杆菌随传感器响应值变化的生长曲线,然后根据所得到的模型,利用验证组进行验证。同时,将基于铜绿假单胞杆菌实际菌落数建立的生长模型与基于传感器响应值建立的生长模型进行相关性分析。
本实验利用SAS9.2软件对所选取最佳传感器进行PCA,将所得的贡献率高的主成分得分值用以构建假单胞菌的生长模型,进行生长拟合。前两个主成分累计贡献率达85%以上,因此可选择第一和第二主成分进行生长模型的拟合。每个时间点各提供20个数据,经主成分分析,得到20组基准数据,15个求平均后用于建模,另外5个用于验证。因此,第一和第二主成分分别进行生长拟合时,每个时间点都有一个主成分值,共得到5个数据,通过MATLAB7.1统计工具箱中Curve Fitting Tool将这5个数据建立铜绿假单胞杆菌随主成分变化的生长拟合模型,然后根据所得到的模型,利用验证组进行验证。同时,将基于铜绿假单胞杆菌实际菌落数建立的生长模型与基于传感器响应值主成分建立的生长模型进行相关性分析。
4.气味传感器响应信息分析
4.1不同生长阶段传感器对铜绿假单胞杆菌挥发物的响应
采用铜绿假单胞杆菌的两种浓度进行分析,图3显示了假单胞菌纯培养在培养第36h的响应信号变化,图中每条曲线都代表一个传感器。在最初阶段每个传感器的响应值都飞速上升,直到30s左右上升趋势变缓,到55s响应值趋于稳定,之后变化非常小,所以取59s处的数值用于建立模型。选取有效的传感器对挥发物质响应值时,适合的时间和最佳的传感器组合是非常重要的。图3中可以观察到,S5,S6,S7,S8,S10比其他传感器具有更大的响应值。
4.2基于气味传感器响应值拟合铜绿假单胞杆菌的生长模型
最佳传感器组合为S3、S5、S6、S8、S10,A组和B组铜绿假单胞杆菌单个传感器的拟合方程分别为:
表1不同处理组单个传感器建立的假单胞菌生长模型
由表(1)中可以看出,两个假单胞菌处理组传感器S3、S5、S6的拟合曲线相关性较差,但S8、S10的拟合曲线相关性较好,R2皆在0.9以上,说明部分的单个气味传感器(如S8和S10)建立的假单胞菌生长模型准确率较高,误差较小。
A组的菌落单位数量依次为102、3.6×105、3.2×106、6×105、5.4×107CFU/mL,再依次取以10为底的对数得:2、5.55、6.50、6.77、7.73,根据对数值建立的模型结果为:y=1.81+34.2/(165.8×exp(-0.3448×x)+6.559),R2=0.9594,说明以细菌菌数变化建立的浓度为102CFU/mL的铜绿假单胞杆菌生长模型拟合程度较高。将所得的S8和S10建立的模型分别与实际菌数建立的模型之间进行相关性分析,相关性分别为0.657和0.702,假单胞菌初始培养浓度为102CFU/mL时,单个传感器拟合的模型并不能很好地体现假单胞菌实际的生长状况。
B组的菌落单位数量依次为104、2×106、7.2×106、3.2×107、6×107CFU/mL,再依次取以10为底的对数得:4、6.30、6.85、7.50、7.77,根据对数值拟合的模型结果为:y=3.74+19.91/(59.5×exp(-0.2593×x)+5.403),R2=0.9580,说明以细菌菌数变化建立的浓度为104CFU/mL的铜绿假单胞杆菌生长模型拟合程度高,误差小。将所得的S8和S10建立的模型分别与实际菌数建立的模型之间构建模型值进行相关性分析,相关性分别为0.936和0.958,单个传感器对浓度为104CFU/mL的铜绿假单胞杆菌的生长拟合与铜绿假单胞杆菌的真实生长情况较为接近。
4.3基于主成分分析拟合铜绿假单胞杆菌的生长模型
A组选取的最佳传感器阵列进行主成分分析,得出第一主成分贡献率为66.96%,第二主成分贡献率为32.64%,累计贡献率超过85%;B组得出第一主成分贡献率为55.46%,第二主成分贡献率为43.75%,累计贡献率超过85%,A组和B组的前两个主成分可以代表原传感器阵列的绝大部分信息。两个浓度假单胞菌的第一和第二主成分的拟合方程分别为:
表2不同处理组主成分得分值建立的假单胞菌生长模型
从表(2)可以看出,虽然只有A组的第一主成分和B组的第二主成分得分值拟合的比较好,但总体上R-square值有所升高,说明降维后能够代表原来大部分传感器的主成分建立的模型更具有参考价值,更能体现假单胞菌的生长趋势,后期会再补充实验进行验证。
将A组的PC1和PC2建立的模型分别与实际菌数建立的模型进行相关性分析,分别为0.886和0.679,A组第一主成分建立的模型拟合程度高,与铜绿假单胞杆菌实际生长状况也更相近,所以以第一主成分得分值建立A组假单胞菌的生长模型;将B组的PC1和PC2建立的模型分别与实际菌数建立的模型进行相关性分析,分别为0.867和0.716,B组第一主成分虽然更接近假单胞菌真实生长状况,但拟合程度过低,而第二主成分建立的模型综合比较具有更高的准确性。
Claims (2)
1.一种气味传感器对铜绿假单胞杆菌生长预测的方法,
(1)所采用的装置特征在于,系统组成包括进样系统、含10个金属氧化物传感器的探测系统和用于数据记录和分析的模式识别软件,其中,10个传感器分别为W1C/S1:对芳香型化合物敏感;W5S/S2:对氮氧化物敏感;W3C/S3:对氨类和芳香型化合物敏感;W6S/S4:氢气敏感;W5C/S5:对烯烃和芳香型化合物敏感;W1S/S6:对烃类物质敏感;W1W/S7:对硫化氢敏感;W2S/S8:对醇类和部分芳香型化合物敏感;W2W/S9:对芳香化合物和有机硫化物敏感;W3S/S10:对烷烃敏感;软件系统包括信号预处理和模式识别两部分;通过选取的传感器阵列把气体成分的变化转化为可以测量的物理信号;
(2)检测步骤特征在于,将铜绿假单胞杆菌处于温度为37℃、相对湿度为85%条件下培养一段时间的培养基平板取出,使用上述的装置获取样品气味的整体信息,其中,试验参数设置为流速300mL/min,测定时间60s,洗气时间110s,样品准备时间5s,自动调零时间5s;利用单因素方差分析和电子鼻自带的载荷分析对获得的气味信息进行处理,获得最佳的传感器阵列;根据最佳传感器阵列响应信息,选取单个传感器以及最佳传感器阵列的主成分信息构建铜绿假单胞杆菌的生长预测模型;
(3)生长预测模型特征在于,
1)若铜绿假单胞杆菌初始浓度为102CFU/mL,分别提取传感器S8和S10的响应值求平均值,根据培养时间与单个传感器响应值的关系构建铜绿假单胞杆菌的生长预测模型为:
y(s8)=1.515+0.1086/(31.84×exp(-0.1803×x)+0.1158) (1)
y(s10)=1.059+2.424/(17.29×exp(-0.03278×x)+0.8034) (2)
其中,上述公式(1)和(2)为单个传感器S8和S10建立的浓度为102CFU/mL假单胞菌的生长模型,y为单个传感器响应值均值,x为培养时间,单位为小时;
同时提取最佳传感器阵列S3、S5、S6、S8和S10的第一和第二主成分得分值,根据培养时间与主成分得分值的关系构建铜绿假单胞杆菌的生长模型为:
y=1.137+0.6558/(49.98×exp(-0.2129×x)+1.113) (3)
其中,式(3)中,y为第一主成分得分值,x为培养时间,单位为小时;
y=1.92+1.894/(21.19×exp(-0.04805×x)+0.4858) (4)
其中,式(4)中,y为第二主成分得分值,x为培养时间,单位为小时;
2)若铜绿假单胞杆菌初始浓度为104CFU/mL,分别提取传感器S8和S10的响应值求平均值,根据培养时间与单个传感器响应值的关系构建铜绿假单胞杆菌的生长模型为:
y(s8)=1.479+2.203/(146.1×exp(-1.856×x)+0.917) (5)
y(s10)=1.15+5.161/(175.2×exp(-0.2067×x)+8.824) (6)
其中,上述公式(5)和(6)为单个传感器S8和S10建立的浓度为104CFU/mL假单胞菌的生长模型,y为单个传感器响应值均值,x为培养时间,单位为小时;
同时提取最佳传感器阵列S3、S5、S6、S8和S10的第一和第二主成分得分值,根据培养时间与主成分得分值的关系构建的铜绿假单胞杆菌的生长模型为:
y=1.241-5.967/(-115.7×exp(-0.1414×x)-5.44) (7)
其中,式(7)中,y为第一主成分得分值,x为培养时间,单位为小时;
y=1.358+13.53/(24.99×exp(-0.01524×x)-6.897) (8)
其中,式(8)中,y为第二主成分得分值,x为培养时间,单位为小时。
2.如权利要求1所述的一种气味传感器对铜绿假单胞杆菌生长预测的方法,培养基平板其特征在于,培养基构成为牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaC15g、琼脂15-20g、水1000mL、pH7.4-7.6;每个培养皿含有的培养基体积为18±2mL,培养基厚度为2.5±0.5mm。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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Granted publication date: 20180130 Termination date: 20211028 |
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