CN104246691A - 控制检测器间谱带增宽 - Google Patents

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Abstract

用于在分析注入至色谱系统的样品期间控制检测器间谱带增宽的方法和装置。在样品离开色谱系统后用稀释流稀释柱流，并且稀释的样品通过分析仪器比如光散射检测器、折射率检测器、紫外吸收检测器之一或其组合被分析。

Description

控制检测器间谱带增宽
技术领域
本公开一般地涉及用于化学分析的色谱方法和装置。本公开也涉及控制色谱系统中的检测器间谱带增宽，以通过一系列分析仪器提供样品测量的更精确的比较。
背景技术
液相色谱的高分子表征由分析分馏的样品组成，该分馏的样品从与检测器串联连接的色谱柱洗脱，其中每一个检测器测量样品的不同性质。能够被用来测量摩尔质量和回转半径的典型的检测器链由多角度光散射检测器(MALS)和折射率检测器组成。存在许多也可以被添加至分析链的其它检测器，其包括但不限于紫外吸收、差示粘度测定法、准弹性光散射和质谱分析法。然而，在检测器之间流动的过程中，由于样品在管中被剪切并且通过不同的测定池经由通道被混合，通过柱分馏的样品变得逐渐地再混合。这是检测器间谱带增宽的问题——这与色谱柱内的混合和增宽所涉及的问题不同，其被典型地称为柱增宽(column broadening)。
为了提取物理参数，当样品通过分析链时，必须时常比较来自不同检测器的相同物理等分样品的信号。然而，由于样品正被慢慢地再混合，存在将影响此比较的两种作用。第一种是均匀组分、但是不同浓度的峰值，将受到峰形增宽的影响。通常，第一检测器将测量最窄峰，当样品前进通过检测器链时，最窄峰将在随后增强。例如，在光散射分析中，在低浓度下样品的分子量与光散射信号的比成比例
M(t)∞LS(t)/RI(t)。(1)
其中M(t)是作为时间的函数的样品的摩尔质量，LS(t)是作为时间的函数的光散射信号，和R/(t)是作为时间的函数的示差折射率检测器。考虑如果单分散样品通过由光散射仪器后面是折射率检测器组成的分析链测量会发生什么。由于样品是单分散的，所述跨越峰值的摩尔质量是恒定的，以便在这种情况下M(t)＝M并且我们发现两个检测器响应应该是彼此成正比LS(t)∞RI(t)。这意味着如果我们测量峰值并且将它们标度至样品振幅，则它们应该完全重叠。然而，在检测器间谱带增宽的情况下，正被增宽的下游检测器的峰形不再与上游检测器成正比，并且我们发现RI峰比LS峰宽。当进行分子量分析时，这在导出的摩尔质量中导致错误。在文献中，已经提出了解决此问题的各种方法，其由以下组成：建模发生的混合，例如，参见Trainoff的美国专利号7,386,427“Method for correcting the effects of interdetector bandbroadening”，和利用数学修正补偿峰形的变化。这些方法很有效，只要该增宽与峰宽相比是小的。粗略的经验法则是如果该增宽增加了峰宽20％或更小，则数值修正能够达到修正的效果。
增宽的第二作用是混合不同组分的两个相邻峰。这相当于分辨率(resolution)的损失。这是更加困难的问题，因为数值建模典型地假设通过每一个检测器的样品都被很好地分馏并且在任何给定时间内每一个检测器中的样品几乎是单分散的。当检测器间增宽使得样品多分散时，更难以在数字上修正。
液相色谱法的趋势是趋向更窄内径的柱子，此柱子缩短运行时间并且提高分辨率。典型的标准内径色谱柱具有4-5mm的内径，并且为了最佳分辨率需要大约lml/min的溶剂流速。当样品被注入至此类系统中时，各个成分被分馏成一系列峰，每一个都具有大约1ml的洗脱体积。为了避免过多的检测器间增宽，分析仪器被设计以具有尽可能低的内体积。然而，即使测定池的内体积是小的，有效的混合体积可能比物理体积更大，这取决于该池的流动特性。例如，由Wyatt Technology制造的T-rEXTM差示折射率测定池具有7.5μ1的内体积，但是当测定池中存在湍动混合时，测定池的三角形状使得它难以冲洗角落，这对于1.0ml/min的流速导致大约15μ1的有效混合体积，以及对于0.1ml/min的流速多达200μ1的有效混合体积，这导致未充分地冲洗角落的测定池中的层流。总之，对于更高流速，有效混合体积与物理体积更接近。
当样品离开第一测定池行进通过毛细管至第二仪器并且然后进入第二测定池被混合时，总的检测器间增宽是发生的混合的组合。例如，Wyatt Techology多角度光散射(MALS)仪器随后是Optilab T-rEX DRI系统，对于1.0ml/min的流速，有效的检测器间增宽大致是50μ1，其仅仅是1.0μ1的典型峰宽的5％。这远比前面提到的20％经验法则少并且数字谱带增宽修正很有效。然而，对于窄内径色谱柱比如具有3.0mm的内径和0.3ml/min的流速的Waters Acquity柱，峰宽降低大约10倍至大约100μ1。在这种情况下，检测器间增宽实际上由于更低的流速稍微增加，但即使在50μ1混合体积下，它代表峰宽的50％并且数值增宽修正表现不佳。该峰是高度扭曲的并且分辨率大幅损失。明显存在强烈动机使有效增宽体积尽可能小，但是在某种程度上，仪器设计和制造的考虑事项限制了实验测定池可以多么小。本发明的主题是提出控制检测器间谱带增宽的作用的方法。
附图简述
可以理解，附图仅描述了本发明的典型实施方式并且没有因此被认为是限制其范围，将通过使用如下列出的附图以特征和细节描述和说明本发明。
图1是样品分析系统的流程图。
图2是另一个样品分析系统的流程图。
图3是将未稀释注入物和1:8稀释注入物的光散射与折射率数据进行比较的图。
图4是将来自未稀释注入物和图3的1:8稀释物的光散射数据峰值进行比较的图。
图5是绘制光散射峰值振幅关于柱流速的图。
图6是绘制混合体积关于流速的图。
图7是绘制物理混合体积关于柱流速的图。
图8是显示半峰全宽(FWHM)关于流速的图。
发明详述
容易理解地，本文附图中一般性描述和阐明的实施方式的成分可在多种不同的配置中被安排和设计。因此，如附图中表示的各种实施方式的下列更详细的描述并非意在限制所要求保护的本发明的范围，而仅仅表示各种实施方式。虽然实施方式的各方面在附图中呈现，但是除非特定指出的，所述附图不必要按比例绘制。
比如图1中显示的用于基本样品分析系统100的那些色谱系统可用于将样品分离为各种成分以便这些成分可以被识别和量化。色谱技术可应用于气态样品和液态样品，其包括化学、生物和医学样品。
利用了多种机制以在样品的成分之间产生期望的分离。在一个实例中，样品流动通过的比如图1所示的分馏柱110的毛细管或柱的壁可被用于基于尺寸和/或化学亲和力分离样品成分。样品通过一些技术比如在毛细管或柱的入口端和出口端之间形成的压力差被迫通过此基体(matrix)。此压力差可由泵比如图1所示的泵120和/或泵130形成。
样品通过色谱系统分离后，毛细管可转移样品溶液至测量所述成分的一些物理性质的一个或多个检测器，所述物理性质比如，但不限于，样品溶液的光散射、质谱、吸收光谱、荧光光谱、折射率、核磁共振或导电性。在图1所示的实例中，毛细管可转移分离的样品至包含一个或多个检测仪器的仪器链150，比如在分馏柱110后串联连接的光散射(LS)检测器和折射率(RI)检测器。
在一个实例中，LS和RI浓度信号可通过由短长度的管分开的仪器链150中的两个不同仪器产生。为了推动相应的测量，当分馏的样品流过管时，仪器链中的仪器应该对分馏的样品的相同部分进行分析。换句话说，当样品移动通过管时，仪器应该使它们的分析关于样品的相同“片段(slice)”。这意味着在相应的片段之间将存在时间延迟，为了精确分析必须被确定该时间延迟。此外，两个仪器的连接管和流动吸收池可造成样品的一些混合，其趋向退化由色谱系统进行的样品分离/分馏。因此，当它经过系统时，一小部分流量没有保持不变，但是在其从一个检测器到下一个的通道期间与其它片段稍微混合。当它从一个检测器行进到另一个时，片段与来自其它片段的样品馏分的污染将造成错误的计算结果，比如分子量分布。当样品通过仪器链被分析时，管距和样品的混合具有增宽检测峰值的作用。此作用被称作检测器间谱带增宽。在分析分馏的样品期间，检测器间谱带增宽的作用应该被保持小以使测量误差最小化。
如下列实例所示，检测器间谱带增宽可通过增加通过分析仪器链的流量通过用辅助稀释流稀释样品而被最小化。
实施例1
为了突出检测器间增宽和相关的分辨率损失的作用，建立实验系统200以模拟从微内径色谱柱产生的窄峰。此测试由通过0.1μm的串联过滤器(inline filter)一直从自助注入器直接地注入至仪器分析链组成。此布置提供了形成极其窄的峰的机会，而不会使开展色谱方法复杂化。
如图2所示，实验系统200包括溶剂储蓄器210——其被用作柱流量泵230和稀释流量泵231二者的来源。来自溶剂储蓄器210的流体通过串联脱气装置215。在脱气装置215后的“T”连接220提供柱流量泵230和稀释流量泵231二者的低压口。在它们下游的高压口上，柱流量泵230和稀释流量泵231二者都具有0.02μm串联过滤器235和236。柱流量泵230和稀释流量泵231是Agilent Technologies model 1100色谱泵(www.chem.agilent.com)。柱流量泵230被用来提供柱流250。稀释流量泵231被用来提供稀释流255。柱泵230向柱流250加压并且与自动进样器233(比如Agilent Technologies model 1100自动进样器)是垂直的。1m长度的0.125mm ID毛细管237被用来模拟柱流250内的色谱柱。通过使用这段毛细管237，消除色谱柱的扩散的增宽并且形成极其窄的峰(与通过传统色谱法产生的那些峰相比)以测量峰增宽的作用是可能的。毛细管237与三通接头240相连接以将柱流250和稀释泵流255结合。在三通接头240的出口之后是0.1μm过滤器260，其用来过滤样品并且充分地将柱流250与稀释泵流225混合。使用的溶剂是磷酸盐缓冲液(PBS)，该磷酸盐缓冲液由25mM磷酸二氢钠+25mM磷酸氢二钠+50mM氯化钠+200ppm叠氮化钠组成。该样品是PBS中的1.0mg/ml卵清蛋白(Ovalbumen)。
仅为了实例的目的，并且不作为限制，仪器分析链270包括HELEOS光散射检测器280(DAWN HELEOS，从加利福尼亚州圣巴巴拉的Wyatt Technology Corp.得到)，然后是Optilab rEX折射率浓度检测器290(Optilab rEX RI，从加利福尼亚州圣巴巴拉的Wyatt TechnologyCorp.得到)。该实验以恒定流量通过仪器分析链270进行。仅改变了与稀释流混合的柱流的比率。
当与流动吸收池混合体积相比峰体积小时，检测器间谱带增宽的作用是最明显的。因此，该实验的一个目标是使注入峰尽可能窄。通过除去本身使峰增宽的色谱柱，峰宽仅被注入器、管和流动吸收池中的混合限制。由制造一系列10μ1卵清蛋白(Ovalbumen protein)样品注入物和测量光散射组成的方法以及RI检测器响应不同的稀释。由于实验系统200中没有色谱柱，所以样品未被分馏。对于本实验中使用的低浓度样品，来自光散射检测器280和折射率检测器290二者的响应值应该与样品的浓度成正比。因此，两个检测器的响应值应该与彼此成正比。因此，任何偏差都可归因于检测器间谱带增宽的作用。然后，使数据归一化为单位振幅，以便他们可以容易地被比较。为了保持流动吸收池中的混合效果恒定，流速被维持在1.0ml/min。柱流250与稀释流255的比率从无稀释流到1:8的稀释比率变化。使用的稀释如表1所示。
表1
图3显示了稀释样品对谱带增宽的效果。最右边的峰是未稀释的注入物的90°光散射(LS)信号和折射率(RI)信号的归一化的值。x轴是已经通过柱的流体体积，单位是ml。最左边的峰与1:8稀释相同。由于试样未分馏，所以归一化的LS和RI信号应该完全地覆盖，但是相反地它们显示了过分的检测器间谱带增宽。左边的稀释的峰仍然显示了轻微的检测器间谱带增宽，但是其已经被显著地减小。
图4显示了与图3相同的LS信号数据，但是曲线已经在时间上被移动以使它们重叠。稀释的峰比未稀释的峰更窄。这说明除了增加检测器间增宽，进入分析链的峰的分辨率的增加通过稀释提供。因此，样品的稀释提高了分辨率，即使仅使用单一的检测器。
没有要求稀释流与柱流是相同的组分。存在使用不同于柱溶剂的稀释溶剂是期望的应用。例如，色谱法可能需要昂贵的或危险的溶剂，而稀释流可使用便宜的或无害的溶剂。另一个实施例是反向色谱法，其利用溶剂组分的梯度分离样品。一个梯度可被应用至柱并且相反的梯度可被应用至稀释泵，以便通过分析链的流将具有恒定的组分。这将消除或显著地降低通常在RI和UV检测器中看到的倾斜基线。
实施例2
图5显示了LS峰的最大振幅(y轴为任意单位)——如表1中显示的测量的每一种注入物——对柱流速(x轴以ml/min为单位)的绘制图。这样测量了由稀释引起的信噪比的降低。稀释越高，柱流量越低。因此，流速轴的左边表示更高的稀释。正如预期的那样，它近似直线，但是没有外推至0。稀释的峰比简单地获得未稀释的峰并除以稀释因子具有更大的最大振幅。该现象的原因是峰面积被保存，但是稀释的峰更窄。
下一个分析是计算有效的检测器间混合体积的改变(如通过参考引入本文的美国专利号7,386,427中描述的)。图6显示了检测器间混合体积，正如鉴于通过柱流的流体体积测量的。在纵轴上绘制的是以μ1为单位的该混合体积。x轴显示了以ml/min为单位的柱流速。这验证了混合体积与柱流速成正比(与稀释因子成反比)。也显示了有效的混合体积可通过增加稀释因子而使得任意小。然而，折衷方案(tradeoff)是样品被稀释的越多，信号振幅变得越低，并且因此降低测量的信号的信噪比。
图7显示了与图6相同的数据，但是鉴于通过分析链的物理流速呈现，与通过柱的流速相反。由于管和流动吸收池的物理体积还没有改变，期望物理混合体积将不会被改变。图7显示了在大约40μ1下其几乎是恒定的。
实施例3
下一个实施例测量LS峰的半峰全宽(FWHM)作为柱流速的函数。此测试的目的是量化图3中定性验证的分辨率的增加。进入光散射仪器的峰的真实宽度先验未知。直到它通过峰增宽已被破坏——出现在其通过光色散仪器之前或期间——之后，它才能够被测量。然而，作为稀释的函数测量峰宽的改变是可能的。然后，可使用外推法至无限稀释以确定真实潜在的峰宽。由于那是注入物体积的大小，所以测量的FWHM可以不比10μ1窄。然而，由于注入器中和管中存在一些增宽——其导致稀释连接，期望更宽。数据在图8中显示。在数据上叠加是外推法至无限稀释。限制峰宽大约是22μ1，并且未稀释的峰为大约56μ1。结论是对这些很窄的峰的峰宽通过在柱之后但是在测量之前混合样品进行控制。据信，在通过管和串联过滤器之后，当达到检测仪器时，10μ1起始注入物是22μ1宽。22μ1的真实宽度和56μ1的测量宽度之间的差表示分辨率，该分辨率由于在管和流动吸收池中的混合损失。这说明了分辨率可应用稀释流恢复。
在没有进一步详细阐述的情况下，据信，本领域技术人员能够使用前面的描述以最大程度地利用本公开。本文公开的实施例和实施方式将被解释为仅仅是说明的但不以任何方式限制本公开的范围。对于本领域技术人员显而易见的是，可以对上述实施方式的细节进行改变，而没有背离本文描述的本公开的潜在原则。换句话说，说明书中明确公开的实施方式的各种修改和改进都在所附权利要求范围之内。因此本发明的范围由权利要求限定。

Claims (22)

1.控制样品的检测器间谱带增宽的方法，所述方法包括：
A.将所述样品引入至流动通过色谱系统的柱流中；
B.在样品离开所述色谱系统之后，通过用稀释流稀释所述柱流和样品，控制检测器间谱带增宽；
C.将所稀释的样品转移到至少一个分析仪器；并且
D.用所述至少一个分析仪器分析所述稀释的样品。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述柱流包括第一溶剂。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述稀释流包括第二溶剂。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述第一溶剂和所述第二溶剂基本上相同。
5.如权利要求3所述的方法，其中所述第一溶剂和所述第二溶剂基本上不同。
6.如权利要求1所述的方法，进一步包括用所述色谱系统分馏所述柱流中的样品。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一个分析仪器包括选自光散射检测器、折射率检测器、紫外吸收检测器以及它们的组合的仪器。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述色谱系统被配置为执行高效液相色谱法。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述色谱系统执行色谱技术，所述色谱技术选自离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法、亲和色谱法、气液色谱法、气相色谱法和它们的组合。
10.如权利要求1所述的方法，其中通过所述稀释流以大约1:1(1份柱流比1份稀释流1)到大约1:10(1份柱流比10份稀释流1)范围内的比率稀释所述柱流。
11.用于控制检测器间谱带增宽的样品分析系统，所述样品分析系统包括：
A.柱流和稀释流，其中所述柱流用所述稀释流稀释以控制检测器间谱带增宽；
B.样品注入器，其被配置为将样品引入至所述柱流中；和
C.至少一个样品分析仪器，其被配置以分析所稀释的柱流。
12.如权利要求11所述的样品分析系统，进一步包括配置为使所述柱流通过的柱流量泵。
13.如权利要求11所述的样品分析系统，进一步包括配置为使所述稀释流通过的稀释流量泵。
14.如权利要求11所述的样品分析系统，进一步包括配置为使所述柱流通过的色谱柱，并且，其中所述样品注入器被配置为将样品注入至所述色谱柱上游的所述柱流中。
15.如权利要求14所述的样品分析系统，其中所述色谱柱执行色谱技术，所述色谱技术选自离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法、亲和色谱法、气液色谱法、气相色谱法和它们的组合。
16.如权利要求11所述的样品分析系统，其中所述至少一个分析仪器包括配置为测量样品性质的仪器，所述性质选自光散射、吸收光谱、质谱、核磁共振、折射率、紫外吸收、荧光吸收、导电性和它们的组合。
17.如权利要求11所述的样品分析系统，其中通过所述稀释流以大约1:1(1份柱流比1份稀释流1)到大约1:10(1份柱流比10份稀释流1)范围内的比率稀释所述柱流量。
18.如权利要求11所述的样品分析系统，其中所述柱流包括第一溶剂。
19.如权利要求18所述的样品分析系统，其中所述稀释流包括第二溶剂。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述第一溶剂和所述第二溶剂基本上相同。
21.如权利要求19所述的方法，其中所述第一溶剂和所述第二溶剂基本上不同。
22.如权利要求11所述的样品分析系统，进一步包括分馏柱，其配置为基于大小和/或化学亲和力分离样品成分。
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