CN104237534B - 一种快速检测纳米材料生物有效性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种快速检测纳米材料生物有效性的方法，属于纳米材料生物有效性的检测技术领域。本发明的步骤包括细菌荧光品系构建，将载有荧光蛋白基因的质粒转入细菌体内，获取性状稳定的个体；纳米材料的生物样品暴露过程，将上述步骤中挑取的性状稳定的细菌个体分散在有一定浓度纳米材料的缓冲液稀释后的培养基中培养；荧光蛋白的表达检测，检测出上述步骤中培养的细菌内荧光蛋白的表达情况；细菌的生长繁殖水平测定，对上述步骤中培养的细菌吸光值和克隆形成数目进行测定。本发明通过使用细菌作为研究对象，对纳米材料的生物有效性进行快速检测，解决了以往纳米材料生物有效性评价过程耗时长、有效剂量浓度范围难以确定的问题。

Description

一种快速检测纳米材料生物有效性的方法
技术领域
本发明属于纳米材料生物有效性的检测技术领域，更具体地说，涉及一种快速检测纳米材料生物有效性的方法。
背景技术
纳米材料是指在三维空间中至少有一维处于纳米尺度范围(1-100nm)或由它们作为基本单元构成的材料，这大约相当于10～100个原子紧密排列在一起的尺度。纳米金属材料是20世纪80年代中期研制成功的，后来相继问世的有纳米半导体薄膜、纳米陶瓷、纳米磁性材料和纳米生物医学材料等。人工纳米材料是目前在材料学、工程学和医学领域广泛应用的一种先进材料，纳米技术在新世纪将推动信息技术、医学、环境科学、自动化技术及能源科学的发展，像抗生素、集成电路和人造聚合物在二十世纪发挥了重要作用一样，纳米技术在新世纪将人类的生活带来深远影响。其中，人工纳米材料在医学上的应用异常广泛而重要，如核磁共振成像技术、细胞分离和染色技术、作为药物或基因载体、生物替代纳米材料、生物传感器等很多领域。
然而，科学家在对人工纳米材料的安全性评价中发现，根据其剂量差异，存在不同的毒理学效应。在一定的剂量范围内，人工纳米材料可有效的促进功能蛋白的表达，从而可以应用到抗体的制备中，以及在使用纳米材料作为药物输送的载体中，调节其使用剂量可以很好地增强免疫应答，提高疗效的效果，但另一方面，据美国纽约罗切斯特大学研究人员的实验显示，实验白鼠吸入纳米材料可能对多个脏器和中枢神经系统产生不良影响。进入21世纪，我国开始高度关注纳米生物效应与安全性的研究。纳米材料在创造巨大经济效益的同时，其毒性和健康效应也开始引起人们的关注。
中国专利申请号为2011104279814，申请日为2011年12月19日，发明创造名称为：一种评价膳食铁生物有效性的改良模型及其建立方法，该申请案包括模型结构，细胞种类和评价指标，所述的模型结构中设置有插入槽，Caco-2细胞培养位置设置在插入槽底膜上，模型结构具备顶侧室和基底侧室；该申请案采用的模型是使用细胞评价膳食中铁的吸收和转运过程，拟解决铁转运和吸收过程中的问题，未曾考虑铁元素的毒理学效应、剂量效应和作为载体转运药物的问题。中国专利号ZL2008102024518，申请日为2008年11月10日，发明创造名称为：一种降低活性污泥中重金属生物有效性的方法，该专利涉及一种活性污泥中重金属的处理工艺，根据活性污泥中所含重金属种类和含量，往活性污泥中添加其重量的7％-70％的粉末腐殖土，室温下均匀搅拌20-30天后，活性污泥中Zn、Cu、Ni、Pb四种重金属可交换态和碳酸盐结合态的比例降低1.4-7倍，Zn、Cu、Ni、Pb四种重金属硫化物及有机质结合态和残渣态的比例得到提高，使活性污泥中重金属的生物有效性得到降低；该发明采用的降低活性污泥中重金属生物有效性的方法，在解决生物污泥中的重金属含量，并不是针对生物医学领域金属纳米材料作为药物传递载体的有效性评价。中国专利申请号为2012105483964，申请日为2012年12月17日，发明创造名称为：基于生物有效性的土壤Cd污染的植物修复，该申请是一种利用大生物量非超富集蔬菜生菜修复治理Cd污染土壤的方法，该申请利用大生物量非超富集蔬菜生菜吸收富集Cd污染土壤中有效态Cd，并向上转运到地上部，当生菜生长到成熟期将生菜整体移除并作为日常食用蔬菜使用，从而达到保证蔬菜品种的同时治理污染土壤；通过生菜的种植，重复上述过程，就可以连续提取污染土壤中的Cd，直到其含量达到环境安全标准；该方法采用的污染环境植物修复的方法，在使用生菜富集土壤中的Cd离子的含量，以去除土壤中Cd离子为主要研究目的，而不是研究适用于功能蛋白表达的有效性评价。
由此可见，对作为药物载体的纳米材料，缺乏适当的方法检测其对生物样品功能蛋白表达的检测方法及适当剂量范围的生长繁殖相关评价，作为指导纳米材料作为药物载体的重要参照。因此研制一种简单快速地评估纳米材料生物有效性的方法，且同时能够提高功能蛋白的表达和生长繁殖速率，具有非常重要的应用价值，同时也是一个技术难点。本发明正是针对上述问题，着重围绕功能蛋白表达和生长繁殖等方面进行了改进。
发明内容
1.发明要解决的技术问题
本发明的目的在于解决现有技术中关于人工纳米材料对生物样品功能蛋白表达的检测方法及适当剂量范围的生长繁殖相关评价方法缺乏的不足，提供了一种快速检测纳米材料生物有效性的方法。采用本发明的技术方案，通过使用细菌作为研究对象，对纳米材料的生物有效性进行快速检测，解决了以往纳米材料生物有效性评价过程耗时长、有效剂量浓度范围难以确定的问题。
2.技术方案
为达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
本发明的一种快速检测纳米材料生物有效性的方法，其步骤包括细菌荧光品系构建、纳米材料的生物样品暴露过程、荧光蛋白的表达检测和细菌的生长繁殖水平测定；其中，细菌荧光品系构建步骤包括将载有荧光蛋白基因的质粒转入细菌体内，获取性状稳定的个体；纳米材料的生物样品暴露过程步骤包括将上述步骤中挑取的性状稳定的细菌个体在分散有一定浓度纳米材料的缓冲液稀释后的培养基中培养；荧光蛋白的表达检测步骤包括检测出上述步骤中培养的细菌内荧光蛋白的表达情况；细菌的生长繁殖水平测定步骤包括对上述步骤中培养的细菌克隆形成数目的计数。
作为本发明的进一步改进，快速检测纳米材料生物有效性的方法步骤具体如下：
步骤一、细菌荧光品系的构建
使用绿色荧光蛋白-GFP作为功能蛋白表达量的标记，将绿色荧光蛋白-GFP基因插入特异性功能蛋白的启动子序列，其中，绿色荧光蛋白-GFP基因所插入位点为保守保守持家基因的启动子；然后将载有绿色荧光蛋白-GFP基因的PUC19质粒转入细菌体内，在将绿色荧光蛋白-GFP基因插入细菌保守持家基因的启动子序列这一步骤之后，挑取性状稳定的个体以作后续研究；
步骤二、纳米材料的生物样品暴露过程
实验组将纳米材料以一定浓度分散在PBS缓冲液中，以1:10的体积比将分散有纳米材料的PBS缓冲液稀释到LB培养基中，对照组加入同样体积的PBS缓冲液但不含有纳米材料，同样以1:10的体积比将PBS缓冲液稀释到LB培养基中，同时对实验组和对照组接入同等数量的步骤一中构建的细菌荧光品系开始进行细菌的纳米材料暴露过程；本步骤的培养过程在37摄氏度的培养箱中进行，以150-200rpm的速度进行4-6小时的生长和繁殖培养。
步骤三、荧光蛋白的表达检测
在载有绿色荧光蛋白-GFP基因的细菌荧光品系经过上述步骤二纳米材料处理之后，将实验组与对照组的菌株以1:20的比例稀释到PBS缓冲液中，进行共聚焦显微镜的镜检；通过激光器的荧光激发，观测荧光强度与荧光的分布，对比绿色荧光蛋白的表达情况。
步骤四、细菌的生长繁殖水平测定
将步骤二得到的实验组和对照组的细菌按同样倍数稀释后对涂到90mm培养皿中，经过37摄氏度培养8小时后对形成的克隆数进行计数；
作为本发明的进一步改进，所述的细菌为大肠杆菌，所述的细菌荧光品系为将载有绿色荧光蛋白-GFP的PUC19质粒转入大肠杆菌trans-1中获得的性状稳定的个体。
作为本发明的进一步改进，步骤三中所述激光器的荧光为488nm。
作为本发明的进一步改进，所述的细菌的生长繁殖水平测定还可以采用测定600nm处吸光值的方法对细菌的数目进行测定。
作为本发明的进一步改进，PBS缓冲液制备过程如下：准确称量KCl 0.2g，KH2PO4 0.2g，NaCl 8.0g，Na2HPO4·2H2O 1.56g，加蒸馏水定容至一升，并调节PBS缓冲液的氢离子浓度指数(PH值)至7.4，然后在121摄氏度高温灭菌20分钟。
3.有益效果
采用本发明提供的技术方案，与现有技术相比，具有如下显著效果：
(1)本发明的一种快速检测纳米材料生物有效性的方法，通过标定细菌功能蛋白质的表达水平和生长繁殖水平，根据纳米材料的剂量范围值，对其生物有效性进行安全性界定和对功能蛋白的表达进行快速评价，解决了以往纳米材料生物有效性评价过程耗时长、有效剂量浓度范围难以确定的问题。
(2)本发明的一种快速检测纳米材料生物有效性的方法，选择具有完整蛋白表达体系的细菌---大肠杆菌品系trans-1作为主要研究对象，使得本发明的方法检测结果更精确，适用于所有纳米材料。
(3)本发明的一种快速检测纳米材料生物有效性的方法，巧妙利用荧光蛋白作为功能性蛋白表达情况的观察手段，使得细菌功能蛋白质的表达水平的标定过程简单快速，且荧光蛋白插入位点为保守保守持家基因的启动子，即与生长繁殖正相关的蛋白，使结果更具有代表性和说服力。
(4)本发明的一种快速检测纳米材料生物有效性的方法，操作过程简单易控，实验结果精确。
附图说明
图1为本发明检测生物有效性的示意图；
图2为实施例1中使用流式细胞仪检测对照组和实验组A荧光强度图；
图3为实施例1中使用流式细胞仪检测实验组B荧光强度图；
图4为实施例1中使用共聚焦显微镜检测对照组与实验组荧光强度图；
图5为实施例1中使用分光光度计检测对照组与实验组细菌数目的直方图；
图6为实施例1中使用克隆数目统计检测对照组与实验组细菌数目的直方图。
具体实施方式
为进一步了解本发明的内容，结合附图及实施例对本发明作详细描述。
实施例1
本实施例的一种快速检测纳米材料生物有效性的方法，其步骤包括细菌荧光品系构建、纳米材料的生物样品暴露过程、荧光蛋白的表达检测和细菌的生长繁殖水平测定；具体如下：
步骤一、细菌荧光品系的构建
本实施例中选择具有完整蛋白表达体系的细菌---大肠杆菌品系trans-1作为检测纳米材料生物有效性的方法介质，使得本发明的方法检测结果更精确，可以适用于所有纳米材料。首先使用绿色荧光蛋白-GFP作为功能蛋白的代表，将绿色荧光蛋白-GFP基因插入特异性功能蛋白的启动子序列之后，用于检测功能蛋白的表达情况，其中，绿色荧光蛋白-GFP基因所插入位点为特异性功能蛋白保守保守持家基因的启动子，即与生长繁殖正相关的蛋白。然后将载有绿色荧光蛋白-GFP基因的PUC19质粒转入大肠杆菌trans-1中，在将绿色荧光蛋白-GFP基因插入大肠杆菌trans-1保守持家基因的启动子序列这一步骤之后，挑取性状稳定的个体以作后续研究。
步骤二、纳米材料的生物样品暴露过程
本实施例中采用纳米银颗粒(20-50nm)作为纳米材料代表进行研究，准备两个实验组A、B及一个对照组，两个实验组将纳米银颗粒以A：10mg/L、B：50mg/L的浓度分散在PBS缓冲液中，实验组A、B均以1:10的体积比将分散有纳米银颗粒的PBS缓冲液稀释到A、B号LB培养基中，对照组加入同样体积的PBS缓冲液但不含有纳米材料，同样以1:10的体积比将PBS缓冲液稀释到LB培养基中，同时对3组培养基接入同等数量的步骤一中构建的细菌荧光品系开始进行细菌的纳米材料暴露过程；本步骤的培养过程在37摄氏度的培养箱中进行，以150-200rpm的速度进行4-6小时的生长和繁殖培养，具体在本实施例中，以180的速度进行4小时的生长和繁殖培养。其中，PBS缓冲液制备过程如下：准确称量KCl 0.2g，KH2PO40.2g，NaCl 8.0g，Na2HPO4·2H2O 1.56g，加蒸馏水定容至一升，并调节PH值至7.4，然后在121摄氏度高温灭菌20分钟。
步骤三、荧光蛋白的表达检测
在载有绿色荧光蛋白-GFP的大肠杆菌品系Trans-1经过上述步骤二纳米材料处理之后，将实验组与对照组的菌株以1:20的比例稀释到PBS缓冲液中，进行共聚焦显微镜的镜检或者通过流式细胞仪观测对比绿色荧光蛋白的表达情况，绿色荧光蛋白的表达量即对应的功能蛋白的表达量。采用共聚焦显微镜的镜检的方式，通过488nm激光器的荧光激发，观测到的绿色荧光蛋白的表达情况结果如图4所示，绿色荧光蛋白的表达效果为实验组A优于实验组B，实验组B优于对照组；采用流式细胞仪检测到的绿色荧光蛋白的表达情况结果如图2、图3所示，实验组A的绿色荧光蛋白的表达优于实验组B，实验组B优于对照组，与共聚焦显微镜的镜检的方式检测结果一致。
步骤四、细菌的生长繁殖水平测定
通过共聚焦显微镜观测荧光蛋白的表达可以反映功能蛋白的表达情况，但是并不能反映纳米材料对细菌生长繁殖的影响。但是通过对细菌克隆形成数目的检测，即可反映纳米材料对细菌的生长繁殖水平的影响。将实验组和对照组的细菌按同样倍数稀释后对涂到90mm培养皿中，经过37摄氏度培养8小时后对形成的克隆数进行计数。使用克隆数目统计检测到的细菌数目制成的直方图如图6所示，实验组A细菌数目多于对照组，对照组细菌数目多于实验组B；对细菌的生长繁殖水平测定还可以采用测定600nm处吸光值的方法对细菌的数目进行，使用分光光度计检测细菌数目的结果制成的直方图如图5所示，实验组A细菌数目多于实验组B和对照组，除去误差影响，实验组B和对照组大致相当。
综上所述，可以得出纳米银颗粒浓度在10mg/L时，对大肠杆菌的蛋白质表达和细菌生长影响都是有益的，纳米银颗粒浓度在50mg/L时，对大肠杆菌的蛋白质表达也是有益的，但是效果不如纳米银颗粒浓度在10mg/L时明显，纳米银颗粒浓度在50mg/L时，对大肠杆菌的细菌生长影响是有抑制作用的(如图1所示)，10mg/L的纳米银颗粒没有急性毒性和遗传毒性，50mg/L的纳米银颗粒没有急性毒性，但有一定的遗传毒性。
实施例2
本实施例基本方法步骤同实施例1，不同之处在于步骤二中将纳米银颗粒改为纳米氧化铁颗粒(20-50nm)，本实施例中采用纳米氧化铁颗粒作为纳米材料代表进行研究，对照组与实施例1相同，本实施例中两个实验组A、B分别将纳米氧化铁颗粒以A：10mg/L、B：200mg/L分散在PBS缓冲液中，其余部分同实施例1，最后得出结果纳米氧化铁颗粒在10mg/L和200mg/L时对大肠杆菌的蛋白质表达和细菌生长均是有益的，10mg/L的纳米氧化铁颗粒和200mg/L的纳米氧化铁颗粒均没有急性毒性和遗传毒性。
实施例3
本实施例基本方法步骤同实施例1，不同之处在于步骤二中将纳米银颗粒改为纳米氧化锌颗粒(20-50nm)，本实施例中检测10mg/L的纳米氧化锌颗粒毒理作用，对照组与实施例1相同，本实施例中设置一个实验组A，将纳米氧化锌颗粒以A：10mg/L分散在PBS缓冲液中，其余部分同实施例1，最后得出纳米氧化锌颗粒在10mg/L时对大肠杆菌的蛋白质表达和细菌生长影响都有较大抑制作用，10mg/L的纳米氧化锌颗粒有显著性毒性效应。
以上示意性的对本发明及其实施方式进行了描述，该描述没有限制性，只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (4)

1.一种快速检测纳米材料生物有效性的方法，其特征在于：其步骤具体如下：
步骤一、细菌荧光品系的构建
使用绿色荧光蛋白-GFP作为功能蛋白表达量的标记，将绿色荧光蛋白-GFP基因插入特异性功能蛋白的启动子序列之后，该启动子序列为保守持家基因的启动子序列；然后将载有绿色荧光蛋白-GFP基因的PUC19质粒转入细菌体内，挑取性状稳定的个体以作后续研究；
步骤二、纳米材料的生物样品暴露过程
实验组将纳米材料以一定浓度分散在PBS缓冲液中，以1:10的体积比将分散有纳米材料的PBS缓冲液稀释到LB培养基中，对照组加入同样体积的PBS缓冲液但不含有纳米材料，同样以1:10的体积比将PBS缓冲液稀释到LB培养基中，同时对实验组和对照组接入同等数量的步骤一中构建的细菌荧光品系开始进行细菌的纳米材料暴露过程；本步骤的培养过程在37摄氏度的培养箱中进行，以150-200 rpm的速度进行4-6小时的生长和繁殖培养；
步骤三、荧光蛋白的表达检测
在载有绿色荧光蛋白-GFP基因的细菌荧光品系经过上述步骤二纳米材料处理之后，将实验组与对照组的菌株以1:20的比例稀释到PBS缓冲液中，进行共聚焦显微镜的镜检或流式细胞仪观测；通过激光器的荧光激发，观测荧光强度与荧光的分布，对比绿色荧光蛋白的表达情况；
步骤四、细菌的生长繁殖水平测定
将步骤二得到的实验组和对照组的细菌按同样倍数稀释后对涂到90 mm培养皿中，经过37摄氏度培养8小时后对形成的克隆数进行计数；
其中，上述的细菌为大肠杆菌 trans-1 ，所述的细菌荧光品系为将载有绿色荧光蛋白-GFP基因 的PUC19 质粒转入大肠杆菌 trans-1 中获得的性状稳定的个体。
2.根据权利要求1所述的一种快速检测纳米材料生物有效性的方法，其特征在于：步骤三中所述激光器的荧光为488 nm。
3.根据权利要求1所述的一种快速检测纳米材料生物有效性的方法，其特征在于：所述的细菌的生长繁殖水平测定采用测定600nm 处吸光值的方法来代替通过对细菌克隆形成数目的检测，所述的通过对细菌克隆形成数目的检测即为将步骤二得到的实验组和对照组的细菌按同样倍数稀释后对涂到90 mm培养皿中，经过37摄氏度培养8小时后对形成的克隆数进行计数。
4.根据权利要求2或3所述的一种快速检测纳米材料生物有效性的方法，其特征在于：PBS缓冲液制备过程如下：准确称量KCl 0.2g，KH2PO4 0.2g，NaCl 8.0g，Na2HPO4 •2H2O 1.56g，加蒸馏水定容至一升，并调节PBS缓冲液的氢离子浓度指数至7.4，然后在121摄氏度高温灭菌20分钟。
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