CN104232588A - 一种抗肝纤维化药物高通量筛选细胞模型的构建及应用 - Google Patents

Abstract

本发明基于Ⅰ型胶原α1在肝纤维化过程中高表达的特征，建立了以Ⅰ型胶原α1基因COL1A1启动子活性为靶点的高通量筛选系统，通过Ⅰ型胶原α1基因COL1A1启动子片段与pGL4.17表达载体重组质粒的构建、转染人肝星状细胞系(LX2)、以载体pGL4.17荧光素酶表达强度检测COL1A1启动子活性为指标，经筛选获得了稳定的单克隆细胞株LX2-COL，应用该细胞株对化合物S1-S7进行筛选，获得了对COL1A1启动子活性有明显抑制作用的化合物S7；mRNA实时RT-PCR及Western blotting分析均表明化合物S7能在转录及蛋白水平明显降低Ⅰ型胶原α1的表达，有望成为抗肝纤维化的候选药物。同时，表明所建立的系统可以在抗肝纤维化药物高通量筛选中得到应用。

Description

一种抗肝纤维化药物高通量筛选细胞模型的构建及应用

技术领域：

本发明涉及一种抗肝纤维化药物细胞模型筛选系统，尤其涉及一种基于肝纤维化基因相关启动子活性的抗纤维化药物高通量筛选系统。

背景技术：

肝纤维化是肝脏内的细胞外基质，特别是Ⅰ型胶原α1过度沉积的病理过程。它是机体对急、慢性肝损伤的一种修复反应，大部分慢性肝病都伴随肝纤维化。肝纤维化继续发展最终会导致肝硬化，而肝硬化在全球的发病率和死亡率中占很大比例，最终只能依靠肝移植来延续生命。研究表明，肝纤维化是可以逆转的，因此研究如何控制肝纤维化这一可逆的病理过程，对于肝纤维化及肝硬化的治疗具有十分重要的意义。

近年来，肝纤维化的临床治疗取得一些新进展，但是目前仅有中国批准上市两种中药复方，除针对病因治疗以外，尚无其他治疗药物。在药物筛选模型方面，抗丙型肝炎病毒(HCV)药物筛选系统研究较为成熟，用于筛选抗肝脏脂肪变性及磷脂质病已有细胞模型建立，除此之外，尚未见其他抗肝纤维化药物筛选模型的报道，且所述两种模型分别针对HCV及脂肪病变，并不适合所有抗肝纤维化药物的筛选。因此，建立新的药物筛选模型，寻找临床有效的抗肝纤维化药物，已成新药研发的当务之急。

胶原的过度表达是肝纤维化产生的基本特征，同时也是造成器官器质性病变的重要原因，其中Ⅰ型胶原α1在纤维化过程中发挥十分重要的作用。此外，在肝纤维化过程中，Ⅰ型胶原α1的高表达主要是在转录水平。近年来，本实验室以Ⅰ型胶原α1基因COL1A1启动子活性为靶标，筛选研究了潜在抗肝纤维化的药物。首先，利用基因重组技术，采用PCR的方法，从人类基因组中扩增出了全长为2436bp的Ⅰ型胶原α1基因COL1A1启动子序列，并将其克隆到荧光素酶报告基因载体上。然后将该荧光素酶报告基因的重组质粒转染到人肝星状细胞系(LX2)中，筛选出稳定表达COL1A1启动子的单克隆细胞株。进而利用所述细胞模型，筛选对COL1A1启动子活性具有抑制作用的化合物，并利用实时RT-PCR及Western Blotting方法，验证化合物在细胞水平对肝纤维化的影响。实验结果显示，本项研究能够提供一种简便有效的潜在抗肝纤维化药物高通量筛选方法。本发明所述抗肝纤维化药物高通量筛选模型的构建及其应用，迄今尚未见有国内外的相关报道。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种基于Ⅰ型胶原α1基因COL1A1启动子的抗肝纤维化药物高通量筛选系统。所述筛选模型由Ⅰ型胶原α1基因COL1A1启动子序列COL1A1P、携带荧光素酶报告基因pGL4.17载体构建的重组质粒pGL4.17-COL1A1P、稳定表达COL1A1启动子的单克隆细胞株LX2-COL、抗性筛选试剂G418、作为LX2活化诱导剂的致肝纤维化细胞因子TGF-β1以及荧光素酶报告基因检测系统构成。

本发明所述抗肝纤维化药物细胞筛选模型，是利用Ⅰ型胶原α1基因COL1A1启动子作为药物筛选的靶标，通过COL1A1启动子-单荧光素酶报告基因检测系统，根据荧光素酶作用于其底物所发出生物荧光的强度，判断COL1A1启动子的活性，以此预测判定所筛选化合物的抗肝纤维化效果。所以，本发明所提供的细胞模型筛选系统，可以高效、高通量地用于不同来源抗肝纤维化药物的筛选。能够抑制COL1A1启动子活性，并在LX2-COL单克隆细胞中使荧光素酶报告基因表达降低的化合物，即有可能成为抗肝纤维化的候选药物。

本发明提供的抗肝纤维化药物筛选系统的构建包括以下步骤：

1、Ⅰ型胶原α1基因COL1A1启动子目的片段的获取

利用NCBI人全基因组信息中COL1A1基因序列前约2400bp的序列作为COL1A1启动子序列。应用primer premier5.0引物设计软件，设计COL1A1启动子的引物，以人类基因组为模板进行PCR，扩增得到目的片段，全长为2436bp(Seq1)。

2、重组质粒pGL4.17-COL1A1P的构建

将扩增得到的目的片段与pGL4.17[luc2/Neo]载体进行双酶切后连接，经转化、提取质粒DNA等步骤，得到重组质粒pGL4.17-COL1A1P后，酶切鉴定并进行测序。

3、细胞因子TGF-β1强化COL1A1启动子活性的检测

由于TGF-β1是目前已知最重要的致肝纤维化的细胞因子之一，所以，将构建的重组质粒pGL4.17-COL1A1P转染到LX2细胞后，加入TGF-β1作为诱导LX2活化的诱导剂，以增强COL1A1启动子在LX2细胞的表达活性。

4、稳定转染pGL4.17-COL1A1P单克隆细胞株的筛选

将构建的重组质粒pGL4.17-COL1A1P转染到LX2细胞中，加入G418进行抗性筛选。获得单细胞克隆，加入荧光素酶底物(D-荧光素)，用活体生物发光成像系统拍摄，选择荧光强度最高的单克隆扩大培养，并命名为LX2-COL单克隆细胞株。

5、药物筛选的应用

LX2-COL单克隆细胞株无血清培养后，加细胞因子TGF-β1诱导，同时加入候选化合物S系列，以表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG作为阳性对照药。利用荧光素酶检测试剂盒检测，通过检测荧光，判断启动子活性。最后采用实时RT-PCR和Western blotting的方法，验证所筛选出化合物的抗肝纤维化效果。

发明效果：

1、本发明是一种基于Ⅰ型胶原α1基因COL1A1启动子活性的抗纤维化药物高通量细胞模型筛选系统。Ⅰ型胶原α1是肝纤维化过程中产生的一种非常重要的胶原蛋白，在各种肝纤维化进程中，均会出现在转录水平上的高表达。所以，将化合物对COL1A1启动子活性的影响作为靶标，具有很高的可靠性和适应性。

2、本发明细胞模型筛选系统所采用的细胞系是人肝星状细胞LX2，它是参与肝纤维化过程中最重要的细胞。此外，化合物在细胞中的活性及生物学功能更能接近于人的生理学状态。因此，通过该系统筛选得到的化合物更具临床实用性。

3、本发明细胞模型筛选系统是稳定表达COL1A1启动子活性的单克隆细胞株，筛选结果均一可靠、操作简便、高效快速，能够满足高通量筛选的要求。

4、本发明细胞模型筛选系统利用荧光素酶为报告基因，通过该检测系统，依据荧光强度反映COL1A1启动子的活性，进而显示化合物抗肝纤维化的抑制作用，效果直观，灵敏度高。

5、本发明细胞模型筛选系统可应用于不同化合物，包括天然产物、合成化合物、有机小分子、无机小分子、糖类、脂类中的一种或几种，其应用范围广，筛选几率高。

附图说明：

图1-pGL4.17-COL1A1P重组质粒的构建过程

图2-pGL4.17-COL1A1P重组质粒经HindⅢ酶切鉴定

其中：1-DNA标准分子量；2-pGL4.17-COL1A1P经HindⅢ酶切后的条带

图3-细胞因子TGF-β1强化LX2细胞COL1A1启动子活性检测

图4-LX2-COL单克隆细胞株荧光素酶表达强度的检测

图5-抗肝纤维化化合物S1-S7相对荧光素酶检测结果

图6-化合物S7抑制Ⅰ型胶原α1mRNA的实时RT-PCR分析，其中*p<0.05

图7-化合物S7抑制Ⅰ型胶原α1蛋白表达的Western blotting分析

具体实施方式：

下面结合附图和实施例对本发明进行详细描述，但所述内容是对本发明的解释而不是限定。

《实施例1》pGL4.17-COL1A1P重组质粒的构建

采用基因组DNA提取试剂盒，提取LX2细胞的基因组DNA。利用NCBI数据库人全基因组信息Ⅰ型胶原α1基因COL1A1序列(序列号：NC_000017.11)前约2400bp，作为COL1A1启动子序列。应用primer premier5.0引物设计软件，设计COL1A1启动子的引物，上下游引物序列分别为5’AAGAGCTCGTGGGAAAGCCTGGATGG3’(含SacⅠ酶切位点)，5’AAAGATCTTTTGGGACTTACTGTCTTCGT3’(含BglⅡ酶切位点)。以LX2细胞的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到目的片段Ⅰ型胶原α1基因COL1A1启动子，并利用琼脂糖凝胶电泳初步鉴定PCR产物。

将Ⅰ型胶原α1基因COL1A1启动子片段与pGL4.17[luc2/Neo]载体经Sac Ⅰ和Bgl Ⅱ双酶切后连接，连接反应液转化大肠杆菌DH5α感受态中，在LB固体平板，37℃倒置培养16-20h，挑取氨苄青霉素抗性单克隆，提取质粒DNA。利用菌落PCR、酶切等技术初步鉴定阳性克隆，获得重组质粒，命名为pGL4.17-COL1A1P(图1)。

质粒DNA经HindⅢ酶切后，出现长度为7.0kb和1.2kb的两条特异性条带，与理论相符(图2)。测序结果显示，该序列正确率均达99％以上，覆盖率达100％。

《实施例2》单克隆细胞株LX2-COL的筛选

1、TGF-β1强化COL1A1启动子活性检测

在含10％胎牛血清的DMEM(Gibco)培养基，37℃，5％CO2条件下培养LX2细胞(Mount Sinai School of Medicine)。按照每孔5×10⁴个细胞铺于48孔板，培养24h，用转染试剂lipofectamine2000(Invitrogen)推荐的方法瞬时转染6h，其中质粒pGL4.17-COL1A1P转染量为每孔100ng，内参质粒Renilla为每孔30ng，质粒：脂质体为1(μg)：2或2.5(μl)，每组实验设置3个复孔。经TGF-β1(2ng·mL^-1，R&D Systems))诱导24h后，用双荧光素酶报告基因检测系统(Reporter Assay System，Promega)检测荧光强度。每孔加入65μl1×细胞裂解液(PLB)，室温振摇15min，使细胞完全裂解，每孔取细胞裂解液10μl加入96孔白板中。避光加入50ul/孔的荧光素酶测试试剂II(LAR II)，记录萤火虫荧光素酶读数。取出96孔白板，避光加入50μl/孔Stop&Glo试剂，湮灭萤火虫荧光素酶反应，同时激活海肾荧光素酶反应，记录海肾荧光素酶读数。用萤火虫荧光素酶读数除以海肾荧光素酶读数，取平均值，求标准误差(图3)。结果显示，COL1A1启动子活性在TGF-β1的诱导下增强15.89倍。

2、稳定转染pGL4.17-COL1A1P的单克隆细胞株的筛选

在6孔板中培养LX2细胞达到接近90％-95％汇合时，进行细胞转染。24h后，加入浓度梯度G418(AMERCO)，最终选择浓度为100μg·mL^-1的G418继续培养转染pGL4.17-COL1A1P质粒的LX2细胞，并及时换液。待6孔板中的细胞长满后，铺单细胞到96孔板。待单细胞长成克隆(约1周-2周)，加D-荧光素(Thermo Fisher)至终浓度60μg·mL^-1，利用活体生物发光成像系统(IVIS200，Xenogen)拍摄，选择信号最强的单克隆扩大培养(图4)。结果显示，1-12号单克隆细胞株中，第6号单克隆细胞株活性最强，将其命名为LX2-COL单克隆细胞株，并扩大培养。

《实施例3》抗肝纤维化药物筛选及化合物活性鉴定

1、单荧光素酶报告基因检测系统筛选候选化合物

将LX2-COL单克隆细胞按照每孔2×10⁴个细胞铺于96孔板，待细胞汇合度约90％-95％后无血清培养，24h后加TGF-β1(2ng·mL^-1)诱导，同时加入候选化合物S1-S7(80μg·mL^-1)，以化合物表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG作为阳性对照药，每组实验设置3个复孔。作用24h后，吸弃原培养基，加入任意培养基50μl/孔。加入荧光素酶底物(Bright-Glo^TM Luciferase Assay System，Promega)50μl/孔，细胞裂解2min后进行检测(图5)。结果显示，加入化合物S7后，LX2-COL细胞株产生荧光最弱，即S7对COL1A1启动子活性抑制作用最强。

2、化合物S7抗肝纤维化作用的验证

1)Ⅰ型胶原α1的mRNA实时RT-PCR分析

在6孔板中培养LX2细胞，接近90％-95％汇合时，换无血清培养基饥饿24h，加TGF-β1(2ng·mL^-1)诱导的同时给药，24h后收集细胞。用Trizol(Invitrogen)提取RNA，用RNA Clean-up试剂盒(MN)纯化RNA，并用紫外分光光度计(BECKMAN DU800)测定RNA的浓度和质量。取2μg/样品用AffinityScript^TM Multiple Temperature cDNA Synthesis Kit(Agilent Technologies)逆转录得到cDNA，最后用ABI7500Fast实时荧光定量PCR仪(Applied Biosystem)进行检测(图6)。结果显示，化合物S7能够显著抑制Ⅰ型胶原α1的mRNA水平。

2)Ⅰ型胶原α1的Western Blotting检测

收集经过24h处理的LX2细胞，用PBS冲洗2遍，加入RIPA裂解液(碧云天)，4℃裂解30min，12000×g4℃离心15min，收集上清液，按Bradford法测定蛋白含量后等量分装。SDS-PAGE凝胶电泳，然后用湿转法将胶上的蛋白质分子转移到预处理后的PVDF膜(Milipore)上。在含5％脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液(含1％吐温20)PBST中轻轻晃动封闭1h，然后将不同的蛋白条带用对应的一抗，即β-actin抗体(Sigma)与Ⅰ型胶原抗体(abcam)4℃孵育过夜。用PBST洗膜三次后加入相应的二抗，即辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠二抗和羊抗兔二抗(中杉金桥)，室温孵育1h。用PBST洗膜三次后，加上HRP底物发光液(Milipore)，通过凝胶成像系统获取图片(图7)。结果显示，化合物S7能够显著抑制Ⅰ型胶原α1的蛋白表达水平。

本发明基于Ⅰ型胶原α1在肝纤维化过程中高表达的特征，建立了以Ⅰ型胶原α1基因COL1A1启动子活性为靶点的高通量细胞模型筛选系统，通过Ⅰ型胶原α1基因COL1A1启动子片段与pGL4.17表达载体重组质粒的构建、转染人肝星状细胞系(LX2)、加入转化生长因子β1(TGF-β1)为诱导剂、以载体pGL4.17荧光素酶表达强度检测COL1A1启动子活性为指标，经G418抗性筛选获得了稳定的单克隆细胞株LX2-COL，应用该细胞株对化合物S1-S7进行筛选，获得了对COL1A1启动子活性有明显抑制作用的化合物S7；mRNA实时RT-PCR及Western blotting分析表明，化合物S7能在转录及蛋白水平明显降低Ⅰ型胶原α1的表达，有望成为抗肝纤维化的候选药物。这也表明，本发明所建立的系统，有望在抗肝纤维化药物高通量筛选中得到应用。

Claims (5)

1.一种抗肝纤维化药物高通量细胞筛选模型，其特征是，所述模型由Ⅰ型胶原α1基因启动子序列COL1A1P、携带荧光素酶报告基因pGL4.17载体构建的重组质粒pGL4.17-COL1A1P、稳定表达COL1A1启动子的单克隆细胞株LX2-COL、抗性筛选试剂G418、作为LX2活化诱导剂的致肝纤维化细胞因子TGF-β1以及荧光素酶报告基因检测系统构成。

2.权利要求1所述的筛选模型，其特征是，所述重组质粒pGL4.17-COL1A1P是利用Ⅰ型胶原α1基因COL1A1序列设计引物，经PCR获得Ⅰ型胶原α1基因启动子序列COL1A1P，将其与pGL4.17载体经Sac Ⅰ和Bgl Ⅱ双酶切后连接、转化、提取质粒DNA得到。

3.权利要求1所述的筛选模型，其特征是，所述稳定表达COL1A1启动子的单克隆细胞株LX2-COL，是将重组质粒pGL4.17-COL1A1P转染到人肝星状细胞LX2中，经G418抗性筛选，根据荧光素酶报告基因检测结果，获取表达强度最高的单克隆细胞株，扩大培养得到。

4.权利要求1所述筛选模型在抗肝纤维化药物高通量筛选中的应用，其特征是，LX2-COL单克隆细胞株无血清培养后，加TGF-β1诱导，同时加入候选化合物，作用24h后，利用并根据荧光素酶报告基因检测荧光强度，反应COL1A1启动子的活性，进而显示化合物的抗肝纤维化抑制作用。

5.权利要求4所述的应用，其特征是，所述候选化合物选自天然产物、合成化合物、有机小分子、无机小分子、糖类、脂类中的一种或几种。