CN104178415B - 一种细胞图案化结构、制备方法及在细胞增殖抑制方面的应用 - Google Patents
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Abstract
一种基于有序聚合物薄膜的细胞图案化结构、制备方法以其在细胞增殖抑制方面的应用，属于细胞的定位组装技术领域。该方法和应用包括内壁负载有正电荷表面活性剂的有序多孔薄膜的制备、与细胞带相反电荷的聚电解质在有序多孔薄膜孔洞内壁的选择性组装、细胞在孔洞内的选择性吸附等步骤。此发明设备简单易得、操作方便、条件温和、周期短、可实现细胞在有序的蜂窝状薄膜孔内的选择性分布，而且通过大小合适的细胞的选择，可制得每个孔洞中只有一个细胞存在的单细胞阵列。此单细胞阵列在生物传感器、组织工程及单细胞携带和行为操作等领域均具有重要的意义。该结构在细胞的转移疏运、增殖抑制、一些癌症及其他疾病的治疗方面具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于细胞的定位组装、图案化结构制备及细胞在限定空间内活动的技术领域，具体涉及一种基于有序聚合物薄膜的细胞图案化结构、制备方法以及此结构在细胞增殖抑制方面的应用。
背景技术
细胞图案化结构由于可以在图案化基底上精确控制细胞的位置而在细胞生物学、药物传输、生物膜、生物传感器及细胞的行为研究等领域引起人们极大的兴趣(FUKUDA J,KHADEMHOSSEINI A,YEH J,ENG G,CHENG J J,FAROKHZAD O C,LANGER R,Biomaterials 2006,27,1479-1486)。相应的，许多种方法如微接触印刷(LAWRENCE N J,WEELS-KINGSBURY J M,IHRIGM M,FANGMAN T E,NAMAVAR F,CHEUNG C L,Langmuir 2012,28,4301-4308)、光刻(ROZHOK S,FAN Z F,NYAMJAV D,LIU C,MIRKIN C A,HOLZ R C,Langmuir 2006,22,11251-11254)、电子束光刻、浸蘸纳米光刻(KIMJ,SHIN Y H,YUN S H,CHOI D S,NAM J H,KIM S R,MOON S K,CHUNG B H,LEE J H,KIM J H,KIM K Y,J.Am.Chem.Soc.2012,134,16500-16503)和聚合物降解(PASPARAKIS G,MANOURAS T,SELIMIS A,VAMVAKAKI M,ARGITIS P,Angew.Chem.Int.Ed.2011,50,1-5)等被应用于细胞图案化结构的制备，虽然这些方法可以制备得到有序的细胞图案化结构，但是这些方法通常需要等离子刻蚀及昂贵的光刻设备等苛刻的实验条件，某些方法还涉及到复杂的化合物制备过程，而且这些细胞图案化结构大多是在二维的平面基底上制备。因此，如果能够发展一种简便快速的细胞图案化结构制备方法，必将对细胞图案化结构的应用起到促进作用，此外，如果能够在三维基底上制备细胞图案化结构，将有利于细胞活动的研究。
近年来，各种光刻、软刻蚀(XIA Y N,WHITESIDES G M,Angew.Chem.Int.Ed.1998,37,550-575)或者是自组装的方法如嵌段共聚物的微相分离(JEONGU,KIM H C,RODRIGUEZ R L,TSAI I Y,STAFFORD C M,KIM J K,HAWKER CJ,RUSSELL T P,Adv.Mater.2002,14,274-276)、胶体模板法(KULINOWSKI KM,JIANG P,VASWANI H,COLVIN V L,Adv.Mater.2000,12,833-838)，呼吸图案法(WIDAWSKI G,RAWISO M,FRANCOIS B,Nature 1994,369,387-389)以及微乳液滴法(LIANG J,MA Y Y,SUN H,LI W,WU L X,J.Colloid InterfaceSci.2013,409,80-87)被应用于有序蜂窝状结构薄膜的制备。而且细胞在这些蜂窝状聚合物薄膜上的吸附(BEATTIE D,WONG K H,WILLIAMS C,WARREN L AP,DAVIS T P,KOWOLLIK C B,STENZEL M H,Biomacromolecules 2006,7,1072-1082)、伸展(KAWANO T,NAKAMICHI Y,FUJINAMI S,NAKAJIMA K,YABU H,SHIMOMURA M,Biomacromolecules 2013,14,1208-1213)、分化(TSURUMA A,TANAKA M,YAMAMOTO S,SHIMOMURA M,Colloids andsurfaces A:Physicochem.Eng.Aspects 2008,313-314,536-540)及增殖(SUNAMI H,ITO E,TANAKA M,YAMAMOTO S,SHIMOMURA M,Colloidsand Surfaces A:Physicochem.Eng.Aspects 2006,284-285,548-551)等活动也被广泛研究。但是，细胞在此蜂窝状薄膜的孔内研究却仅限于一些选择性吸附实验(LEON A S D,HERNANDEZ J R,CORTAJARENA A L,Biomaterials 2013,34,1453-1460)。由于细胞内部和外部的机械力会影响细胞的各种生物过程，因此细胞在孔内的行为研究具有重要的意义。
考虑到由微乳液滴法可制备得到高度有序的蜂窝状薄膜，而且在此薄膜中正电荷表面活性剂主要分布在孔洞的内壁(MA Y Y,LIANG J,SUN H,WU L X,DANG Y Q,WU Y Q,Chem.Eur.J.2012,18,526-531)，所以以此正电荷的表面活性剂层为基础，基于静电相互作用可选择性的在孔内壁进行聚电解质的组装，由于大多数细胞的表面带有负电荷(BOROVICKA J,METHERINGHAM W J,MADDEN L A,WALTON C D,STOYANOW S D,PAUNOV V N,J.Am.Chem.Soc.2013,135,5282-5285)，所以如果预先将正电荷的聚电解质组装到孔内壁，那么基于静电相互作用，使细胞在孔内产生选择性分布便可实现，进而形成有序的细胞阵列。进一步地，如果吸附到孔洞内的细胞与孔洞的尺寸相匹配，就可以得到单细胞的有序阵列，而且由于孔洞的形状和尺寸的限制作用，细胞在限域内的行为研究也可被实现。
发明内容
本发明的目的是实现基于聚合物薄膜的细胞的选择性排列，并且通过选用与孔洞尺寸相近的酵母细胞为对象，构筑有序的单细胞阵列；由于孔洞的形状以及大小的限制作用，在形成形貌和大小与孔洞相近的细胞的同时，实现细胞的增殖抑制。
有序的单细胞阵列在生物传感器、组织工程及单细胞研究方面具有非常重要的意义，而且基于此结构基础上的细胞增殖抑制对于癌症、移植术后的再狭窄以及免疫系统疾病等的研究和治疗方面也具有重要的应用价值。
本专利的发明点在于通过微乳液滴法实现有序的蜂窝状薄膜的快捷制备。在获得的蜂窝状薄膜中，正电荷表面活性剂分布在孔的内壁上。因此，以此表面活性剂层为基础，可在孔内进行与细胞带相反电荷的聚电解质的组装，进而基于静电作用，实现细胞在孔内的选择性吸附。通过选用与孔洞尺寸相近的细胞为对象，可制得有序的单细胞阵列。将此阵列中的细胞继续培养后，可观察到由于孔洞的尺寸限制导致的细胞增殖抑制。
本发明包括以下步骤：
1)将聚合物和表面活性剂以20:1～60:1的质量比溶于有机溶剂中，制备聚合物浓度为4～7mg/mL的聚合物有机溶液，将此聚合物有机溶液与去离子水以10:1～50:1的体积比混合，超声10min后得微乳液，用200～220nm的滤头过滤此微乳液，然后在湿度为30％～40％、温度为25～30℃的环境中将过滤后的溶液浇铸在用去离子水、乙醇、去离子水依次清洗过的平滑基底(包括玻璃、石英或硅等)上成膜；待有机溶剂和去离子水完全挥发后，得到孔径为4～6μm、孔深为1～3μm六方堆积且周期性排列的有序多孔薄膜，与此同时，表面活性剂由于具有两亲性，分布在微乳液中的两相界面，进而分布在制得的有序多孔薄膜的孔洞内壁；
2)将步骤1)得到的孔洞内壁分布有表面活性剂的有序多孔薄膜浸入到1～3mg/mL的负电荷聚电解质溶液中，30～50min后，将薄膜取出，再浸入到乙醇与去离子水的混合溶液(体积比为1:6～1:9)中润洗5～10min，取出薄膜后在40～60℃条件下干燥30～50min；然后将干燥后的薄膜浸入到1～3mg/mL的正电荷聚电解质溶液中，30～50min后将薄膜取出，浸入到乙醇与去离子水的混合溶液中(体积比为1:6～1:9)润洗5～10min，取出薄膜后在40～60℃条件下干燥30～50min，从而得到孔洞内壁负载有正电荷聚电解质的有序多孔薄膜；
3)将4～6mL带有负电荷的细胞的溶液滴在步骤2)得到的孔洞内壁负载有正电荷聚电解质的有序多孔薄膜上，1～3小时后，将薄膜浸入磷酸缓冲溶液(PBS)中润洗3～5min，重复在PBS溶液中的润洗步骤4～6次，得到孔洞内吸附有细胞的有序多孔薄膜，从而完成细胞图案化结构的制备。
将新鲜的培养基(YPD，4～6mL)滴在步骤3)得到的孔洞内吸附有细胞的薄膜上，在30℃下培养6～12小时，观察细胞在孔洞内的生长增殖等行为。
所述聚合物为聚苯乙烯(PS)和聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)等，分子量为32～36万；有机溶剂为二氯甲烷、氯仿、苯或二硫化碳等；表面活性剂为双十二烷基二甲基溴化铵(DDAB)或双十烷基二甲基溴化铵(DDAB-10)等，负电荷聚电解质为聚苯乙烯磺酸钠(PSS)、聚丙烯酸(PAA)或聚谷氨酸(PGA)等，正电荷聚电解质为聚乙烯亚胺(PEI)、聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDDA)、聚烯丙基胺(PAH)或聚赖氨酸(PLL)等，带有负电荷的细胞为酵母菌细胞。
本发明采用的设备简单易得，操作方法便利，制备条件温和，得到的多孔结构以及细胞图案规整有序。通过将孔内壁选择性的修饰与细胞带相反电荷的聚电解质，细胞在薄膜上的位置可被精确控制，即分布在孔内而非薄膜上表面。通过合适大小的细胞的选择，可以制得每个孔洞中只有一个细胞分布的单细胞阵列，这种单细胞阵列在生物传感器、组织工程和单细胞携带及行为操作等方面都具有非常重要的意义。而且由于孔洞尺寸的限制，细胞在孔内的增殖等活动也被抑制，这种细胞增殖抑制的现象对于一些癌症及其他疾病的研究、控制和治疗均具有重要的应用价值。此外，由于本发明中聚合物薄膜的孔内可组装带电荷的物质，所以当在孔内组装细胞转染所必须的DNA和PEI后，细胞在孔内选择性吸附基础上的原位转染也成为可能。
附图说明
图1：实施例1制备得到的蜂窝状多孔膜的扫描电镜照片(a)及孔洞尺寸的高斯分布图(b)；
图2：步骤2)中用荧光基团标记的正电荷聚电解质代替正电荷聚电解质进行组装后得到的薄膜的激光共聚焦显微镜照片(a)及所选孔洞的荧光强度分布曲线(b)；
图3：细胞吸附实验前(a)后(b)薄膜的扫描电镜照片。
图4：细胞吸附实验后(a)及吸附后培养6小时(b)和培养12小时(c)薄膜的扫描电镜照片。
具体实施方式
以下实施实例对本发明做更详细的描述，但所述实例不构成对本发明的限制。
实施例1
将30mg PS(购于Sigma-Aldrich，分子量为35万)和0.5mg DDAB溶解在5mL二氯甲烷中制得聚合物的有机溶液，取50μL去离子水与1mL聚合物有机溶液混合，超声10min后得到微乳液，将此微乳液用220nm的滤头过滤，在湿度为30％、温度为25℃条件下将20μL得到的滤液滴在用去离子水、乙醇、去离子水依次清洗过的平滑玻璃基底上。待二氯甲烷和去离子水完全挥发后，在基底的聚合物膜表面得到孔径约为5.5μm、孔深约为2μm的有序多孔薄膜。
附图1是得到的有序多孔薄膜的扫描电镜照片及孔洞尺寸的高斯分布图。图1a是制得薄膜的扫描电镜照片，说明得到的多孔结构中孔洞呈有序的六方堆积且周期性排列。图1b是薄膜中孔洞尺寸的高斯分布，说明得到的多孔结构中，孔洞大小比较均一，约为5.5μm左右。
将得到的有序多孔膜浸入到1mg/mL的PSS溶液中，30min后，将薄膜取出，放入乙醇和去离子水的混合溶液(体积比为1:9)中润洗5min，然后放入40℃干燥箱中干燥30min；接下来，将干燥后的薄膜浸入浓度为1mg/mL的PEI溶液中，30min后取出，用乙醇和去离子水的混合溶液(体积比为1:9)润洗5min，最后放入温度为40℃干燥箱中干燥30min。
将上述PEI替换为荧光染料罗丹明异硫氰酸酯(简称RITC，购于西格玛奥德里奇化学试剂公司)标记的PEI(RITC-PEI)，重复以上组装步骤，用激光共聚焦显微镜观察，附图2是用RITC-PEI代替PEI进行组装后得到的薄膜的激光共聚焦显微镜照片及所选孔洞的荧光强度分布。图2a是组装RITC-PEI后薄膜的共聚焦激光显微镜图片，此图表明RITC-PEI均分布在孔洞的内壁，图2b是所选孔洞的荧光强度分布，说明孔内壁与其他位置的荧光强度的巨大差异。
将4mL含酵母菌细胞(20×106个/mL)的水溶液滴在制得的内壁负载有PEI的薄膜上，1小时后，将薄膜浸入PBS溶液中润洗3min，此在PBS溶液中的润洗步骤重复4次。用扫描电镜观察薄膜。图3是细胞吸附实验前后薄膜的扫描电镜图片，图3a是细胞吸附实验前的薄膜图，孔内几乎观测不到微米级的物质的存在；图3b是细胞吸附实验后的薄膜图，此图说明每个孔洞内均有酵母细胞存在，而且由于酵母的大小与孔洞尺寸相近，所以每个孔洞中只有一个酵母细胞，进而形成单细胞阵列结构。
将上述的酵母菌细胞替换为荧光染料4',6-二脒基-2-苯基吲哚(简称DAPI，购买于北京泛博生物化学有限公司)标记的酵母细胞后，重复以上吸附实验，然后用激光共聚焦显微镜表征，得到的结果显示，几乎所有的孔洞中都有酵母细胞存在，而且更重要的是每个孔洞中只有一个酵母菌细胞。
将新鲜的培养基(YPD)滴在制得的孔内吸附有酵母菌细胞的薄膜上，在30℃下培养6和12小时。用扫描电镜观察，图4是细胞生长不同时间的薄膜的扫描电镜图片，图4a是刚吸附完细胞的图片，图4b是培养6小时后的图片，此图说明细胞在孔内可以继续长大至与孔洞尺寸匹配，但是细胞的其他生命活动如分化、增殖等均没有体现，继续延长培养时间至12小时，增殖等活动仍没有被观察到。这说明基于此有序蜂窝状薄膜可实现细胞的增殖抑制。
实施例2
如实施例1所示，其他条件不变，将DDAB的质量变为1.0mg，制膜温度变为30℃，湿度变为40％，制得孔径约为4μm、孔深约为1.8μm的有序多孔薄膜。
然后按实施例1的步骤分别实现聚电解质PSS和PEI在孔内的组装、细胞在孔内的选择性分布及选择性分布基础上的细胞增殖抑制。
实施例3
如实施例1所示，其他条件不变，将负电荷聚电解质PSS换为PAA，实现PAA和PEI在孔内的组装，然后按实施例1的步骤分别实现细胞在孔内的选择性分布及选择性分布基础上的细胞增殖抑制。
实施例4
如实施例1所示，其他条件不变，将负电荷聚电解质PSS换为PGA，实现PGA和PEI在孔内的组装，然后按实施例1的步骤分别实现细胞在孔内的选择性分布及选择性分布基础上的细胞增殖抑制。
实施例5
如实施例1所示，其他条件不变，将正电荷聚电解质PEI换为PDDA，实现PSS和PDDA在孔内的组装，然后按实施例1的步骤分别实现细胞在孔内的选择性分布及选择性分布基础上的细胞增殖抑制。
实施例6
如实施例1所示，其他条件不变，将正电荷聚电解质PEI换为PAH，实现PSS和PAH在孔内的组装，然后按实施例1的步骤分别实现细胞在孔内的选择性分布及选择性分布基础上的细胞增殖抑制。
实施例7
如实施例1所示，其他条件不变，将正电荷聚电解质PEI换为PLL，实现PSS和PLL在孔内的组装，然后按实施例1的步骤分别实现细胞在孔内的选择性分布及选择性分布基础上的细胞增殖抑制。
实施例8
如实施例1所示，其他条件不变，将聚合物PS换为PMMA，制得孔径约为4.5μm、孔深约为1.8μm的有序多孔薄膜。
然后按实施例1的步骤分别实现聚电解质PSS和PEI在孔内的组装、细胞在孔内的选择性分布及选择性分布基础上的细胞增殖抑制。
实施例9
如实施例1所示，其他条件不变，将表面活性剂DDAB换为DDAB-10，表面活性剂的质量由0.5mg换为1.5mg，220nm的滤头换为200nm的滤头，制得孔径约为5μm、孔深约为2μm的有序多孔薄膜。
然后按实施例1的步骤分别实现聚电解质PSS和PEI在孔内的组装、细胞在孔内的选择性分布及选择性分布基础上的细胞增殖抑制。
Claims (10)
1.一种基于有序聚合物薄膜的细胞图案化结构的制备方法，其步骤如下：
1)将聚合物和表面活性剂以20:1～60:1的质量比溶于有机溶剂中，制备聚合物浓度为4～7mg/mL的聚合物有机溶液，将此聚合物有机溶液与去离子水以10:1～50:1的体积比混合，超声10min后得微乳液，用200～220nm的滤头过滤此微乳液，然后在湿度为30～40％、温度为25～30℃的环境中将过滤后的溶液浇铸在清洗过的平滑基底上成膜；待有机溶剂和去离子水完全挥发后，得到孔洞直径为4～6μm，孔洞深度为1～3μm的有序多孔薄膜，表面活性剂分布在制得的有序多孔薄膜的孔洞内壁；
2)将步骤1)得到的孔洞内壁分布有表面活性剂的有序多孔薄膜浸入到1～3mg/mL的负电荷聚电解质溶液中，30～50min后，将薄膜取出，再浸入到乙醇与去离子水的混合溶液中润洗5～10min，然后取出薄膜放入40～60℃的干燥箱中干燥30～50min；再将干燥后的薄膜浸入到1～3mg/mL的正电荷聚电解质溶液中，30～50min后将薄膜取出，然后浸入到乙醇与去离子水的混合溶液中润洗5～10min，最后取出薄膜放入40～60℃干燥箱中干燥30～50min，从而得到孔洞内壁负载有正电荷聚电解质的薄膜；
3)将4～6mL带有负电荷的细胞的溶液滴在步骤2)得到的孔洞内壁负载有正电荷聚电解质的薄膜上，1～3小时后，将薄膜浸入磷酸缓冲溶液中润洗3～5min，重复在磷酸缓冲溶液中的润洗步骤4～6次，得到孔洞内吸附有细胞的薄膜，从而完成细胞图案化结构的制备。
2.如权利要求1所述的基于有序聚合物薄膜的细胞图案化结构的制备方法，其特征在于：所述聚合物为聚苯乙烯或聚甲基丙烯酸甲酯，其分子量为32～36万。
3.如权利要求1所述的基于有序聚合物薄膜的细胞图案化结构的制备方法，其特征在于：有机溶剂为二氯甲烷、氯仿、苯或二硫化碳。
4.如权利要求1所述的基于有序聚合物薄膜的细胞图案化结构的制备方法，其特征在于：表面活性剂为双十二烷基二甲基溴化铵或双十烷基二甲基溴化铵。
5.如权利要求1所述的基于有序聚合物薄膜的细胞图案化结构的制备方法，其特征在于：负电荷聚电解质为聚苯乙烯磺酸钠、聚丙烯酸或聚谷氨酸。
6.如权利要求1所述的基于有序聚合物薄膜的细胞图案化结构的制备方法，其特征在于：正电荷聚电解质为聚乙烯亚胺、聚二烯丙基二甲基氯化铵、聚烯丙基胺或聚赖氨酸。
7.如权利要求1所述的基于有序聚合物薄膜的细胞图案化结构的制备方法，其特征在于：细胞为酵母菌细胞。
8.如权利要求1所述的基于有序聚合物薄膜的细胞图案化结构的制备方法，其特征在于：平滑基底为玻璃、石英或硅。
9.一种基于有序聚合物薄膜的细胞图案化结构，其特征在于：由权利要求1～8任何一项方法制备得到。
10.权利要求9所述的一种基于有序聚合物薄膜的细胞图案化结构在制备细胞增殖抑制药物方面的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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