CN104127875A - 一种小尺寸金纳米颗粒囊泡结构的基因载体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种小尺寸金纳米颗粒囊泡结构的基因载体及其制备方法。该金纳米颗粒的囊泡式结构有三部分组成，包括金纳米粒子，油相，和阳离子配体，其中阳离子配体连接到金纳米粒子上。本发明通过纳米级模版的方式，减小囊泡尺寸和生物毒性、提高该基因载体在转染过程中的稳定性、分散性，从而增加转染效率。本发明在基因转染和蛋白运输领域有着重要的研究价值和应用前景。

Description

一种小尺寸金纳米颗粒囊泡结构的基因载体及其制备方法

技术领域：

本发明涉及一种新型基因转染载体——小尺寸金纳米颗粒囊泡及其制备方法，属生物医学工程领域。 

背景技术：

基因转染是指将具有生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能。然而由于游离态的DNA分子容易被血清中的核苷酸酶降解，且很难穿过细胞间间质和细胞膜进入细胞，因此基因转染需要一定的转染试剂将带有目的基因的载体运送到细胞内，近年来开发高效安全的基因载体成为研究重点。 

传统基因传递系统中载体可分为两大类：一类是病毒载体，一类是非病毒载体。早期的病毒载体具有一定的自身缺陷，如免疫原性、生物安全性、难以大规模生产等不容忽略的问题，因而非病毒基因转染载体近年来引起广泛关注，并有望取代病毒类载体作用于今后的基因治疗研究。尤其是随着纳米技术的飞速发展，近年来纳米粒子生物转运载体因其简便的制备方法、较低的细胞毒性以及对各种物理化学刺激的响应能力等优势日益成为热点研究领域，各种表面功能化的纳米粒子已经成功应用于基因、药物和蛋白质转运，并取得了重要研究成果。其中金纳米颗粒具有其独特的优势：合成简便、操作容易、易于修饰、化学反应惰性以及良好的生物相容性等，并在基因载体方面受到了广泛地关注。金纳米粒子表面既可以与氨基发生非共价的静电吸附，又可以与巯基形成很强的共价键，是一种理想的基因转染载体材料。 

微纳米囊泡是生物医药研究领域的热点研究材料之一，这种功能性可广泛应用与生物催化、生物诊断、微型反应器构建和药物运转等研究领域。以纳米粒子作为囊壁，可将纳米粒子独特的物理化学性质整合到微囊中，通过对纳米粒子材料、尺寸、表面性质和自组装条件进行优化，可对微囊的物理化学性质，如机械强度、渗透性和表面化学性质等进行调控，得到集多种功能于一体的新型囊泡结构。在基因转载过程中载体的尺寸是至关重要的，载体的尺寸将决定其对内皮细胞灌输和对材料扩散传输的难易，通常来说，尺寸越小效率越高。但由于纳米粒子难以克服纳米级乳滴的界面能和拉普拉斯压力差，目前的方法只能自组装粒径为微米级的微囊，较大的尺寸限制了该类型微囊在细胞运转中的应用。 

因此获得小尺寸的纳米颗粒囊泡结构以作为基因转染载体仍然是当前基因转染研究领域的重要方向。 

发明内容：

1.本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种小尺寸金纳米颗粒囊泡结构的基因载体及其制备方法。 

2.小尺寸金纳米粒子囊泡式结构及其形成的基因载体是一种金纳米颗粒的囊泡结构，由三部分组成，包括：金纳米颗粒，油相，和阳离子配体，其中阳离子配体包括精氨酸、赖氨酸、组氨酸或者以上几种组成的阳离子多肽配体，所说的阳离子配体连接到金纳米颗粒上。所述的阳离子多肽配体包括KKK、KRK、HKRK。所述的金纳米颗粒囊泡结构平均尺寸小于150纳米。 

3.下面给出本发明所述的小尺寸纳米金颗粒囊泡结构基因载体的原理。本发明针对当前基因转染试剂存在的问题，提出了如下解决方案。该金纳米颗粒囊泡式基因载体所使用的金纳米颗粒(AuNPs)具有较低的细胞毒性，作为基因载体将产生较小毒性；以亚油酸为油相制备自组装所需的纳米级乳滴模板，并在乳化的同时加入少量的上述乳滴模板，利用球磨原理缩小乳滴尺寸；纳米囊泡尺寸小于150纳米，能顺利进入细胞，并同时提高转染效率；在加入乳滴模板后进行自组装时，表面带有正电荷且含有氨基类集团的AuNPs与乳滴中亚油酸的羧基形成的静电吸附与氢键吸附等，在这类超分子作用力的驱动下，AuNPs可稳定的吸附在乳滴表面，形成囊泡稳定地分散在水中；使用阳离子配体修饰AuNPs，有利于通过正负电荷相互静电吸引作用将带有负电荷的基因进行负载；其形成的AuNPs-基因复合物带有阳离子性质，有利于细胞对其进行摄取。因此该小尺寸金纳米粒子囊泡结构基因转染体系较传统的基因转染体系有较大的改进。 

该金纳米囊泡结构基因转染载体的制备方法，包括以下步骤(1)和步骤(3)，或步骤(2)和步骤(3)： 

(1)首先取10mg AuNPs，溶解于10mL蒸馏后的DCM中，通氮气10min以除去氧气，向该溶液中加入30mg如权利要求1所述的氨基酸类阳离子配体，通氮气5min后密闭，于室温搅拌48h，旋转蒸发洗涤后，在半透膜中渗透12h，最后分散于蒸馏水中。 

(2)取10mg AuNPs，溶解于10mL蒸馏后的二氯甲烷中，通氮气10min以除去氧气，向该溶液中加入30mg如权利要求1所述的阳离子多肽配体，通氮气5min后密闭，于室温搅拌48h，旋转蒸发洗涤后，在半透膜中渗透12h，最后分散于蒸馏水中。 

(3)取1.0μM步骤(1)或者(2)制成的阳离子配体修饰后的AuNPs与1.0μL亚油酸加入500μL磷酸盐缓冲溶液(5.0mM，pH7.4)中，机械震荡(5000rpm，100s)，使其充分乳化后得到浓度为6.4nM的O／W乳滴；取10μL该乳滴与步骤(1)或者(2)制成的阳离子配体 修饰后的AuNPs(2.5μM)在磷酸缓冲液中，混合搅拌10min，最终得到小尺寸囊泡式基因载体。 

本发明与现有技术相比具有的优异效果： 

(1)基因载体囊泡壁为AuNPs，具有优良的生物相容性。 

(2)基因载体具有较好的稳定性，尤其是与基因混合后在盐水及血清中能保持较好的稳定分散，具有较低的毒性。 

(3)基因载体的囊泡平均尺寸较小，与生物大分子之间有极强的亲和力，有助于细胞摄取，具有较高的转染效率。 

具体实施方式：

下面结合具体实施方式对本发明做进一步的描述。 

实施例：HKRK-AuNPs纳米粒子囊泡式基因载体 

(1)制备HKRK-AuNPs纳米粒子囊泡式基因载体 

将2.5μM HKRK-AuNPs与1.OμM表达绿色荧光蛋白(GFP)的质粒加入30μL磷酸盐缓冲溶液(5.0mM，pH7.4)中孵育10min。将1μL亚油酸500μL与HKRK-AuNPs(1.0μM)的磷酸盐缓冲溶液(5.0mM，pH7.4)中，机械震荡(5000rpm，100s)，使其充分乳化后得到浓度为6.4nM的O／W乳滴；取10μL该乳滴加入上述GFP-AuNPs混合液体中室温下混合搅拌10min，得到HKRK-AuNPs纳米颗粒囊泡式基因载体。动态光散射结果显示平均尺寸为130nm，zata电势为+30mV。 

(2)基因转染效率 

在进行转染实验前，先将Hela细胞培养于24孔板内，培养24h后用低温磷酸盐缓冲液清洗3次。取50μL的GFP-AuNPs囊泡复合结构加入至450μLDMEM培养液进行稀释，并将上述混合物加入细胞培养液中，置于温度为37℃，CO2浓度为5％的孵育箱中1h，然后加入新配制的含有10％FBS的DMEM培养液孵育1h后将细胞分离，使用流式细胞仪进行荧光检测GFP的转染效果。转染效率为77±5％。 

(3)细胞毒性评价 

细胞毒性评价采用阿尔玛蓝试剂检测法。取10μL步骤(2)中分离出的细胞用PBS清洗3次，加入含有10％阿尔玛蓝试剂的细胞培养液再培养2h，去除18μL细胞培养液，以560nm激发波长测培养液荧光强度。结果测得细胞毒性微弱。 

Claims (8)

1.一种小尺寸金纳米颗粒形成的囊泡结构，它是一种含有金纳米颗粒的囊泡结构，由三部分组成，包括金纳米颗粒(AuNPs)，油相，和阳离子配体。 

2.一种小尺寸金纳米颗粒形成的囊泡结构形成的基因载体，它是一种金纳米颗粒的囊泡结构，由三部分组成，包括金纳米颗粒(AuNPs)，油相，和阳离子配体。 

3.如权利要求1所述的小尺寸金纳米颗粒形成的囊泡结构，其特征在于阳离子配体包括精氨酸、赖氨酸、组氨酸或者以上几种组成的阳离子多肽配体。 

4.如权利要求1所述的小尺寸金纳米颗粒形成的囊泡结构，其特征是阳离子配体连接到金纳米颗粒上，所述的阳离子多肽配体包括KKK、KRK、HKRK。 

5.如权利要求1所述的金纳米颗粒囊泡，其特征在于所述的金纳米囊泡结构的平均尺寸小于150nm。 

6.如权利要求1所述的金纳米颗粒囊泡，其特征在于所述的金纳米颗粒平均尺寸大约2nm。 

7.根据权利要求2所述的金纳米粒子囊泡式基因载体，是将该囊泡式基因载体分散与水、或者磷酸盐水溶液、或者细胞培养液中的一种或者几种的混合液中。 

8.根据权利要求2所诉的金纳米粒子囊泡式基因载体，其特征包括以下步骤(1)和步骤(3)，或步骤(2)和步骤(3)： 

(1)首先取10mg AuNPs，溶解于10mL蒸馏后的DCM中，通氮气10min以除去氧气，向该溶液中加入30mg如权利要求1所述的氨基酸类阳离子配体，通氮气5min后密闭，于室温搅拌48h，旋转蒸发洗涤后，在半透膜中渗透12h，最后分散于蒸馏水中。 

(2)取10mg AuNPs，溶解于10mL蒸馏后的二氯甲烷中，通氮气10min以除去氧气，向该溶液中加入30mg如权利要求1所述的阳离子多肽配体，通氮气5min后密闭，于室温搅拌48h，旋转蒸发洗涤后，在半透膜中渗透12h，最后分散于蒸馏水中。 

(3)取1.0μM步骤(1)或者(2)制成的阳离子配体修饰后的AuNPs与1.0μL亚油酸加入500μL磷酸盐缓冲溶液(5.0mM，pH7.4)中，机械震荡(5000rpm，100s)，使其充分乳化后得到浓度为6.4nM的O／W乳滴；取10μL该乳滴与步骤(1)或者(2)制成的阳离子配体修饰后的AuNPs(2.5μM)在磷酸缓冲液中，混合搅拌10min，最终得到小尺寸囊泡式基因载体。