CN104120128A - 一种用于促进vhl基因表达的分离的核苷酸分子和促进剂及其制备 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于促进VHL基因表达的分离的核苷酸分子和促进剂，所述促进剂包含所述分离的核苷酸分子。具体的，所述分离的核苷酸分子含有能够在严紧条件下与miR-331-3p基因杂交的核苷酸序列。本发明还进一步公开了所述分离的核苷酸分子以及促进剂在促进VHL基因表达中的应用。

Description

一种用于促进VHL基因表达的分离的核苷酸分子和促进剂及其制备

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于促进VHL基因表达的促进剂及其制备。

背景技术

MiRNA的表达及调节异常常见于大量人类肿瘤中，包括肝细胞性肝癌(HCC)。在HCC细胞系中，miRNA芯片分析数据表明miR-331-3p可能是其中的一个异常表达的miRNA。

MicroRNA是有21-22个核苷酸组成的单链非编码小RNA，广泛存在于真核生物细胞中，通过与靶mRNA3’-非编码区域(3’-untranslated regions3’-UTR)的互补配对在转录后水平对基因表达进行调控，导致mRNA的降解或翻译促进(Bartel,2004；Calin&Croce2006)。MiRNA与靶mRNA分子组成了一个复杂的调控网络，参与包括细胞增殖、细胞凋亡、细胞分化、发育和逆境应答等多种复杂的调控网络(Gaal&Olah,2012；Lin et al.,2013)。大量实验结果表明miRNA在人类癌症中普遍失调。MiRNA能够促进涉及癌症发生发展的下游靶基因表达，从而作为致癌或者抑癌因子发挥作用(Zhang et al.,2007)。MiRNA表达失调可能是人类肿瘤发生的一个常见原因(Croce,2009)。

HCC是一种常见的癌症，主要致病因素是慢性HBV感染。有文献报道病毒感染能够干扰细胞内miRNA的表达(Lin&Flemington et al.,2011)。大量的研究表明，HBV能够通过涉及的miRNAs方式在HCC中发挥促癌作用(Xu et al.,2013；Wang et al.,2011；Zou et al.,2014)。

在之前的研究中报道过用基因芯片的方法研究miRNAs在HepG2和HepG2.2.15细胞中的差异性表达(Zhang et al.,2011)，从中，我们发现相对于对照细胞HepG2，miR-331-3p在HepG2.2.15细胞中呈上升的趋势。同样有文献报道过miR-331-3p在其他肿瘤中，例如：前列腺癌、胃癌、恶性胶质细胞瘤中发挥着重要的作用(Epis et al.,2014；Epis et al.,2012；Epis etal.,2011；Guo et al.,2010)，但是miR-331-3p是否参与HCC发生发展以及miR-331-3p的作用有哪些还需要进一步的研究。

VHL(von Hippel-Lindau tumor suppressor)综合征是一种显性遗传的家族继承性癌症综合征，能够诱发各种良性和恶性肿瘤。VHL基因的失活突变是造成VHL综合征家族性遗传的基础(Maher&Kaelin,1997)。VHL基因编码的蛋白质是包括转录延生因子B、转录延生因子C和cullin-2在内的蛋白复合物，并且具有泛素连接酶E3活性。此蛋白涉及缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor HIF)的泛素化和降解(Cockman&Masson,2000)。VHL基因突变与许多肿瘤，例如嗜铬细胞瘤、肾透明细胞癌、中枢神经系统和视网膜的血管瘤等的形成相关，表明VHL基因可能在这些癌症中起到一个肿瘤抑制作用(Latif et al.,1993；Kim&Kaelin,2004)。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中的缺陷，提供一种用于促进VHL基因表达的分离的核酸分子、促进剂及其制备。

本发明的第一方面，首先公开了一种促进细胞中VHL基因表达的分离的核酸分子，所述核酸分子包含：

a)双链RNA，所述双链RNA中含有能够在严紧条件下与miR-331-3p基因杂交的核苷酸序列；或者

b)shRNA，所述shRNA中含有能够在严紧条件下与miR-331-3p基因杂交的核苷酸序列。

其中，miR-331-3p基因的序列如SEQIDNO.8所示，具体为：GCCCCUGGGCCUAUCCUAGAA。

进一步的，所述双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与miR-331-3p基因中15-27个连续的核苷酸序列基本相同。较佳的，所述第一链的序列与miR-331-3p基因中19-23个连续的核苷酸序列基本相同；更佳的，所述第一链的序列与miR-331-3p基因中19、20或者21个连续的核苷酸序列基本相同。

更进一步的，所述双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与miR-331-3p基因中的靶序列基本相同。

所述双链RNA第一链和第二链的长度均为15-27个核苷酸；较佳的，长度均为19-23个核苷酸；最佳的，长度均为19、20或者21个核苷酸。

进一步的，所述双链RNA为小干扰RNA(siRNA)。更进一步的，所述小干扰RNA第一链的序列如SEQ ID NO：1所示，具体为5'-UUCUAGGAUAGGCCCAGGGGC-3'。

SEQ ID NO：1所示的siRNA为针对miR-331-3p基因的小干扰RNA的一条链，另一条链即第二链的序列与第一链序列互补，该siRNA可以起到特异性沉默细胞中miR-331-3p基因表达的作用。

所述双链RNA的第一链或所述shRNA的正义链片段与miR-331-3p基因中的靶序列基本相同，所述miR-331-3p基因的靶序列即为siRNA用于特异性沉默miR-331-3p基因表达时，被所述siRNA识别并沉默的mRNA片段所对应的miR-331-3p基因中的片段。

本发明第二方面公开了一种用于促进VHL基因表达的促进剂，所述促进剂含有前述所述分离的核酸分子。

所述的促进剂可以是将前述分离的核酸分子装入已知载体获得。进一步的，所述促进剂为装载有miR-331-3p基因的脂质体载体。

本发明的促进剂是将前述分离的核酸分子装入已知载体获得，所述已知载体为脂质体，用于特异性沉默miR-331-3p基因的表达，从而促进VHL基因的表达。

本发明第二方面，还进一步公开了前述促进剂的制备方法：直接将前述分离的核酸分子与载体混合即可。

较佳的，所述促进剂适用于SMMC7721细胞等哺乳动物肝癌细胞系。

本发明第三方面，提供了前述分离的核酸分子和促进剂用于促进VHL基因表达的应用。

本发明的前述分离的核酸分子和促进剂可以通过本领域任何已知的方式配制药物组合物来使用。这种组合物包含活性成分，加上一种或多种药物可接受的载体、稀释剂、填充剂、结合剂及其它赋形剂，这依赖于给药方式及所设计的剂量形式。本领域枝术人员已知的治疗惰性的无机或有机的载体包括(但不限于)乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、植物油、蜡、脂肪、多羟基化合物例如聚乙二醇、水、蔗糖、乙醇、甘油，诸如此类，各种防腐剂、润滑剂、分散剂、矫味剂。保湿剐、抗氧化剂、甜味剂、着色剂、稳定剂、盐、缓冲液诸如此类也可加入其中，这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味，在这种组合物中可以使用的制剂可是其原始化合物本身的形式，或任选地使用其药物学可接受的盐的形式，本发明的促进剂可以单独给药，或以各种组合给药，以及与其它治疗药剂一起结合形式给药。如此配制的组合物根据需要可选择本领域技术人员已知的任何适当的方式把促进剂进行给药。使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明的促进剂施用于人，其中口服安全有效量通常至少约100微克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明的第四方面，公开了一种促进VHL基因表达的方法，所述方法为将有效作用量本发明的所述分离的核酸分子或促进剂施用于作用对象。

所述方法为非疾病的诊断和治疗方法。

本发明的有益效果为：

本发明提供了一种能够促进VHL基因表达的特殊设计的分离的核苷酸分子及促进剂，

通过大量的实验证实，本发明的分离的核苷酸分子及促进剂能够显著促进过表达miR-331-3p的SMMC7721细胞中VHL基因在mRNA水平和蛋白水平的表达。为进一步研究VHL基因的功能提供了新的手段，加快了人们对VHL基因功能和机制的研究。

附图说明

图1：(d)miR-331-3p在转染miR-331-3p inhibitor或inhibitor NC的SMMC7721细胞中的相对表达量。(e,f)转染miR-331-3p inhibitor或inhibitor NC的SMMC7721细胞中VHL的mRNA或蛋白表达水平β-actin作为内参.*P<0.05,**P<0.01。

具体实施方式

下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。

实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件，如[美]Sambrook.J等著；黄培堂等译。分子克隆试验指南，第三版。北京：科学出版社2002中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1促进剂的构建及促进VHL基因的表达

1.试剂

(1)siRNA：第一链的序列如SEQ ID NO:1所示,下述，将其称之为miR-331-3p inhibitor；

(2)阴性对照siRNA(NC)第一链的序列如SEQIDNO:2所示，具体为：

5'-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3',下述将其称之为NC；

(3)LipofectamineTM2000购自于Invitrogen公司。

2.细胞株和载体

HepG2和HepG2.2.15细胞于含10％胎牛血清(FBS)(Gibco,USA)、100units/ml青霉素和100μg/链霉素(Hyclone,china)和1.2％丙酮酸钠(Hyclone,china)的MEM(Hyclone,china)培养基中培养。SMMC7721细胞于含10％胎牛血清(FBS)(Gibco,USA)、100units/ml青霉素和100μg/链霉素(Hyclone,china)的RPMI1640(Hyclone,china)培养基中培养。HepG2、HepG2.2.15和SMMC7721均于含5％CO2的37℃恒温孵箱中培养。HepG2和HepG2.2.15以60％的密度接种于六孔板，SMMC7721为45％。

3.实验方法

3.1细胞转染

以六孔板为例，在转染前，将SMMC7721按每孔45％的密板。

按照LipofectamineTM2000(Invitrogen)说明书进行转染：

1)用不含血清的MEM培养液配制工作液，分别于250μL不含血清的MEM培养基中加入5μl LipofectamineTM2000和75pmol待转染siRNA或阴性对照siRNA，室温静置5min；

2)将预先混好的LipofectamineTM2000和siRNA或阴性对照siRNA混合，放置25分钟；

3)将六孔板中培养基去除，将上一步所得混合液贴壁缓慢加入到六孔板中，轻微震荡混匀。孵箱中孵育6h后，去除转染液，换常规培养基(含双抗和血清)。

3.2细胞总RNA抽提

用Trizol(Invitrogen,Carlsbad,CA)提取总RNA并用DNase(Promega,USA)处理去除痕量DNA。

3.3检测miR-331-3p表达

根据说明书使用miRNA cDNA第一链合成试剂盒(康为世纪)逆转录合成加A cDNA进行miRNA qRT-PCR检测反应，microRNA检测使用的是miRNA荧光定量PCR检测试剂盒。

引物序列：miR-331-3p

U6作为内参。下游引物为试剂盒自带的Reverse primer。qRT-PCR实验每组均设置三个复孔并包含阴性对照组。数据通过2–ΔΔCT分析反应基因的相对表达量(Livak et al.,2001)。

3.4qRT-PCR检测VHL在mRNA水平的表达

根据说明书使用Reverse Transcription System(Promega,USA)逆转录为cDNA用于靶基因VHL的检测。根据说明书使用Ultra SYBR Mixture(with ROX)(康为世纪)检测靶基因VHL，引物序列：

以β-actin为内参：

qRT-PCR实验每组均设置三个复孔并包含阴性对照组。数据通过2–ΔΔCT分析反应基因的相对表达量(Livak et al.,2001)。

5.western blot检测VHL在蛋白水平的表达

SMMC7721细胞以45％的密度接种于60mm培养皿，分别转染阴性对照siRNA(166pmol)或者siRNA(166pmol)，转染48h后收获细胞并用RIPA(50mM TrisHCl,pH7.4,150mM NaCl,1％NP40,0.5％sodium deoxycholate,0.1％SDS,sodium orthovanadate,sodium fluoride,EDTA,leupeptin)和PMSF(Beyotime,China)提取细胞蛋白，离心后收集上清。使用增强型BCA蛋白检测试剂盒(Beyotime,China)检测蛋白浓度。Western blot操作流程为：将提取的蛋白样本以80μg等量分转，加蛋白上样Buffer(5×)，煮沸10min。用10％SDS-PAGE蛋白电泳(碧云天)分离样品，湿转法转至PVDF膜，5％脱脂奶粉封闭1.5h，加入一抗：VHL(兔抗1：1000稀释；bioworld)、β-actin(兔抗1：2500稀释；bioworld)，4℃孵育过夜。1×TBST洗膜5min×3次，加入二抗：羊抗兔(1：5000；bioworld)，室温孵育1.5h，1×TBST洗膜5min×3次。使用ECLTM化学发光检测系统(Pierce,USA)进行检测。一抗：兔抗VHL(Bioword,USA)，兔抗β-actin；二抗：羊抗兔(Bioword,USA)。

6.实验结果分析

qRT-PCR和western blot结果表明，在SMMC7721细胞中转染siRNA(miR-331-3pinhibitor)和阴性对照siRNA(NC)，转染siRNA(miR-331-3p inhibitor)(0.10±0.03)后，miR-331-3p表达量明显低于阴性对照siRNA组(NC)(1.01±0.20)(P＝0.001)对照组(图1d)。同时VHL的mRNA(2.37±0.37)表达水平和蛋白水平都比对照组NC(1.03±0.28)(P＝0.007)有所增高(图1e、f)。证明在肝癌细胞系中，本发明的siRNA(miR-331-3p inhibitor)对VHL有明显的促进作用。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (6)

1.一种促进细胞中VHL基因表达的分离的核酸分子，所述核酸分子包含：

a)双链RNA，所述双链RNA中含有能够在严紧条件下与miR-331-3p基因杂交的核苷酸序列；或者

b)shRNA，所述shRNA中含有能够在严紧条件下与miR-331-3p基因杂交的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的分离的核酸分子，其特征在于，所述双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与miR-331-3p基因中的靶序列基本相同；所述shRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所述正义链片段的序列与miR-331-3p基因中的靶序列基本相同。

3.根据权利要求1或2所述的分离的核酸分子，其特征在于，所述双链RNA为小干扰RNA，该小干扰RNA第一链的序列如SEQ ID NO:1所示。

4.一种用于促进VHL基因表达的促进剂，含有权利1-3任一权利要求所述分离的核酸分子。

5.根据权利要求1-3所述的分离的核酸分子或权利要求4所述的促进剂在促进VHL基因表达中的应用。

6.一种促进VHL基因表达的方法，所述方法为将有效作用量的如权利要求1-3所述的分离的核酸分子或如权利要求4所述的促进剂施用于作用对象。