CN104114175A - 用于清除癌干细胞的医药组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抗精神病药吩噻嗪衍生物在清除癌干细胞(CSCs)及/或预防癌症中的用途。本发明也提供了一种用于治疗癌症、及/或预防或延迟癌症复发的医药组合物，其包含三氟拉嗪(trifluoperazine)及一抗癌药物，如吉非替尼(gefitnib)或顺铂(cisplatin)。

Description

用于清除癌干细胞的医药组合物
技术领域
本发明涉及一种用于清除癌干细胞的医药组合物。
背景技术
近来，癌类干细胞(CSC)假说备受关注。CSCs拥有干细胞的特性，包括自我更新、抗压/抗药性及增进的移动性，其将导致肿瘤复发、转移及化疗抗药性。推定的CSCs首先鉴定为CD133+/Oct4+/Nanog+细胞(Eramo A et al.Cell DeathDiffer2008；15:504-514)，并在建立的非小细胞肺癌(NSCLC)细胞株中分离出(Pirozzi G et al.PloS one2011；6:e21548；and Leung EL et al.PloS one2010；5:e14062)。肺CSCs与肺先驱细胞可具有相同的功能特性，包括主动排除赫斯特染剂(Hoechst)33342的能力，在流式细胞仪检测中该能力确定了这些细胞为侧群体(side population)细胞(Storms RW et al.Blood2000；96:2125-2133)，并表达了高醛脱氢酶(ALDH)活性(Ginestier C et al.Cell Stem Cell2007；1:555-567)。CSCs大量地表达多重药物转运体ABCG2，并通过调变细胞内酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors，TKI)浓度显示对于TKI治疗的抗性(Ozvegy-LaczkaC et al.Mol Pharmacol2004；65:1485-1495)。因此，以癌细胞中的CSCs为标的可为克服抗药性的关键。例如，接受前线化疗的大部分晚期肺癌患者经历病情恶化(Pfister DG et al.J Clin Oncol2004；22:330-353)。该不佳的结果意味着当前的治疗方式，如外科手术及化学或放射治疗单独施行或两者组合，无法有效治疗或甚至控制这种疾病。在有特定表皮生长因子受体(EGFR)突变的NSCLC晚期患者，以EGFR-TKIs如吉非替尼(gefitnib)治疗的结果，明显优于传统的化疗药物(Maemondo et al.N Engl J Med362:2380-2388,2010；and Mok et al.N Engl J Med361:947-957,2009)。然而，在EGFR-TKI治疗后，几乎所有的患者最终会在数个月内发展为抗药性，并出现在原发部位肿瘤复发或转移到远处器官的情况。在这些患者之中，大约25％的患者最终将发展脑转移(Ceresoli et al.Ann Oncol15:1042-1047,2004；Kim et al.Lung cancer65:351-354,2009；Wu et al.Lung cancer57:359-364,2007；and Heon et al.Clin Cancer Res16:5873-5882,2010)。至今，一旦EGFR-TKI抗性及转移发生，并无有效的阻止手段。寻找能够满足临床需求的新药变得极为迫切。
发明内容
在本发明中，不可预期地发现数个抗精神病药吩噻嗪衍生物具有抗CSC的效果，可由其抑制肿瘤球体形成及抑低调控Wnt基因/β-连环蛋白信号传递的能力为证。更重要地，当其与吉非替尼(gefitnib)或顺铂(cisplatin)组合，本发明所使用的抗精神病药可增进治疗反应及克服抗药性，此意味着治疗各种癌症的巨大潜力。由于抗精神病药吩噻嗪可经由血-脑屏障到达大脑，本发明特别有利于治疗转移至大脑的癌症，如肺癌，其25％EGFR突变的患者在EGFR-TKI治疗后最终将发展脑转移。
因此，在一方面，本发明提供具有式I结构的化合物在制造一种用于清除CSCs的药物中的用途：
其中该10H-吩噻嗪衍生物具有一烷基取代基，其中A为N(CH3)2、N-甲基或N-乙基呱嗪基群(piperazinyl group)、N-(羟乙基)呱嗪基群、或N-甲基哌啶基群(piperidinyl group)，而B为SCH3、Cl、CF3或H。上述方法也可在有需要的个体中预防癌症。
另一方面，本发明也提供一种用于治疗癌症的医药组合物，其包含有效量之三氟拉嗪(trifluoperazine，TFP)及一抗癌药物。
又一方面，本发明也提供一种用于预防或延迟癌症复发的医药组合物，其包含有效量的三氟拉嗪一及抗癌药物。
再一方面，本发明也提供一种具有前述式I结构的化合物在制造用于预防癌症的药物中的用途。
附图说明
本发明上述发明内容及以下的详细说明与所附图式一并阅读将更增了解本发明。图式中：
图1提供三氟拉嗪对具吉非替尼抗性的NSCLC细胞抑制其增生及诱导其凋亡的效果，其中图1A提供96孔盘中各种NSCLC细胞经三氟拉嗪处理48小时的结果，细胞活力以细胞存活率试验(MTT)测量；图1B提供CL141细胞株以二甲亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)或指定浓度的三氟拉嗪培养48小时的结果，其数字代表总细胞于相对应象限的比率；右下方象限为早期凋亡细胞，右上方象限为晚期凋亡细胞；图1C显示侧群体试验的结果，其中三氟拉嗪(5μM)明显降低癌类干侧群体，CL141细胞由2.13％降至0.11％，而CL152细胞由1.95％降至0.06％；图1D显示三氟拉嗪(5μM)减少癌类干细胞的醛脱氢酶(ALDH)-阳性亚群，CL141细胞由4.31％降至0.84％，而CL152细胞由3.73％降至1.08％；而图1E显示三氟拉嗪剂量相关地激活CL97球体中凋亡讯息传递，包括Bax、Bak，以及裂解的PARP、凋亡蛋白酶-3和凋亡蛋白酶-9，反之，抗凋亡蛋白Bcl-2、XIAP以及Mcl-1受抑低调控。所有数值皆为三重复实验的平均值，误差线表示标准偏差，并有统计上显著差异，例如有无三氟拉嗪处理(*,P<0.05；**,P<0.01)。
图2提供三氟拉嗪(TFP)于抑制肺癌球体自我更新能力的效果，其中图2A及2B分别显示CL83、CL141以及CL97球体于三氟拉嗪处理48小时后的尺寸及数量(n＝3；**,P<0.01)；图2C提供于相显微镜下观察的CL141聚落(顶部面板)以及三氟拉嗪处理两周后计算的聚落数量(底部面板)，计入含有大于50个细胞的聚落且将对照组的聚落数量设定为100％(n＝3；**,P<0.01)；图2D提供以不同剂量三氟拉嗪处理48小时后，CD44及CD133在CL141及CL97癌球体中的表达，以western blot分析评估，β-肌动蛋白则作为内部校正；图2E提供CD133免疫染色影像及三氟拉嗪处理48小时后各种球体的核对比染色(4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)，DAPI)，显微照片以放大40倍拍摄；图2F提供于不同剂量的三氟拉嗪处理48小时后，c-Myc、周期蛋白D1及c-Met于CL97癌球体中的表达，以western blot分析评估，β-肌动蛋白则作为内部校正；而图2G提供于不同浓度的三氟拉嗪处理CL141癌球体24小时后的TCF/LEF转译，其细胞于亮度计纪录TOPflash及FOPflash活性之前溶解(n＝3；*,P<0.05；**,P<0.01)。
图3提供三氟拉嗪(TFP)与顺铂或吉非替尼组合治疗的效果，其中图3A显示传统化疗药物顺铂对各种NSCLC球体(SP)及其相对应的母细胞的半数最大抑制浓度；图3B及3C分别显示各种NSCLC球体以顺铂(10μM)处理24小时后，细胞活力试验及凋亡蛋白酶-3活性试验的结果；图3D显示CL83及CL141癌球体于三氟拉嗪与顺铂组合处理后细胞数量测量的结果；图3E提供由等效线图分析评估的三氟拉嗪与顺铂的组合，其中呈现暴露于所有可能的药物组合三氟拉嗪(0.5、2.5及5μM)及顺铂(2.5、5及10μM)48小时的EGFR-原生型(CL141)及EGFR突变细胞(CL97及CL25)的标准化等效线图；符号表示各者受影响比例的组合的数值；曲线以Calcusyn软件生产以符合实验目的，数据代表三个独立实验；低于线的值代表加乘的，接近线为相加的，高于线则为拮抗的；图3F显示CL141、CL97及CL25球体分别以三氟拉嗪(10μM)、吉非替尼(5μM)或两者(三氟拉嗪+吉非替尼)处理48小时，细胞数量测量的结果；图3G提供ALDH+细胞于CL141细胞中的比率，以流式细胞仪分析；图3H显示三氟拉嗪增进吉非替尼对CL141自我更新的抑制；分解的CL141球体以繁殖密度种于低附着力培养皿，以形成次级癌球体。所有数值皆为三重复实验的平均值，误差线表示标准偏差(**,P<0.01)。
图4提供三氟拉嗪(TFP)介导的抗肿瘤效果的活体内监测；其中图4A显示承载CL97超过四周的小鼠的代表性生物发光影像(顶部面板)并测量及绘制生物发光强度(bioluminescence intensity，BLI)中的变化作为BLI中随时间推移的倍率变化(底部面板)，其中CL97大量肿瘤细胞以静脉注射方式注射入NOD/SCID小鼠，随后接受不同治疗，即载剂(对照组)、三氟拉嗪(5mg/kg/天)、吉非替尼(150mg/kg/天，管喂)、或三氟拉嗪(5mg/kg/天，i.p)与吉非替尼(100mg/kg/天，管喂)的组合；肿瘤负担以生物发光强度中倍率变化测量及判定，并以排名递减方式排列：载剂对照组>吉非替尼>三氟拉嗪>组合治疗；值得注意的是，接受载剂对照组及吉非替尼的小鼠，其肿瘤负担并无显著差异，接受组合治疗的小鼠的肿瘤负担明显低于接受三氟拉嗪治疗者(*p<0.05)及接受载剂或吉非替尼者(**p<0.01)；图4B显示NOD/SCID小鼠具代表性的生物发光影像(顶部面板)，其中为进行致瘤性测试，载剂及三氟拉嗪预先处理(5μM<IC50，隔夜处理)的CL97肿瘤球体原位注射至NOD/SCID小鼠的肺；在三氟拉嗪预先处理的动物中明显延迟及压抑原位肿瘤生长(顶部面板)，以在BLI中倍数变化绘制的肿瘤负担测量(底部面板)显示两组之间的显著差异(*p<0.05)；图4C显示，与三氟拉嗪单独治疗、吉非替尼单独治疗及载剂对照组相较，三氟拉嗪与吉非替尼组合治疗对于β-肌动蛋白、c-Myc及周期蛋白D1提供最明显的表达压抑，而凋亡蛋白酶-3(一促凋亡分子)的表达量则于载剂对照组以外的所有治疗组别中上升；相似地，于三氟拉嗪预先处理的肿瘤球体中，β-肌动蛋白、c-Myc及周期蛋白D1的表达量也受到压抑，而激活的凋亡蛋白酶-3表达量则上升。总细胞裂解液收成自接受不同治疗的小鼠的肿瘤活组织切片，并检测其蛋白质谱。
具体实施方式
除非另外定义，否则本文所用途的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域技术人员一般所了解相同的含义。
除非上下文另外明确指出其它含义，否则单数形式「一」和「该」包括复数个指示物。因此，例如，在提及「一个样品时」，包括多个所述样品和其为所属技术人员已知的等效物。
本文所使用的「清除癌干细胞(CSCs)」一词是指降低CSCs数目及/或抑制其聚落形成能力及类干细胞标志物至一定程度而可压抑其肿瘤引发能力的过程。
本文所使用的「抗癌药物」一词是指任何提供抗癌效果的药物，包括但不限于吉非替尼(gefitnib)、顺铂(cisplatin)、得舒缓(Tarceva)及抗EGFR抗体。在本发明的具体实施例中，该抗癌药物较佳为吉非替尼或顺铂。
本文所使用的「抗精神病药吩噻嗪衍生物」、「抗精神病药物」或「抗精神病的药物」是指一群具有式I结构的化合物：
其中该10H-吩噻嗪衍生物具有一烷基取代基，其中A为N(CH3)2、N-甲基或N-乙基呱嗪基群(piperazinyl group)、N-(羟乙基)呱嗪基群、或N-甲基哌啶基群(piperidinyl group)；而B为SCH3、Cl、CF3或H。
根据本发明，具有式I结构的化合物的实例包括但不限于表1所示的抗精神病药物：
表1：抗精神病的药物
根据本发明，不可预期地发现某些已知的抗精神病药吩噻嗪衍生物有抗CSCs效果。
在本发明中，利用侧群体技术从CL141细胞株分离出的CSCs样细胞用于检测一些已知的抗精神病药物潜在的抗CSC效果。表2总结以细胞存活率试验(MTT)、侧群体及细胞聚落试验的结果。发现其中六种经测试抗精神病药物，包括三氟拉嗪(trifluoperazine)、硫利达嗪(thioridazine)、氯丙嗪(chlorpromazine)、羟呱氯丙嗪(perphenazine)、三氟丙嗪(triflupromazine)和丙嗪(promazine)可减低在CL141细胞株中的侧群体细胞比率(>50％)(表2)。
表2
ND:未确定。MTT及细胞聚落检测对A549细胞进行，而侧群体的数据则来自对CL141细胞进行的实验。
因此，根据本发明，作为CSCs抑制剂的抗精神病的药物可为三氟拉嗪、氯丙嗪、硫利达嗪、羟呱氯丙嗪、三氟丙嗪及丙嗪。
进一步的体外及体内实验显示，上述化合物，特别是三氟拉嗪，能够清除CSCs，例如肺CSCs(见实例)。
因此，本发明提供一种具有式I结构的化合物在制造用于清除CSCs的药物中的用途：
其中A为N(CH3)2，N-甲基或N-乙基呱嗪基群(piperazinyl group)，N-(羟乙基)呱嗪基群，或N-甲基哌啶基群(piperidinyl group)，而B为SCH3，Cl，CF3，或H。例如，该具有式I结构的化合物为三氟拉嗪、氯丙嗪、硫利达嗪、羟呱氯丙嗪、三氟丙嗪、丙嗪或其组合。
在本发明一具体实施例中，该具有式I结构的化合物为三氟拉嗪，其具结构为：
在一预防实验中，不可预期地发现相较于载剂处理的对照组，使用三氟拉嗪即显著减少原生肿瘤的生长，其中CL97-L2G细胞在原位植入NOD/SCID小鼠前以三氟拉嗪预先处理(图4B)。
因此，本发明亦提供一种具有式I结构的化合物在制造用于预防癌症的药物中的用途。
此外，在本发明中，也确认三氟拉嗪与抗癌药物的组合提供抑制CSCs的生长及/或分化以及减少抗药性的加乘功效。在本发明一具体实施例中，有效量的式I结构的化合物可与抗癌药物组合投予提供清除CSCs及减少癌症抗药性的加乘功效。
在本发明中进一步证实，在动物肺癌模型中，三氟拉嗪处理可压抑具吉非替尼抗性的肿瘤细胞的肿瘤生成(见实例)。
因此，本发明进一步提供一种在具标准化学治疗抗性的个体中治疗癌症的方法，包含与一抗癌药物组合而投予有效量的三氟拉嗪，其中该抗癌药物在投予三氟拉嗪之前、同时或之后投予该个体。在本发明的具体实施例中，该方法可减少对标准化学治疗的抗性及抑制CSCs的生长及/或分化。本发明亦提供一种用于在具标准化学治疗抗性的个体中治疗癌症的医药组合物。
根据本发明，用于同时投予的抗癌药物及三氟拉嗪可配制成二种个别的医药组合物或一种医药组合物。
如本文所使用，「有效量」或「治疗有效量」乙词是指足够用于清除癌干细胞或减少癌症抗药性的剂量，其根据投予模式及治疗情况，包括年纪、体重、症状、疗效、投药途径及治疗时间有所不同。例如，三氟拉嗪的有效量可为10-60mg/天，较佳为20-50mg/天，或更佳为35-45mg/天。
当癌症以手术、放射治疗及/或化学治疗初步治疗随后发展或返回，其称之为复发的(recurrent or relapsed)。例如，在经过以手术、放射治疗及/或化学治疗初步治疗的NSCLC患者中，大约1/3的患者诊断出复发的NSCLC。对NSCLC患者而言，手术切除仍是主要的治疗；然而报告指出，第一阶段的NSCLC的失败率为27％至38％，而且大约90％的癌症死亡与肿瘤复发或转移有关。在本发明中证实，在处理承载CL97大块肿瘤细胞的NOD/SCID小鼠模型3至4周后，三氟拉嗪单独或三氟拉嗪与吉非替尼的组合两者皆明显减低小鼠的肿瘤负担，然而以吉非替尼单独处理则无压抑肿瘤复发的效果(图4A)。
因此，本发明亦提供一种用于预防或延缓癌症复发的医药组合物，其包含有效量的式I化合物，特别是三氟拉嗪，以及抗癌药物如吉非替尼或顺铂。具体而言，该医药组合物应投予至经诸如手术、放射治疗及/或化学治疗的初步治疗后的癌症患者。
在本发明中，该有效成分可由任何适当的途径投予，包括但不限于肠胃外或口服投药。用于肠胃外投药的组合物包括溶液，悬浮液，乳液，及固体的可注射的组合物，其在使用前立即溶解或悬浮于溶剂中。该注射剂可由溶解、悬浮或乳化一个或多个有效成分于稀释剂中制备。前述稀释剂的实例为注射用蒸馏水、生理食盐水、植物油、醇及其组合。此外，该注射剂可含有稳定剂、增溶剂、悬浮剂、乳化剂、舒缓剂、缓冲剂、防腐剂等。该注射剂在最终制剂步骤灭菌，或由无菌程序制备。本发明的医药组合物亦可配制成无菌的固体制剂，例如冷冻干燥，并且可于灭菌后使用，或于使用前立即溶解于无菌注射水或其他无菌稀释剂。
以下实例更进一步地说明本发明。其系提供作为例示说明而非限制的目的。
实例
1.材料及方法
细胞培养，化学试验及细胞聚落试验
NSCLC癌细胞株A549、H1975、CL25、CL83、CL97、CL141及CL152培养于RPMI培养基中。试验的细胞以每孔104个细胞分别种养于6孔盘中14天。每孔各包含10ml RPMI培养基作为NSCLC细胞的培养环境。三氟拉嗪、氯丙嗪、硫利达嗪、三氟丙嗪及丙嗪均购自Sigma，而羟呱氯丙嗪则购自prestwick。三氟拉嗪及其它试验药物于种养细胞24小时后加入。培养基及三氟拉嗪在第四天更换一次。经处理后，细胞以磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，而细胞聚落以五种溶液固定(乙酸：甲醇＝1:3)并于甲醇中以0.5％结晶紫染色。于小心移除结晶紫并用自来水冲洗之后，以人工计算细胞聚落数。
侧群体分析及利用流式细胞仪纯化
细胞的单细胞悬浮液以胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(Trypsin-EDTA)(Invitrogen)自培养盘分离，并于以3％胎牛血清和10mM羟乙基呱秦乙硫磺酸(Hepes)补充的Hank’s平衡盐溶液(HBSS)中以1×106细胞/mL悬浮。接着，该细胞单独或在50μmol/L维拉帕米(verapamil，Sigma，一种维拉帕米敏感ABC载体的抑制剂)的存在下，以20μg/mL的Hoechst33342(Sigma Chemical,St.Louis,MO)于37℃培养90分钟。于90分钟培养后，立即于300g及4℃离心细胞5分钟并于冰冷的HBSS悬浮。该细胞保存于冰上以防止Hoechst染剂流出，并加入1μg/mL碘化丙啶(propidium iodide，PI)(BD)以区别死亡的细胞。最后，该细胞经40μm细胞过滤器(BD)过滤以获得单一悬浮细胞。细胞双波长分光亮度分析及纯化于双雷射荧光活化细胞分类计(BD)进行。Hoechst33342以355nm紫外线激活，并以450/20带通(band-pass，BP)过滤器激射蓝荧光，及以675nm高通滤波器(edge filter long-pass，EFLP)激射红荧光。使用610nm的双色滤镜短通滤波器(dichroic mirror short-pass，DMSP)分离激射波长。正型PI(死亡)细胞自本分析中排除。
软琼脂培养基试验
刚分类的CL141侧群体(SP)及非侧群体(NSP)细胞，于1％琼脂糖覆盖的六孔盘以每孔200个细胞、一式三份计算及固定。于有或无三氟拉嗪(0、5及10μM，每四天更换)的环境媒介培养10至14天后，评估其非贴附性生长。培养皿以0.005％结晶紫染色，并在显微镜底下以人工计算细胞聚落及拍照。
肿瘤球体试验
为使肿瘤球体形成，细胞培养于HEScGRO无血清培养基(人类)(Chemicon)，并以20ng/mL人表皮细胞因子(Hegf)、10ng/mL人类酸性纤维母细胞生长因子(hFGF-b)及NeuroCultNS-A增殖补给品补充。于低附着力的12孔盘，以低密度(1000细胞/mL)种入每孔1mL的细胞。计算球体(紧密，球状，直径>90μm的非黏附性物质)，并以目镜测微计测量每群体至少50个球体。为进行二级球体试验，初级球体以机器分离并如同初级试验进行。为量化球体形成细胞的比率，于96孔盘种入每孔一个细胞。
报告基因试验
将球体细胞置于6孔盘，生长至80％-90％汇集，并使用Lipofectamine以1.8μgTOPflash或FOPflash质体瞬间地转移感染。TOPflash包含胸腺嘧啶激酶(TK)启动子及萤火虫荧光基因上游的三份Tcf/Lef基因结合位点，FOPflash包含突变的Tcf/Lef位点，并作为对照组供测量报告基因的非特定性激活。为使转移感染效率符合标准，细胞以0.2μg编译Renilla reniformis荧光酶的内部控制报告基因共同转移感染，该基因由TK启动子调控。于转移感染后，细胞以具有/或无三氟拉嗪(0–10μM)的培养基培养48小时，并于收成后以报告基因溶解缓冲液溶解。荧光酶的活性使用Microplate Luminometer(Berthold)以Luciferase Assay System(Promega)测定。该实验重复三次进行，而该实验结果在转移感染效率标准化之后，经与对照组比较，以诱发倍率呈现。
Aldefluor试验
在本研究中，表达高度活性的醛去氢酶(ALDH)用于侦测肺CSC群体。Aldefluor试验根据制造商(StemCell Technologies)的指引进行。简而言之，自细胞培养取得的单细胞以含有ALDH萃取物(bodipy-aminoacetaldehyde，BAAA)的Aldefluor试验缓冲液于37℃培养50分钟。每份样品的一部分细胞，在相同条件下加入ALDH抑制剂(diethylaminobenzaldehyde，DEAB)培养以作为阴性对照。使用流式细胞仪测量ALDH-阳性细胞群体。
Western Blot分析
溶解细胞于溶解缓冲液(50mM Tris–HCl，pH7.4，5mM MgCl2，1％NonidetP-40，150mM NaCl，1mM苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride))。分离总蛋白并予以进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及电转至PVDF膜上(Millipore)。初级抗体Bax、Bak、Bcl-2、X染色体相关IAP(XIAP)、Mcl-1、裂解的凋亡蛋白酶-9、凋亡蛋白酶-3、多(ADP-核糖)聚合酶(polyADP-ribose polymerase，PARP)、c-Myc、CD44、周期蛋白D1(Cyclin D1)取自Cell Signaling，Met从Santa Cruz购入，CD133则来自Miltenyi Biotec，辣根过氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的抗鼠及抗兔的次级抗体来自ChemiconInternational。蛋白侦测以取得自Luminescence Imaging System(LAS-4000TM,FujiPhoto Film Co.,Ltd)的增进化学发光(ECLTM)方法进行。
产生一个稳定的双重表达报告基因的肺癌细胞株
双重光学的报告基因系统L2G融合建设(萤火虫荧光酶2及eGFP)是来自Stanford University的Gambhir博士的慷慨赠礼。据其生产稳定表达L2G的CL97细胞。简而言之，L2G报告基因与CL97细胞的稳定整合由慢病毒载体介导的基因转化产生。以慢病毒载体L2G转移感染293FT细胞(包装质体pCMVΔ8.74及外套膜质体pMD2.G(Nat Biotechnol1997；15:871-875))。标的CL97细胞以病毒颗粒感染及使用Zeocin筛选。以此取得具有L2G报告基因系统的CL97细胞(CL97-L2G)并用于后续实验。
使用非侵入式生物冷光影像技术评估三氟拉嗪的抗CSC效果
NOD/SCID小鼠购自国立台湾大学并以符合机构的政策维持的。所有动物的程序经国家动物实验中心(IACUC)于台北医学大学认证。
关于大量的肺肿瘤模型，CL97-L2G细胞以1×106细胞/100μl PBS的浓度经由尾静脉注射入动物体内。于肿瘤注射一周过后，开始不同的治疗方案。进行下列四种方案：三氟拉嗪(5mg/kg/天)，吉非替尼(150/mg/kg/天，管喂)及三氟拉嗪(5mg/kg/天，腹膜内注射)+吉非替尼(100mg/kg/天，管喂)的组合为期四周。
为检测三氟拉嗪预防及抗CSC的效果，CL97-L2G球体以三氟拉嗪预先处理(5μM，<IC50，隔夜)，再悬浮其球体的形式并原位注射入NOD/SCID小鼠的肺(1x104细胞/50μL基底膜/接种)。动物并未在实验期间接受进一步的治疗。使用IVIS200系统(Caliper Life Sciences)将承载CL97-L2G的小鼠(包括大量肺肿瘤及CSC模型)每周呈像。数据以在总光子通量/初始总光子通量中的倍率变化呈现并使用Living Image1.0软件(Caliper Life Sciences)分析。小鼠于实验结尾以人道方式牺牲，并取得肺肿瘤活组织切片供进一步分析。
II.结果
三氟拉嗪抑制具吉非替尼抗性的NSCLC细胞增殖和诱导凋亡
假设三氟拉嗪将通过发挥其抗CSC效果抑制肿瘤生长以及克服抗药性。除常用的细胞株(A549及H1975)，亦建立数个细胞株包括CL83、CL141、CL152、CL25和CL97细胞株，其分离自国立台湾大学附设医院的NSCLC患者的胸腔积液。该研究经国立台湾大学附设医院的机构审查委员会认可。这些细胞株的主要特征的概要，包括其组织学上及突变的特点及其是否对于EGFR TKIs有天生的或后天的抵抗力，于表3说明。经证实三氟拉嗪剂量相关地抑制NSCLC生长，以及CL83、CL141、CL152、CL25、CL97和H1975各自的IC50值(48小时培养)分别为14、8.5、12、13、7.2及15μM(表3及图1)。
表3.本研究中，对于非小细胞肺癌细胞株的临床特性、基因突变及对于EGFR-TKI和三氟拉嗪的反应。
WT:野生型；EGFR-TKI:表皮生长因子接受器酪氨酸激酶抑制剂。
H1975及A549的临床信息获取自ATCC。
*ND:未确定。
于这些细胞株中选用CL141，其为一表达吉非替尼抗性野生型EGFR的腺癌，以其作为凋亡分析的代表性的细胞株。以不同剂量三氟拉嗪处理后进行磷脂结合蛋白V(Annexin V)/PI双染色法。早期及晚期凋亡细胞皆计入。于48小时后，与对照组细胞相比，经三氟拉嗪处理后的CL141细胞于磷脂结合蛋白V-阳性细胞中表达剂量相关的增加(图1B)。该结果显示三氟拉嗪抑制具吉非替尼抗性的NSCLC细胞增殖并诱导其凋亡。
三氟拉嗪减少肺CSCs的比率及诱导其凋亡
挑选具吉非替尼抗性的细胞株CL83、CL141、CL152(连同野生型EGFR)及CL97(具有EGFR-G719A+T790M突变种)并使用侧群体方法(分别为侧群体细胞的1.54％、2.13％、1.95％、及1.9％)分离其CSCs。经5μM三氟拉嗪处理后，侧群体细胞比率明显下降(图1C)。
为进一步厘清，检测三氟拉嗪处理是否能减少ALDH表达细胞的比率，其为一用于造血及NSCLC CSCs的人工标记。挑选CL141(腺癌)及CL152(鳞状细胞癌)作为具代表性的标的NSCLC细胞株。三氟拉嗪处理降低ALDH+CL141细胞数量，由4.31％至0.84％，而CL152细胞则由3.73％至1.08％(图1D)。
为研究三氟拉嗪处理后肺CSCs中凋亡相关的信息传递，挑选CL97(具有EGFR-T790M后天抗性突变的腺癌)作为标的细胞株。CL97癌球体经三氟拉嗪处理后，Bax、Bak、裂解的PARP、凋亡蛋白酶-3及凋亡蛋白酶-9剂量相关地增加，而抗凋亡的Bcl-2、XIAP及Mcl-1减少(图1E)。
三氟拉嗪抑制肺CSCs的聚落形成能力及干性相关标志物
三种不同具吉非替尼抗性的肺CSCs，包括CL141(野生型EGFR)、CL83(野生型EGFR)及CL97(EGFR-G719A+T790MC后天抗药性突变)以三氟拉嗪处理以检测其对于肿瘤球体形成的影响。于全部球体中三氟拉嗪剂量相关地缩小其尺寸及减少其数量(图2A、2B及2C)。于5μM或10Μm的三氟拉嗪处理12天后，软琼脂培养基上的CL141球体的平均聚落形成降低(图2C，平均群落数量，对照组：92，5μM:32，10μM:8)。CL141及CL97球体以渐增剂量的三氟拉嗪(0、2.5、5及10μM)处理48小时。二人工的肺CSC标志CD44及CD133，以三氟拉嗪剂量相关地抑低调控，其经western blot法及免疫组织化学染色测量(图2D及2E)。
为探讨以三氟拉嗪调控的分子机制，CL97球体以三氟拉嗪处理并以westernblot法分析。三氟拉嗪减少Wnt/β-连环蛋白信号传递下游的标的、周期蛋白D1、c-Myc及c-Met(图2F)。此外，三氟拉嗪(低浓度，2.5μM)抑制CL141球体中阻断球体形成的T细胞因子(ＴCell Factor，TCF)介导的转译(图2G)。
三氟拉嗪与顺铂或吉非替尼组合可于生物体外加乘抑制肺CSCs
挑选三个具吉非替尼抗性的细胞株，CL141(野生型EGFR)、CL83(野生型EGFR)及CL97(EGFR-G719A+T790MC后天抗药性突变)以测定三氟拉嗪是否能使这些细胞对化疗药物敏感。当以10μM的顺铂处理24小时，所有CL141、CL83及CL97球体皆较其母细胞明显呈现更高的IC50值(图3A)。在相同条件下，所有球体相较于其母细胞皆呈现较高的活力及较低的凋亡蛋白酶-3活性(图3B及3C)。
接着，检测三氟拉嗪是否能增进顺铂或吉非替尼的细胞毒性效果。CL83及CL141球体中，三氟拉嗪与顺铂组合处理提供较三氟拉嗪或顺铂单独处理明显更高的细胞毒性效果(图3D)。
三氟拉嗪和顺铂组合活性的评估，使用等辐射技术进行(Chou TC and TalalayP.Adv Enzyme Regul1984；22:27-55)。低于线的值代表加乘的，接近线为相加的，高于线则为拮抗的。二药物的加乘活性以获取自EGFR-野生性细胞(CL141)、EGFR-G719A+T790M突变细胞(CL97)及EGFR-去除外显子19细胞(CL25)的标准化等效线图显示(图3E)。于CL141、CL97及CL25球体中亦发现增进的细胞毒性。为研究三氟拉嗪对于吉非替尼治疗的效果，进行抑制CL25(对EGFR-TKI具高敏感度的细胞株)球体生长试验作为正对照组。CL25球体暴露于单一药物或三氟拉嗪与吉非替尼组合，CL141及CL97细胞株亦同(图3F)。单独吉非替尼有效地压抑CL25球体形成，但对CL141及CL97细胞明显较低。三氟拉嗪与吉非替尼的组合明显压抑CL141及CL97球体形成。这些发现显示三氟拉嗪的加入使具吉非替尼抗性的肺癌细胞敏感化。此外，ALDH+CL141细胞的比率于10μM三氟拉嗪时适度降低。然而，当三氟拉嗪与5μM吉非替尼组合，呈现增进的抑制效果(图3G)。对CL141球体形成亦呈现相似的增进抑制效果(图3H)。
三氟拉嗪治疗压抑老鼠肺癌模型中具吉非替尼抗性的L97-L2G肿瘤生成
承载具吉非替尼抗性的CL97-L2G(G719A+T790M后天抗药性突变)细胞的NOD/SCID小鼠用于评估三氟拉嗪的抗肿瘤效果。首先，将CL97大量肿瘤细胞静脉注射入NOD/SCID小鼠的尾静脉，继而接受以单独三氟拉嗪(5mg/kg/天，i.p)、单独吉非替尼(150mg/kg/天，管喂)，或三氟拉嗪(5mg/kg/天，i.p)与吉非替尼(100mg/kg/天，管喂)组合治疗的载剂。相较之下，单独接受三氟拉嗪的小鼠比单独接受载剂或及吉非替尼的小鼠呈现明显较低的肿瘤负担(图4A)。如预测，以吉非替尼治疗的小鼠与载剂对照组群显示相似的肿瘤负担。接受吉非替尼/三氟拉嗪组合治疗只小鼠表现最低的肿瘤负担。肿瘤负担基于生物发光强度中的倍数变化测量及定量。
于预防实验中，CL97-L2G细胞以载剂或三氟拉嗪(5μM，<IC50)预先处理并原位移植至NOD/SCID小鼠体内。相较于载剂处理对照组，接受三氟拉嗪预先处理的CL97-L2G细胞的小鼠表现延迟的及明显减少的原位肿瘤生长(图4B)。为探讨以三氟拉嗪调控的分子机制，自肿瘤样品中收集总蛋白裂解液。具干性的分子包括c-Myc及β-连环蛋白，其表达量下降。三氟拉嗪及组合处理两者皆压抑周期蛋白D1的表达，而三氟拉嗪及组合处理两者皆增加凋亡蛋白酶-3的激活形态(图4C)。吉非替尼处理并未明显影响c-Myc或β-连环蛋白的表达量。
相信本发明所属领域的技术人员基于本文的叙述，无须进一步的例示即可将本发明应用至其最广泛的范围。因此，应了解此处所提供的叙述及申请专利范围系供例示目的而非以任何方式限制本发明的范畴。

Claims (26)

1.一种具有式I结构的化合物在制造用于清除癌干细胞(CSCs)的药物中的用途，
其中A为N(CH3)2，N-甲基或N-乙基呱嗪基群(piperazinyl group)，N-(羟乙基)呱嗪基群，或N-甲基哌啶基群(piperidinyl group)，而B为SCH3，Cl，CF3，或H。
2.如权利要求1所述的用途，其中该化合物为三氟拉嗪(trifluoperazine)、硫利达嗪(thioridazine)、氯丙嗪(chlorpromazine)、羟呱氯丙嗪(perphenazine)、三氟丙嗪(triflupromazine)及丙嗪(promazine)或其组合。
3.如权利要求2所述的用途，其中该化合物为三氟拉嗪。
4.如权利要求1所述的用途，其中该CSCs为肺CSCs。
5.如权利要求4所述的用途，其中该CSCs为非小细胞肺CSCs。
6.一种用于治疗癌症的医药组合物，其包含有效量的具有式I结构的化合物及一抗癌药物，
其中A为N(CH3)2，N-甲基或N-乙基呱嗪基群(piperazinyl group)，N-(羟乙基)呱嗪基群，或N-甲基哌啶基群(piperidinyl group)，而B为SCH3，Cl，CF3，或H。
7.如权利要求6所述的医药组合物，其中该化合物为三氟拉嗪。
8.如权利要求6所述的医药组合物，其中该化合物及抗癌药物为二种不同配方的形式或同一配方的形式。
9.如权利要求6所述的医药组合物，其中该抗癌药物为吉非替尼(genifinib)或顺铂(cisplatin)。
10.如权利要求6所述的医药组合物，其能有效清除CSCs。
11.如权利要求6所述的医药组合物，其中该癌症为肺癌。
12.如权利要求11所述的的医药组合物，其中该肺癌为非小细胞肺癌。
13.一种用于预防或延迟癌症复发的医药组合物，其包含有效量的具有式I结构的化合物及一抗癌药物，
其中A为N(CH3)2，N-甲基或N-乙基呱嗪基群(piperazinyl group)，N-(羟乙基)呱嗪基群，或N-甲基哌啶基群(piperidinyl group)，而B为SCH3，Cl，CF3，或H。
14.如权利要求13所述的医药组合物，其中该化合物为三氟拉嗪。
15.如权利要求13所述的医药组合物，其中该化合物及抗癌药物为二种不同配方的形式或同一配方的形式。
16.如权利要求13所述的医药组合物，其中该抗癌药物为吉非替尼或顺铂。
17.如权利要求13所述的医药组合物，其对于CSCs有效。
18.如权利要求13所述的医药组合物，其中该癌症为肺癌。
19.如权利要求18所述的医药组合物，其中该肺癌为非小细胞肺癌。
20.如权利要求13所述的医药组合物，其中该医药组合物用以投予经初步癌症治疗后有需要的个体。
21.如权利要求20所述的医药组合物，其中该初步癌症治疗为手术、放射治疗、化学治疗或其组合。
22.一种具有式I结构的化合物在制造用于预防癌症的药物中的用途，
其中A为N(CH3)2，N-甲基或N-乙基呱嗪基群(piperazinyl group)，N-(羟乙基)呱嗪基群，或N-甲基哌啶基群(piperidinyl group)，而B为SCH3，Cl，CF3，或H。
23.如权利要求22所述的用途，其中该化合物为三氟拉嗪，氯丙嗪，硫利达嗪，羟呱氯丙嗪，三氟丙嗪，丙嗪或一种其组合。
24.如权利要求23所述的用途，其中该化合物为三氟拉嗪。
25.如权利要求22所述的用途，其中该癌症为肺癌。
26.如权利要求25所述的用途，其中该肺癌为非小细胞肺癌。
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