CN104099409B

CN104099409B - 长fish探针的合成

Info

Publication number: CN104099409B
Application number: CN201410045228.2A
Authority: CN
Inventors: S.陈; M.鲁沃洛; E.M.莱普鲁斯特
Original assignee: Agilent Technologies Inc
Current assignee: Agilent Technologies Inc
Priority date: 2013-03-05
Filing date: 2014-02-07
Publication date: 2020-07-17
Anticipated expiration: 2034-02-07
Also published as: CN104099409A

Abstract

本发明涉及长FISH探针的合成，具体地提供了一种方法，其包括：合成包含与染色体中的独特序列杂交的探针序列的一组重叠的寡核苷酸；以一定方式组装所述重叠的寡核苷酸从而产生一个或多个双链多核苷酸，每个双链多核苷酸均包含多个探针序列；标记该一个或多个双链多核苷酸而产生一个或多个标记探针；和将所述标记探针与完整染色体原位杂交。

Description

长FISH探针的合成

背景技术

染色体重排、缺失和其它畸变久已被与遗传疾病关联。染色体结构异常经常起因于同源重组中的错误。非整数倍性(Aneuploidy)，也称作数目异常(numericalabnormality)，其中细胞中的染色体含量异常，可能由于减数分裂期间染色体不分离而发生。在Edwards、Patau和唐氏综合征中会见到三倍体，其中存在染色体的三个拷贝，而不是通常的两个。结构异常和非整数倍性可能在配子(gamete)中出现，因此可能存在于受影响的人体的所有细胞中，或者它们也可以在减数分裂期间出现，导致同时具有一些正常细胞和一些异常细胞的遗传嵌合(mosaic)个体的产生。

基因组不稳定性还会在某些细胞中，例如癌细胞中，造成复杂的染色体重排模式。常规细胞遗传学测定法，例如吉姆萨(G)条带分析，已经在癌细胞中鉴定了大量的癌症特异性易位和染色体异常，例如费城(t9,22)染色体。唐氏综合征(三体)、Jacobsen综合征(缺失)和伯基特氏淋巴瘤(易位)在传统上是通过核型分析(karyotype analysis)进行研究的。

细胞遗传条带分析(cytogenetic banding)和可视化(visualization)，例如M条带和光谱核型分析(spectral karyotyping)(SKY)的进步已经使得人们能够对颠换和易位进行细致的分析，并能够鉴定感兴趣的癌症中染色体材料的失衡增加或缺失。荧光原位杂交(FISH)进一步使得人们能够使用仅与染色体中显示高度互补性的区域结合的荧光探针来检测染色体上特定DNA序列的存在或缺失。

在开发用于检测染色体异常的技术方法方面，还存在很大的、未能满足的需求。

发明内容

提供了一种方法，其包括：a)合成一组重叠的寡核苷酸，该组重叠的寡核苷酸包含与染色体中的独特序列杂交的探针序列；b)以一定方式组装这些重叠的寡核苷酸从而产生一个或多个双链多核苷酸，其中每一个均包含多个探针序列；c)标记该一个或多个双链多核苷酸而产生一个或多个标记探针；和d)将所述标记探针与完整染色体原位杂交。所述一个或多个双链多核苷酸可以通过多种不同的方式，例如通过连接或通过聚合酶链式组装(polymerase chain assembly)，从所述重叠的寡核苷酸制备。

附图简述

图1是示意性图解本文所述探针合成方法的某些一般特征的图。

图2是示意性图解本方法的一个实施方案的图。

图3是示意性图解本方法的另一个实施方案的图。

图4是示意性图解本方法的另一个实施方案的图。

定义

如本文中所使用的，术语“样品”是指含有一种或多种感兴趣的被分析物的材料或材料混合物，其通常是，但不一定是液体形式。

如本文中所使用的，术语“基因组样品”是指含有来自生物体的遗传材料的材料或材料混合物。如本文中所使用的，术语“基因组DNA”是指从生物体获得的脱氧核糖核酸。术语“基因组样品”和“基因组DNA”涵盖可能已经过扩增、纯化或断裂的遗传材料。如本文中所使用的，术语“测试基因组”是指在某个研究中感兴趣的基因组DNA。

术语“核苷酸”意图包括这样的部分(moieties)：它们不仅含有已知的嘌呤和嘧啶碱基，还包含其它已经被修饰的杂环碱基。这样的修饰包括甲基化嘌呤或嘧啶、酰基化嘌呤或嘧啶、烷基化核糖或其它杂环。此外，术语“核苷酸”包括这样的部分，其含有半抗原或荧光标记，并且可能不仅包含常规的核糖和脱氧核糖，还包含其它的糖。修饰的核苷或核苷酸还包括对糖部分的修饰，例如其中一个或多个羟基被卤素原子或脂肪族基团代替，或者被官能化为醚、胺或其它。

术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可以互换使用，描述由核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)构成的任意长度(例如大于约2个碱基，大于约10个碱基，大于约100个碱基，大于约500个碱基，大于1000个碱基，直至约10,000个或更多个碱基)的聚合物，其可以通过酶促或合成产生(例如美国专利No.5,948,902及其引用的参考文献中所述的PNA)，其能够与天然存在的核酸以类似两个天然存在的核酸的序列特异性方式杂交，例如能够参与Watson-Crick碱基配对相互作用。天然存在的核苷酸包括鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶(分别为G、C、A、T和U)。DNA和RNA分别具有脱氧核糖和核糖骨架，而PNA的骨架由通过肽键连接的重复N-(2-氨基乙基)甘氨酸单元构成。在PNA中，各种嘌呤和嘧啶碱基通过亚甲基羰基键(methylene carbonyl bonds)与骨架相连。锁定核酸(lockednucleic acid)(LNA)通常被称作无法触及的RNA，是一种修饰的RNA核苷酸。LNA核苷酸的核糖部分被修饰而具有一个连接2'氧和4'碳的额外的桥。该桥将核糖“锁闭”为3'-内向(北型)(North)构象，这种构象常常在A型双链体中发现。在任何期望的情况下，在寡核苷酸中LNA核苷酸可以与DNA或RNA残基混合。术语“非结构核酸(unstructured nucleic acid)”或“UNA”是含有以降低的稳定性彼此结合的非天然核苷酸的核酸。例如，非结构核酸可以含有G’残基和C’残基，其中这些残基对应于G和C的非天然存在形式，即类似物，它们彼此以降低的稳定性碱基配对，但是仍然保持分别与天然存在的C和G残基进行碱基配对的能力。非结构核酸在US20050233340中有描述，本文为了公开UNA而通过援引将其并入。

如本文中所使用的，术语“寡核苷酸”是指核苷酸的单链多聚体，长度为约2-200个核苷酸，多达500个核苷酸。寡核苷酸可以是合成的，或者可以酶促制备，并且在一些实施方案中，长度为30-150个核苷酸。寡核苷酸可以含有核糖核苷酸单体(即可以是寡核糖核苷酸)或脱氧核糖核苷酸单体。寡核苷酸的长度可以是例如10-20、11-30、31-40、41-50、51-60、61-70、71-80、80-100、100-150或150-200个核苷酸。

如本文中所使用的，术语“序列特异性寡核苷酸”是指仅与单倍体基因组中的单一位点结合的寡核苷酸。在某些实施方案中，“序列特异性”寡核苷酸可以和所研究样品中独特的互补核苷酸序列杂交。

如本文中所使用的，术语“互补”是指通过非共价键与感兴趣的靶核酸碱基配对的核苷酸序列。在经典的Watson-Crick碱基配对中，DNA中的腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)形成碱基对，鸟苷酸(G)与胞嘧啶(C)形成碱基对。在RNA中，胸腺嘧啶被尿嘧啶(U)代替。这样，A与T互补，而G与C互补。在RNA中，A与U互补，反之亦然。典型地，“互补”是指与感兴趣的靶标完全互补的核苷酸序列，从而序列中的每一个核苷酸均与靶核酸相应位置处的每一个核苷酸互补。在某些情况下，核苷酸序列可以与靶部分互补，其中不是所有核苷酸均与靶核酸所有相应位置处的每一个核苷酸互补。

如本文中所使用的，术语“引物”是指这样的寡核苷酸，其或者是天然存在的，例如在纯化的限制性消化物中，或者是合成产生的，当将该寡核苷酸置于与某条核酸链互补的引物延伸产物的合成被诱发的条件下，即有核苷酸和诱发剂(如DNA聚合酶)存在、且温度和pH适宜时，该寡核苷酸能够充当合成的启动点。引物可以是单链的或者双链的，并且必须足够长，以便在存在诱发剂时可以引发期望的延伸产物的合成。引物的确切长度将取决于许多因素，包括温度、引物来源、和方法的用途。例如，对于诊断应用，取决于靶序列的复杂性，寡核苷酸引物通常含有15-25或更多个核苷酸，尽管它也可含有更少的核苷酸。本文中的引物经过选择以与特定靶DNA序列的不同链基本上互补。这意味着，引物必须有足够的互补性以与其相应链杂交。因此，引物序列不必反映模板的确切序列。例如，在引物的5’端可以附接非互补的核苷酸片段，而引物序列的其余部分与所述链互补。或者，可以将非互补的碱基或更长序列散布在引物中，只要引物序列与链的序列足够互补从而可以与之杂交，藉此形成用于合成延伸产物的模板即可。

如本文中所使用的，术语“探针”是指这样的核酸，其与感兴趣的核苷酸序列部分或完全互补，从而能够在严格的杂交条件下与之稳定杂交。在某些情况下，靶分析物的检测需要探针与靶杂交。探针可以具有，但非必须具有与靶序列不互补的区域，只要这样的序列在严格杂交条件下不会实质性地改变探针期望的特异性即可。如果存在这些非互补区，它们可能含有5’启动子序列和/或RNA转录的结合位点，限制性内切酶识别位点，或可以含有可赋予探针、靶核酸、或者探针和靶核酸二者以期望的二级或三级结构(例如催化活性位点或发夹结构)的序列。探针可以用能够用来检测或确认探针已与靶序列杂交的报告基团部分，例如放射性同位素、荧光基团或化学发光部分，用酶或其它配体进行标记。在某些实施方案中，探针可以固定在基质的表面上，其中基质可以具有各种构型，例如片层、珠子或其它结构。在某些实施方案中，探针可以存在于平面支持物的表面上，例如以阵列的形式。

如本文中所使用的，术语“扩增”是指，合成与模板核酸的一条或两条链互补的核酸分子的过程。扩增核酸分子通常包括使模板核酸变性、使引物在低于引物熔点的温度下与模板核酸退火、和酶促地从引物延长以产生扩增产物。变性、退火和延长步骤可以分别进行一次。然而，一般而言，变性、退火和延长步骤进行多次(例如至少5-10次，多达30-40次，或更多次)，从而使扩增产物的量增加，经常指数倍增，尽管指数扩增并不是本方法要求的。扩增通常要求存在脱氧核糖核苷三磷酸、DNA聚合酶和对该聚合酶的最佳活性而言合适的缓冲液和/或辅助因子。术语“扩增产物”是指由此处所定义的扩增程序产生的核酸序列。

本文中，术语“确定”、“测量”、“评估”、“评价”、“分析”和“测定”可以互换使用，指任意形式的测量，并且包括确定某要素是否存在。这些术语包括定量和/或定性确定。评估可以是相对的或绝对的。“评估…的存在”包括确定某物的存在量，以及确定其是否存在。

如本文中所使用的，术语“Tm”是指寡核苷酸双链体的熔解温度，在该温度一半的双链体仍保持杂交，而一半的双链体解离为单链。寡核苷酸双链体的T_m可以通过实验确定或者用如下的公式预测：T_m=81.5+16.6(log₁₀[Na⁺])+0.41(G+C分数)–(60/N)，其中N是链长度，[Na⁺]小于1M。见Sambrook and Russell(2001;Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第三版,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor N.Y.,第10章)。还存在其它用于预测寡核苷酸双链体Tm的公式，且一个公式可能或多或少地适用于一个给定的条件或一组条件。

术语“使用（using）”具有其常规含意，并且同样意指“利用（employing）”，例如，利用方法或组合物以达成目的。例如，如果使用程序创造一个文件，则该是执行该程序以制作文件，所述文件通常是所述程序的输出物。在另一个例子中，如果使用计算机文件，则通常是访问、读取所述文件，且使用存储于该文件中的信息以达成目的。简单地说，如果使用一种独特的标识，例如条形码，则通常是读取该独特的标识以识别，例如，与该独特的标识相关联的物体或文件。

如本文中所使用的，术语“染色体重排”是指染色体的一个或多个部分在单个染色体内或者在染色体之间重新排列的事件。在某些情况下，染色体重排可以反映染色体结构的异常。染色体重排可以是例如颠换(inversion)、缺失、插入、或易位。

术语“接触”意思是使之在一起。因此，当将第一个物品与第二个物品放在一起，例如使它们彼此碰到或将它们置于同一溶液中，则称第一个物品与第二个物品接触。因此“被接触样品”是寡核苷酸探针所杂交的测试染色体。

术语“杂交”是指核酸与互补核酸通过Watson-Crick碱基配对的特异结合。因此，术语“原位杂交”是指核酸与中期(metaphase)或间期(interphase)染色体的特异结合。

术语“杂交”和“结合”在用于指示核酸时可以互换使用。

术语“多个”、“一组”、“多”、和“群体”可以互换使用，意思是至少2个、至少10个、至少100个、至少500个、至少1000个、至少10,000个、至少100,000个，至少1000,000个、至少10,000,000个或者更多。

如本文中所使用的，术语“染色体区”是指生物体基因组中连续的一段核苷酸。染色体区的长度范围可以是10kb到整个染色体，例如100kb-10MB。

“测试染色体”是从哺乳动物细胞分离的完整中期或间期染色体，其中完整染色体具有与哺乳动物细胞中存在的相同染色体相同的整体形态，例如含有着丝粒、含有端粒的长臂和含有端粒的短臂。测试染色体与参考染色体相比可以含有颠换、易位、缺失、插入或其它重排。测试染色体是所研究的染色体。

“参考染色体”是完整的中期染色体，可以将测试染色体与其进行比较以鉴定重排。参考染色体可以任意选择。参考染色体可以具有已知的序列。参考染色体可以自身含有染色体重排。

如本文中所使用的，术语“参考染色体区”是指将测试染色体区与之比较的染色体区。在某些情况下，参考染色体区可以具有已知的核苷酸序列，例如其序列已录入NCBI的Genebank数据库和其它数据库中的染色体区。

如本文中所使用的，术语“原位杂交条件”是指允许核酸与完整染色体中的互补核酸杂交的条件。合适的原位杂交条件可以包括杂交条件和任选的清洗条件，清洗条件包括温度、变性剂浓度、盐、温育时间等。这些条件是本领域已知的。

术语“不同的非连续区域”是指染色体上不连续的区域或间隔。

术语“结合模式”是指一组标记探针与某个完整染色体结合的模式。

如本文中所使用的，术语“聚合酶链式组装”是指这样的方案，其中将多个重叠的寡核苷酸组合，并使之经历多轮引物延伸(即在聚合酶和核苷酸存在下进行多轮连续的引物延伸、变性和退火)使用彼此作为模板经历，从而延长寡核苷酸，借此产生含有每个起始寡核苷酸核苷酸序列的产物分子。然后，在标记之前，使用与产物分子末端位点结合的引物对产物分子进行扩增。

如本文中所使用的，术语“(使)变性”是指通过将核酸双链体置于合适的变性条件下使核酸双链体的至少一部分碱基对分离。变性条件是本领域众所周知的。在一个实施方案中，为了使核酸双链体变性，可以将双链体暴露于超过双链体的Tm的温度，由此使双链体的一条链从另一个链上释放。在某些实施方案中，可以通过将核酸暴露于至少90℃达合适的时间量(例如至少30秒，多达30min)使之变性。在某些实施方案中，可以使用完全变性条件来完全分离双链体的碱基对。在其它实施方案中，可以使用部分变性条件(例如用低于完全变性条件的温度)分离双链体某些部分的碱基对(例如富含A-T碱基对的区域可以分离，而富含G-C碱基对的区域可以保持配对)。核酸还可以被化学变性(例如使用尿素或NaOH)。

如本文中所使用的，术语“延伸”是指通过使用聚合酶添加核苷酸使引物延伸。如果与核酸退火的引物被延伸，则该核酸充当延长反应的模板。

术语“重叠的寡核苷酸”是指一组寡核苷酸，其中每一个寡核苷酸的某个末端(例如3’端)与该组中另一个寡核苷酸的某个末端互补，使得重叠的寡核苷酸的各末端可以彼此杂交，并可以通过使用其它寡核苷酸作为模板被聚合酶所延伸。

术语“彼此连结”是指彼此结合形成一个单元。多核苷酸序列可以彼此连结产生一个单一的序列。

术语“重复序列”是指基因组中非独特的序列，例如卫星DNA、LINES、SINES，或者本来在单倍体基因组的至少两个区域内出现的序列，例如在同源基因或已被复制的基因中出现的序列。

示例实施方案详细说明

在更详细描述本发明之前，应当理解，本发明并不仅限于所述的特定实施方案，因此它们当然可以发生变化。还应当理解，这里所用的术语只是出于描述特定实施方案的目的，并不意图有限制，因为本发明的范围仅由随附的权利要求所限定。

当提供某个值的范围时，应该理解为还具体公开了上限和下限之间的每一个居间值，到下限的单位的十分之一，除非上下文中另有明确说明。在指明的范围中，任意指明的值或居间值与该范围中的其它指明的或居间值之间的每一个更小范围都包括在本发明之中。

除非另外指出，否则这里所用全部技术和科学术语均具有与本发明所属领域普通技术人员所公知的相同的意思。尽管在实践或测试本发明时也可以使用与本文中所述的相似或等同的方法或材料，但是现在描述的是优选的方法和材料。

本文通过援引并入本说明书中所引证的全部出版物和专利的内容，就像具体地逐个声明通过援引并入每一个单独的出版物或专利一样；通过援引并入这些出版物和专利是为了公开和描述与对这些出版物的引证相关联的方法和/或材料。对任何出版物的引证是出于引证其中早于申请日的公开内容的目的，而不应当被解释为了承认本发明无权基于发明在先而使这些出版物不构成本发明的现有技术。而且，所提供的出版日期可能与实际的出版日期不同，其可能需要单独加以确认。

应当注意，如本文中所使用的，以及在随附的权利要求中，除非上下文明确地另有要求，否则单数形式“一”、“一个”、和“该”包括复数形式。此外应当注意，权利要求可以使用排除任何任选元素的表述。因此，本陈述应视为将排他性术语如“唯一”、“仅”等与某一权利要求元素联用、或使用“负”限定的在先基础。

如本领域技术人员阅读本公开文件时容易想到的，本文中所描述和例示的每个单独的实施方案都具有离散的组成成分和技术特征，其可以随时从任意其它几个实施方案的特征分离或与其它几个实施方案的特征结合而不背离本发明的教导的范围或精神。任何提到的方法都可以以提到的顺序进行，或以任意逻辑上可能的顺序进行。

本方法的某些方面如图1所示。在某些实施方案中，该方法包括合成一组重叠的寡核苷酸2，其包含探针序列，所述探针序列中每一个与基因组4中的一个独特序列(即仅与一个位置)杂交。在这些实施方案中，重叠寡核苷酸的长度范围可以是50-200个核苷酸(或者更长)。重叠寡核苷酸中每一个的一个末端(例如3’端)与重叠寡核苷酸中另一个的一个末端互补，从而重叠寡核苷酸的末端可以彼此杂交，并且如果需要，可以用另一个重叠寡核苷酸(another of the overlapping oligonucleotides)作为模板加以延伸。相邻的寡核苷酸之间可以有10%-90%重叠。在某些情况下，重叠的区域(即相邻寡核苷酸之间的互补区域)可以是12-50个碱基，例如15-30个碱基的范围。探针序列的长度范围可以是10-200个，例如20-150个核苷酸。取决于寡核苷酸是如何制备的(例如取决于它们是刚刚合成的未处理的寡核苷酸，还是已经通过PCR进行了扩增的寡核苷酸)，寡核苷酸可以是单链寡核苷酸或双链寡核苷酸。在制备重叠寡核苷酸之后，以一定的方式组装重叠寡核苷酸，以产生一个或多个双链多寡核苷酸6，所述双链多寡核苷酸各自包含多个(例如至少2个、至少5个、至少10个、至少50个、或者至少100个或更多、多达1,000个或更多)探针序列。如将在下文中更详细描述的，如果寡核苷酸是单链的，则可以通过聚合酶链式组装制备所述一个或多个双链多核苷酸。在一个其中寡核苷酸为双链的实施方案中，所述一个或多个双链多核苷酸可以通过将双链寡核苷酸连接在一起来制备。在组装好所述一个或多个双链多核苷酸之后，将它们标记产生一个或多个标记探针8。标记可以用任何方便的方式完成。例如，在某些情况下，可以通过将一个或多个标记化学缀合于一个或多个双链多核苷酸来标记探针，例如使用通用连接系统(Universal Linkage System)(ULS^TM,KREATECH Diagnostics;van Gijlswijket al Universal Linkage System:versatile nucleic acid labeling techniqueExpert Rev.Mol.Diagn.20011:81-91)。简而言之，ULSTM标记是基于铂(II)与核酸的稳定结合性质。ULS分子由与所选的可检测分子偶联的单功能铂复合体组成。或者，标记可以用缺口平移、随机引发(random priming)、或任何其它在Ausubel等,(Short Protocols inMolecular Biology,第三版,Wiley&Sons,1995)或Sambrook等,(Molecular Cloning:ALaboratory Manual,第三版,(2001)Cold Spring Harbor,N.Y.)中描述的合适方法实现。在某些情况下，所述一个或多个双链多核苷酸的多个位点被标记，且不被通过末端标记方式标记。图1所示的示例实施方案中图解了一种已通过化学缀合而被标记的探针。可以显见，本方法的使用其它标记方法(例如缺口平移或随机引发)的实施方案会产生与图1所示不同的产物。在该一个或多个双链多核苷酸被标记之后，所得的探针与完整染色体，例如从哺乳动物细胞分离的完整中期或间期染色体原位杂交。所得的探针与完整染色体的结合应当会产生结合模式10，可以对其进行分析，从而可能鉴定出染色体重排。

如上文所指出的，在某些实施方案中，所述一个或多个双链多核苷酸可以通过聚合酶链式组装由重叠的单链寡核苷酸组装而成，其中如上文指出的，聚合酶链式组装涉及使多个重叠的单链寡核苷酸使用彼此作为模板经历多轮引物延伸(即在聚合酶和核苷酸的存在下进行多个连续的引物延伸、变性和复性的循环)，由此产生产物分子，然后用与最终的产物分子的末端位点结合的引物对该最终的产物分子进行扩增。实施聚合酶链式组装方法的示例条件可以在例如Hughes等(Methods in Enzymology2011498:277-309)和Wu等.(J.Biotechnol.(2006),124:496-503)中找到，它们均援引并入本文。如果使用聚合酶链式组装，那么产物双链多核苷酸的长度范围可以是100bp-5kb，例如200bp-3kb。在这些实施方案中，通过聚合酶链式组装产生的一个或多个双链多核苷酸的连续核苷酸序列与靶染色体中的序列可以有至少95%相同(例如至少98%或至少99%相同)。本方法中所用的寡核苷酸的重叠末端可以是T_m匹配的。

如上文所指出的，所述一个或多个双链多核苷酸可以由重叠双链寡核苷酸通过将双链寡核苷酸的末端连接在一起组装而成。在这些实施方案中，所述双链寡核苷酸可以通过对寡核苷酸进行PCR扩增加以制备，例如按照美国专利8,034,917所述。在这些情况下，所述双链寡核苷酸可以从寡核苷酸的混合物进行PCR扩增，所述混合物中不同的寡核苷酸根据下式：X₁-V-X₂(从5'至3')，其中X₁和X₂为一对PCR引物提供结合位点(例如，X₁具有与第一PCR引物相同的序列，而X₂具有与第二PCR引物互补的序列)，且V是一个可变区域，其具有与基因组中的独特序列互补的可变的核苷酸序列。可变区一般对应于基因组的非重复区，可以用一对PCR引物进行扩增。在某些情况下，对于所有待组装的寡核苷酸而言X₁和X₂的核苷酸序列是相同的，从而单一一组寡核苷酸的所有可变区可以用单一一对PCR引物来扩增。在这些实施方案中，PCR产物X₁和X₂区可以含有IIS型限制酶的位点，从而X₁和X₂的序列可以从PCR产物中移除，以产生一组在该方法的本实施方案中使用的重叠双链寡核苷酸。这些双链寡核苷酸一旦产生，可以将它们全部连接在一起，并如上所述地进行标记。在这些实施方案中，一个或多个双链多核苷酸的长度范围是300-5,000个碱基对，尽管在某些实施方案中，长度可为超过5,000个碱基对长。由于该连接基本上是随机的，因此所述一个或多个双链多核苷酸的整个连续核苷酸序列与靶染色体中的序列可以具有小于10%的序列同一性。然而，在通过本方法制备的一个或多个双链多核苷酸中，应当有数个较短的序列(例如50-150个核苷酸)与靶序列有至少95%(例如至少98%或至少99%)的序列同一性，并能够和靶序列杂交。在这些实施方案中，所述一个或多个双链多核苷酸中的探针序列的顺序是随机的。图2图解了可以实施该基于连接酶的实施方案的一种方式。

在一些实施方案中，寡核苷酸与染色体中多个不同区域杂交，其中所述不同区域被重复序列(repeat sequences)(例如在基因组中不独特的序列(sequences)，例如卫星DNA、LINES、SINES或原本在单倍体基因组的至少两个部分中出现的序列，例如在同源基因或已经过复制的基因中出现的序列)所分隔。在这些实施方案中，可以分析基因组序列以鉴定被重复序列(repeat sequences)所分隔的靶区域。在某些情况下，可以为每个靶区域设计一组重叠的探针序列。例如，如果有两个、三个或四个靶区域，则可以产生相等数目的双链多核苷酸，其中每个双链多核苷酸对应于单个靶区域。这些实施方案可以包括：为每个靶区域设计一组重叠探针序列；合成多组包含所述重叠探针序列的寡核苷酸；和以一定方式组装这些重叠探针序列，使得为每个靶区域产生一个双链多核苷酸。该实施方案在图3中图示(其中图3演示了本方法的该实施方案可以用聚合酶链式组装完成的一种方式)。在其它情况下，在鉴定出被重复序列分隔的靶区域之后，可以将各核苷酸序列彼此连结(即，彼此相连形成含有每一个靶序列的单一序列，这些靶序列的顺序可以和基因组中发现的顺序相同或不同)。在这些实施方案中，连结起来的核苷酸序列可以被分成(split into)多个具有限定长度(例如长度范围是500bp-5kb)的区域，并且可以为该多个区域的每一个设计一组探针序列。与上文一致，该方法可以涉及合成多组包含探针序列的重叠寡核苷酸；和以一定方式组装这些探针序列，使得为所述多个区域中的每一个产生一个可以被标记的双链多核苷酸，如上所述。图4图解了该方法的这个实施方案可以通过聚合酶链式组装实现的一种方式。

可以显见，对应于基因组不同区域中的不同双链多核苷酸可以用相同的标记物(例如相同的荧光团)标记，在某些情况下，可以在标记之前将不同的双链多核苷酸组合。在某些情况下，不同的双链多核苷酸可以用不同的标记物(例如不同的荧光团)标记。

在某些实施方案中，对象中使用的寡核苷酸可以在阵列上提供。在某些实施方案中，阵列可以用原位合成方法合成，其中核苷酸单体被顺次添加到生长中的核苷酸链，其中所述核苷酸链附接于呈阵列形式的固体支持物。这些原位制造方法包括在下列文献中描述的那些：美国专利Nos.5,449,754和6,180,351，以及公开的PCT申请No.WO98/41531，和其中引证的参考文献，以及多种其他出版物。在一个实施方案中，方法中所用的寡核苷酸可以如此制备：使用原位合成方法制造寡核苷酸阵列，并从阵列中切出寡核苷酸。

适合用作本方法中的标记物的荧光染料(荧光团)可以从许多适合于成像应用的染料中任意选择。有若干种染料可以从各种来源商购，例如Molecular Probes(Eugene,Oreg.)和Exciton(Dayton,Ohio)，这为选择一组具有期望的光谱性质的染料提供了极大的灵活性。荧光团的实例包括，但不仅限于，4-乙酰胺基-4'-异硫氰酸芪-2,2'-二磺酸；吖啶和其衍生物，如吖啶，吖啶橙，吖啶黄，吖啶红，和吖啶异硫氰酸酯；5-(2’-氨乙基)氨基萘-1-磺酸（EDANS）；4-氨基-N-[3-乙烯砜基/苯基]萘酰亚胺-3,5二磺酸酯(amino-N-[3-vinylsulfonyl)phenyl]naphthalimide-3,5disulfonate)(荧光黄VS)；N-(4-氨基-1-萘酰)马来酰亚胺(N-(4-amino-1-naphthyl)maleimide)；邻氨基苯甲酰胺；亮黄(BrilliantYellow)；香豆素及衍生物，如香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC，香豆素120)，7-氨基-4-三氟甲基香豆素(Coumaran151)；花青及衍生物，如焰红染料(cyanosine)，Cy3，Cy5，Cy5.5，和Cy7；4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)；5’,5”-二溴邻苯三酚-磺酞（溴邻苯三酚红）；7-二乙氨基-3-(4’-异硫氰酸苯基)-4-甲基香豆素；二乙氨基香豆素；二亚乙基三胺五乙酸；4,4’-二异硫氰酸二氢-芪-2,2’-二磺酸；4,4’-二异硫氰酸芪-2,2’-二磺酸；5-[二甲氨基]萘-1-磺酰氯（DNS，丹酰氯）；4-(4’-二甲氨基苯偶氮基)苯甲酸(DABCYL)；4-二甲氨基苯偶氮基苯基-4’-异硫氰酸酯(DABITC)；曙红及衍生物，如曙红和曙红异硫氰酸酯；藻红及衍生物，如藻红B和藻红异硫氰酸酯；乙啡啶；荧光素及衍生物，如5-羧基荧光素(FAM)、5-(4,6-二氯三嗪-2-基)氨基荧光素(DTAF)、2’7’-二甲氧基-4’5’-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、荧光素异硫氰酸酯(FITC)、荧光素氯三嗪、萘基荧光素、和QFITC(XRITC)；荧光胺；IR144；IR1446；丽丝胺(Lissamine)^TM；丽丝胺罗丹明、荧光黄(Lucifer yellow)；异硫氰基孔雀石绿(Malachite Green isothiocyanate)；4-甲基伞形酮；邻甲酚酞；硝基酪氨酸；碱性副品红；尼罗红；俄勒冈绿；酚红；B-藻红蛋白；邻苯二醛；芘及其衍生物，如芘、芘丁酸酯和琥珀酰亚氨基-1-芘丁酸酯；活性红4(Cibacron^TM亮红3B-A)；罗丹明及衍生物，如6-羧基-X-罗丹明(ROX)、6-羧基罗丹明(R6G)、4,7-二氯罗丹明丽丝胺、罗丹明B磺酰氯、罗丹明(Rhod)、罗丹明B、罗丹明123、罗丹明X异硫氰酸酯、磺基罗丹明B、磺基罗丹明101、磺基罗丹明101磺酰氯衍生物(德克萨斯红)、N,N,N’,N’-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、四甲基罗丹明、和四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)；核黄素；玫瑰酸和铽螯合物衍生物；氧杂蒽；Alexa-Fluor染料(例如Alexa Fluor350、Alexa Fluor430、Alexa Fluor488、Alexa Fluor546、AlexaFluor555、Alexa Fluor568、Alexa Fluor594、Alexa Fluor633、Alexa Fluor647、AlexaFluor660、Alexa Fluor680、Alexa Fluor700、Alexa Fluor750)、Pacific Blue、PacificOrange、Cascade Blue、Cascade Yellow；Quantum Dot染料(Quantum Dot Corporation)；来自Pierce的Dylight染料(Rockford,IL)，包括Dylight800、Dylight680、Dylight649、Dylight633、Dylight549、Dylight488、Dylight405；或其组合。也可以使用其它本领域技术人员已知的荧光团或其组合，例如可以从Molecular Probes(Eugene,Oreg.)和Exciton(Dayton,Ohio)获得的那些。

下面的表1提供了可以和2、3或4组合使用的荧光团的示例性组合。该表格不是全面性的。在表1中，指示了20种不同的二染料组合、9种不同的三染料组合、和8种不同的四染料组合(纵向阅读；填充了黑色的框指示组合中的染料)。

表1染料组合实例(AF=Alexa Fluor)

样品分析方法

通过上述方法制备的探针可和含有完整染色体的样品杂交，并对探针的结合进行分析。例如，可制作间期或中期染色体制备物。使染色体附着于基质例如玻璃，与探针接触，并在杂交条件下进行温育。清洗步骤除去所有未杂交或部分杂交的探针，用能够激发染料并记录图像的显微镜对结果进行可视化和定量。这些方法是本领域公知的，并可以容易地在这里应用。例如，下列文献讨论了染色体杂交：Ried等,Human Mo5lecular Genetics,Vol7,1619-1626;Speicher等,Nature Genetics,12,368-376,1996;

等,Science,494-497,1996;Griffin等,Cytogenet Genome Res.2007;118(2-4):148-56;Peschka等,Prenat Diagn.,1999,Dec;19(12):1143-9;Hilgenfeld等,Curr Top MicrobiolImmunol.,1999,246:169-74。

在原位杂交之前，可以使探针变性。变性通常是通过在存在高pH、热(例如温度约70℃-约90℃)、有机溶剂例如甲酰胺和卤化四烷基铵，或其组合的条件下进行温育而实施的。

使完整的染色体在原位杂交条件下与标记探针接触。“原位杂交条件”是帮助核酸与完整染色体中的互补核酸退火的条件。杂交条件依赖于探针的浓度、碱基组成、复杂性和长度、以及温育的盐浓度、温度和长度而改变。例如，原位杂交可以在含有1X-2X SSC、50%甲酰胺的杂交缓冲液中、且封闭DNA以抑制非特异性杂交的条件下进行。一般地，杂交条件包括温度为约25℃至约55℃，温育时间为约0.5小时至约96小时。对于一组寡核苷酸和染色体靶而言的合适杂交条件可以由本领域技术人员通过常规实验加以确定。

杂交了的染色体的荧光可以用荧光显微镜进行评估。一般地，来自激发源的具有第一波长的激发辐射通过激发光学装置(optics)。激发光学装置导致所述激发辐射激发样品。作为响应，样品中的荧光分子发射出波长与激发波长不同的辐射。随后收集光学装置收集来自样品的发射。计算机还能够将测定期间收集的数据转换为另一种格式用于呈现。一般地，可以使用已知的机器人系统和组件。

在某些实施方案中，可以将来自标记探针对染色体的结合的信号与参考染色体的信号进行比较。参考染色体可以来自健康的或野生型生物体。简而言之，该方法包括在原位杂交条件下使来自细胞样品的测试染色体与通过本主题方法产生的多个荧光标记的FISH探针接触，并在原位杂交条件下使参考染色体与相同的多个荧光标记的FISH探针接触。杂交之后，将从来自测试染色体的独特结合模式生成的发射光谱与参考染色体的进行比较。

因此，通过比较标记的FISH探针对测试染色体的结合模式与相同的标记FISH探针与参考染色体的结合模式，可以确定测试染色体的结构。参考染色体的结合模式可以在确定测试染色体的结合模式之前、之后或同时加以确定。该确定可以通过人工或自动系统执行。与测试染色体相关的结合模式可以和具有已知缺失、插入、易位、脆弱位点(fragilesites)和其它更复杂的重排和/或精细断点(breakpoint)的预期结合模式进行比较。匹配可以使用本领域已知的基于计算机的分析软件执行。一致性的确定可以人工进行(例如通过检视数据和手动比较识别标志)、自动进行(例如通过采用特别配置用来匹配光学可检测识别标志的数据分析软件)，或组合进行。

在另一个实施方案中，测试样品来自怀疑患有癌症的生物体，而参考样品可以包含代表野生型基因组的阴性对照(非癌症)样品和代表与已知的染色体重排相关的癌症的第二测试样品(或阳性对照)。在该实施方案中，使用本主题方法对所有这些样品彼此间进行比较，可能不仅显示测试样品是否产生与野生型基因组不同的结果，还显示测试样品是否可能与另一个癌症测试样品具有相同或相似的基因组重排。

试剂盒

本发明还提供了用于实施如上所述的主题方法的试剂盒。在某些情况下，本试剂盒包含多组如上文讨论的重叠寡核苷酸探针。该试剂盒还可包含用于聚合酶链式组装的试剂、用于寡核苷酸PCR的试剂、连接酶、用于荧光标记双链多核苷酸的试剂、用于原位杂交的试剂、和/或要在主题方法中使用的参考样品。试剂盒的各种组分可以位于不同的容器内。

除了上述组分之外，本试剂盒可以进一步包括使用试剂盒的组分实施本方法的说明书。用于实施主题方法的说明书一般被记录在合适的记录媒介上。例如，说明书可以打印在基质，例如纸或塑料等上面。这样，说明书可以作为包装插页存在于试剂盒中、存在于试剂盒或其组分的容器的标签上(即与包装或分包装在一起)，等等。在其它实施方案中，说明书作为电子存储数据文件存储于合适的计算机可读存储介质上，例如CD-ROM、磁盘等。在另外的实施方案中，试剂盒中并不实际存在说明书，但提供了从远程来源例如通过互联网获取说明书的手段。该实施方案的一个实例是试剂盒包含一个万维网地址，在那里可以查看和/或下载使用说明书。和说明书一样，这种获得说明书的手段被记录在合适的基质上。

实用性

本发明可应用于多种应用，其中这些应用一般包括基因组DNA分析应用，其中要检测给定样品中特定染色体重排的存在。本方法还可以用于在某些情况下，在没有有关染色体断点和其它畸变(例如微颠换(microinversion)、缺失和易位)的位置的先验知识的条件下对染色体断点和其它畸变进行精细定位。

在一些实施方案中，一组本主题探针与靶染色体的杂交可以提供多颜色模式。使所研究的染色体，其可能被怀疑或不被怀疑含有染色体重排，与标记的探针接触。杂交之后，对探针的结合模式进行分析，如上所述。

具体的感兴趣的检测应用不仅包括染色体重排和畸变。基因组分析测定的一个实施方案允许检测染色体颠换。在该实施方案中，该测定使对参考染色体区的某个区域特异性的探针在原位杂交条件下接触。如果测试染色体区含有被颠换的染色体节段(其可以通过特征发射光谱的特定改变观察到)，则表明发生了颠换。将探针的位置与数据库进行匹配，可以提供探针所杂交的测试染色体的核苷酸序列信息。使用该序列信息，可以揭示颠换关节点(junction)的详细位置。

本主题方法还可用于检测染色体重排。在该实施方案中，该测定使对参考染色体区的某个区域特异的探针在原位杂交条件下接触。如果测试染色体区含有新近被并置的来自远离的染色体区域(这些区域通过其特征性发射光谱可视化)的节段，则表明发生了易位或复杂的染色体异常。在某些情况下，可以利用来自描述起始探针的数据库的序列信息来揭示易位节点的位置。

本主题方法可以用于多种诊断和研究目的，因为染色体颠换和易位在与人类疾病相关的条件下和在许多生物体的基因组进化中发挥重要的作用。

特别地，上述方法可用于诊断或研究各种类型的遗传异常、癌症和其它哺乳动物疾病，包括但不限于，白血病；乳腺癌；前列腺癌；阿尔茨海默氏病；帕金森氏病；癫痫；肌萎缩侧索硬化；多发性硬化；卒中；自闭症；猫叫综合征(Cri du chat)(5号染色体短臂截短)、1p36缺失综合征(染色体1短臂部分缺失)、Angelman综合征(15号染色体长臂部分缺失)；Prader-Willi综合征(15号染色体短臂部分缺失)；急性淋巴细胞白血病，更具体地，慢性髓细胞白血病(9号染色体和22号染色体之间易位)；腭心面综合征(Velocardiofacialsyndrome)(22号染色体长臂部分缺失)；特纳综合征(单X染色体)；Klinefelter综合征(多一条X染色体)；爱德华氏综合征(18号染色体三体性)；唐氏综合征(21号染色体三体性)；Patau综合征(13号染色体三体性)；和8、9和16号染色体三体性，其一般不能存活到出生。

疾病可能是遗传继承性的(种系突变)或散发性的(体细胞突变)。本文中讨论的许多示例性染色体重排与这些病症相关，并且被认为是产生这些病症的因素。知晓染色体重排的类型和位置可以极大地帮助对各种哺乳动物疾病的诊断、预后和理解。

上述方法还能够用于比较两个生物物种的基因组，以推演进化关系。

染色体可以从多种来源分离而得，包括组织培养细胞和哺乳动物受试者，例如人、灵长动物、小鼠或大鼠受试者。例如，可以对来自少于5毫升(mL)外周血的染色体进行分析。白细胞含有染色体而红细胞没有。可以采取血液并与抗凝剂例如肝素钠混合。还可以对来自羊水(其含有胎儿细胞)的染色体进行分析。可以使这些细胞在组织培养中生长，从而在5-10天内便有分裂中的细胞可用于染色体分析。还可以对来自骨髓的染色体进行分析，其可用于诊断白血病或其它骨髓癌症。还可以对来自实体瘤样品的染色体进行分析。可以无菌地获得约2-3mm范围的皮肤或其它组织活检，并转移到含有无菌生理盐水或组织输送介质的无菌瓶中，以提供用于染色体分析的材料。流产后获得的胎儿组织也能够用于染色体分析，例如对来自胎盘的胎儿侧、覆盖胸骨的骨膜或腹股沟韧带上面的筋膜的染色体，或来自绒毛膜绒毛的染色体。胎儿组织还可以从多个部位收集，例如肾脏、胸腺、肺、膈膜、肌肉、腱、和性腺。还可以进行羊膜腔穿刺术。

除了上面以外，还可以对例如骨髓涂片、血涂片、石蜡包埋组织制备物、酶解离组织样品、未培养的骨髓、未培养的羊水细胞和细胞离心涂片制备物实施本方法。

本文通过援引并入本说明书中所引证的全部出版物和专利申请，就像具体地逐个声明通过援引并入每一个单独的出版物或专利一样。对任何出版物的引证是出于引证其中早于申请日的公开内容的目的，而不应当被解释为了承认本发明无权基于发明在先而使这些出版物不构成本发明的现有技术。

尽管出于澄清理解的目的通过图解和举例的方式对前述发明进行了一定程度的描述，但是本领域技术人员根据本发明的教导可以容易地想到，在不背离附加权利要求精神和范围的前提下可以实现某些变化和修改。

Claims

1.一种方法，包括：

(a)合成包含与染色体中的独特序列杂交的探针序列的一组重叠的寡核苷酸，其中每个重叠的寡核苷酸具有与另一重叠的寡核苷酸的一个末端互补的末端，使得重叠的寡核苷酸的末端可以彼此杂交；

(b)通过聚合酶链式组装来组装这些重叠的寡核苷酸，其中重叠的寡核苷酸使用彼此作为模板而延伸，从而产生一个或多个双链多核苷酸，每一个均包含多个探针序列；

(c)标记该一个或多个双链多核苷酸以产生一个或多个标记探针；和

(d)将所述标记探针与完整染色体原位杂交，

其中该方法不用于诊断疾病。

2.权利要求1的方法，其中所述标记是通过随机引发、缺口平移，或通过将一个或多个标记物缀合于所述一个或多个双链多核苷酸而完成的。

3.权利要求1的方法，其中所述探针序列的长度范围是10-150个核苷酸。

4.权利要求1的方法，其中所述一个或多个双链多核苷酸的长度范围是300-5,000个碱基对。

5.权利要求1的方法，其中所述一组寡核苷酸与染色体中的多个不同区域杂交，其中所述不同区域被重复序列所分隔。

6.权利要求1的方法，其中所述染色体是哺乳动物染色体。

7.权利要求1的方法，还包括：

(e)使用显微镜阅读步骤(d)的产物以生成杂交模式。

8.权利要求7的方法，还包括：

(f)将所述杂交模式与对照杂交模式进行比较。