CN104083380B - 闭花木酮Cleistanone的二甲胺衍生物在制备抗病毒药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及有机合成和药物化学领域，具体涉及闭花木酮Cleistanone衍生物、制备方法及其在制备抗病毒药物上的用途。本发明合成了一个新的闭花木酮Cleistanone衍生物，并公开了其制备方法。药理学实验表明，本发明的闭花木酮Cleistanone衍生物具有抗病毒作用，具有开发抗病毒药物的价值。
Description
技术领域
本发明涉及有机合成和药物化学领域，具体涉及闭花木酮Cleistanone衍生物、制备方法及其用途。
背景技术
单纯疱疹病毒1型(Herpes simplex virus，HSV-1)和单纯疱疹病毒2型(Herpessimplex virus，HSV-2)属于疱疹科病毒，HSV-1和HSV-2不仅引起口唇或生殖粘膜疱疹，同时也是引起脑炎、肝炎、全身严重感染甚至宫内感染的重要病原。
呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus，RSV)主要引起呼吸系统感染，在婴幼儿、老年以及免疫缺陷人群引起严重肺炎，是人类上呼吸道感染的重要病原之一。
甲型流感病毒(Influenza A virus，Flu-A)属于正粘科病毒，在人类和其他生物每年都有小范围的流行，引起上呼吸系统感染。大流行时，可引起严重呼吸系统感染，甚者引起肺炎、脑炎甚至死亡。
上述三种病毒的治疗目前已有的药物存在毒性大、安全性低的问题，从天然产物中寻找化合物或先导化合物并进行结构修饰获得其衍生物，从而得到高效低毒的潜在药物最有重要价值。
本发明涉及的化合物闭花木酮Cleistanone是一个2011年发表(Van Trinh ThiThanh et al.,2011.Cleistanone:A Triterpenoid from Cleistanthus indochinensis witha New Carbon Skeleton.Volume2011,Issue22,pages4108–4111,August2011)的化合物，我们对化合物闭花木酮Cleistanone进行了结构修饰，获得了一个新的闭花木酮Cleistanone衍生物，并对其抗病毒活性进行了评价，其具有抗病毒活性。
发明内容
本发明公开了一个闭花木酮Cleistanone衍生物，其结构为：
本发明闭花木酮Cleistanone衍生物(III)可通过下面方法制备：
(1)闭花木酮Cleistanone(I)与1,2-二溴乙烷反应得到闭花木酮Cleistanone的O-溴乙基衍生物(II)；
(2)闭花木酮Cleistanone的O-溴乙基衍生物(II)与二甲胺发生取代反应制得闭花木酮Cleistanone衍生物(III)。
进一步的闭花木酮Cleistanone衍生物(III)的制备方法为：
(1)将440mg化合物闭花木酮Cleistanone(I)溶于10mL苯，向溶液中加入0.04g的四丁基溴化铵，3.760g的1,2-二溴乙烷和6mL的50％氢氧化钠溶液；混合物在25摄氏度搅拌24h；24h之后将反应液倒入冰水中，立即用二氯甲烷萃取两次，合并有机相溶液；然后对有机相溶液依次用水和饱和食盐水洗涤3次，再用无水硫酸钠干燥，最后减压浓缩去除溶剂得到产物粗品；产物粗品用硅胶柱层析纯化，流动相为：石油醚/丙酮＝100:1，v/v，收集黄色集中洗脱带即得到闭花木酮Cleistanone的O-溴乙基衍生物(II)的黄色固体。
(2)将273mg的闭花木酮Cleistanone的O-溴乙基衍生物溶于20mL乙腈当中，向其中加入345mg的无水碳酸钾，84mg的碘化钾和900mg的二甲胺，混合物加热回流16h；反应结束后将反应液倒入冰水中，用等量二氯甲烷萃取三次，合并有机相；依次用水和饱和食盐水洗涤合并之后的有机相，再用无水硫酸钠干燥，减压浓缩去除溶剂得到产物粗品；产物粗品用硅胶柱层析纯化，流动相为：石油醚/丙酮＝100:1，v/v，收集淡黄色集中洗脱带即得到闭花木酮Cleistanone衍生物(III)的淡黄色固体。
本发明公开的化合物可以制成药学上可接受的盐或药学上可接受的载体。
药效学实验表明，本发明的闭花木酮Cleistanone衍生物(III)具有较好的抗病毒作用。本发明的药学上可接受的盐与其化合物具有同样的药效。
化合物III的体外实验表明，化学物III具有很强的抗HSV-1、HSV-2、RSV和flu A的活性，因此本发明的化学物III有望被用于制备新型抗病毒药物。
以下通过实施例对本发明作进一步详细的说明，但本发明的保护范围不受具体实施例的任何限制，而是由权利要求加以限定。
具体实施方式
实施例1 化合物闭花木酮Cleistanone的制备
化合物Cleistanone(I)的制备方法参照Van Trinh Thi Thanh等人发表的文献(Van Trinh Thi Thanh et al.,2011.Cleistanone:A Triterpenoid from Cleistanthusindochinensis with a New Carbon Skeleton.Volume2011,Issue22,pages4108–4111,August2011)的方法。
实施例2 闭花木酮Cleistanone的O-溴乙基衍生物(II)的合成
将化合物I(440mg，1.00mmol)溶于10mL苯，向溶液中加入四丁基溴化铵(TBAB)(0.04g)，1,2-二溴乙烷(3.760g，20.00mmol)和6mL的50％氢氧化钠溶液。混合物在25摄氏度搅拌24h。24h之后将反应液倒入冰水中，立即用二氯甲烷萃取两次，合并有机相溶液。然后对有机相溶液依次用水和饱和食盐水洗涤3次，再用无水硫酸钠干燥，最后减压浓缩去除溶剂得到产物粗品。产物粗品用硅胶柱层析纯化(流动相为：石油醚/丙酮＝100:1，v/v)，收集黄色集中洗脱带即得到化合物II的黄色固体(344mg，63％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ5.04(s,1H),4.82(s,1H),3.94(d,J＝26.5Hz,1H),3.87(d,J＝26.5Hz,2H),3.57(s,2H),2.40(d,J＝14.0Hz,1H),2.39(d,J＝14.0Hz,1H),2.27(s,1H),2.21(s,1H),2.15(s,1H),1.82(s,1H),1.62(s,2H),1.57(d,J＝3.3Hz,1H),1.54(d,J＝3.3Hz,1H),1.50(d,J＝1.2Hz,1H),1.47(d,J＝1.2Hz,1H),1.39(d,J＝15.3Hz,2H),1.34(d,J＝15.3Hz,1H),1.26(dd,J＝32.6,13.7Hz,4H),1.13(d,J＝18.0Hz,2H),1.05(s,6H),0.98(s,1H),0.88(s,12H),0.78(s,3H),0.74(s,1H)。
13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ216.59(s),154.50(s),105.23(s),74.63(s),69.85(s),59.71(s),52.55(s),51.21(s),47.92(s),44.10(s),42.25(s),41.73(s),40.64(s),40.16(s),38.88(s),38.65(s),37.21(s),36.23(s),33.34(d,J＝1.1Hz),32.96(s),29.91(s),27.18(s),26.03(s),24.23(s),23.96(s),20.77(s),18.48(s),17.98(s),16.93(s)。
HRMS(ESI)m/z[M+H]+calcd for C32H52BrO2:547.3151；found547.3159.
实施例3 闭花木酮Cleistanone的O-(二甲胺基)乙基衍生物(III)的合成
将化合物II(273mg，0.5mmol)溶于20mL乙腈当中，向其中加入无水碳酸钾(345mg，2.5mmol)，碘化钾(84mg，0.5mmol)和二甲胺(900mg，20mmol)，混合物加热回流16h。反应结束后将反应液倒入冰水中，用等量二氯甲烷萃取三次，合并有机相。依次用水和饱和食盐水洗涤合并之后的有机相，再用无水硫酸钠干燥，减压浓缩去除溶剂得到产物粗品。产物粗品用硅胶柱层析纯化(流动相为：石油醚/丙酮＝100:1，v/v)，收集淡黄色集中洗脱带即得到化合物III的淡黄色固体(160.7mg,61％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ5.02(s,1H),4.81(s,1H),3.85(s,1H),3.51(s,2H),2.84(s,6H),2.64(s,2H),2.38(d,J＝13.0Hz,2H),2.26(s,1H),2.17(s,1H),2.17(s,1H),1.83(s,1H),1.66(s,2H),1.54(d,J＝6.0Hz,2H),1.46(d,J＝0.9Hz,2H),1.34(d,J＝13.5Hz,3H),1.26(dd,J＝31.1,13.9Hz,4H),1.16(d,J＝13.5Hz,2H),1.07(s,6H),0.98(s,1H),0.85(s,12H),0.76(s,3H),0.73(s,1H).
13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ216.60(s),154.51(s),105.19(s),74.62(s),65.68(s),59.75(s),57.63(s),52.57(s),51.18(s),47.87(s),45.54(s),44.12(s),42.29(s),41.79(s),40.62(s),40.12(s),38.82(s),38.67(s),37.25(s),36.29(s),33.32(s),32.92(s),29.85(s),27.20(s),26.07(s),24.29(s),23.94(s),20.73(s),18.42(s),18.00(s),16.97(s).
HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C34H58NO2:512.4468；found:512.4463。
实施例4 本发明所涉及化合物II和III片剂的制备
取20克化合物II或者III或者其药学上可接受的盐当中的一种，加入制备片剂的常规辅料180克，混匀，常规压片机制成1000片。
实施例5 本发明所涉及化合物II和III胶囊的制备：
取20克化合物II或者III或者其药学上可接受的盐当中的一种，加入制备胶囊剂的常规辅料如淀粉180克，混匀，装胶囊制成1000粒。
实施例6 闭花木酮Cleistanone的O-(二甲胺基)乙基衍生物(III)抗病毒活性
(一)实验例：化合物III对疱疹病毒的作用研究：
(1)细胞株与病毒株：
人胚肾细胞(HEK293，为HSV-1、HSV-2病毒敏感细胞)购自美国Clontech公司；单纯疱疹病毒1型(HSV-1)Sm44株、单纯疱症病毒2型(HSV-2)333株引自中国CDC病毒病研究所。
(2)细胞毒性测定：
参照文献(汪受传，王霖，陈超等，清肺口服液含药血清对病毒抑制作用的实验研究，南京中医药大学学报，2008；24(1)：25～27)的方法，将各样品以2倍比做系列稀释(20～-5)，然后按稀释顺序横向接种于96板孔中的HEK293上，每孔100uL，每稀释度纵向重复3孔(A、B、C行)，平行设微孔板D的1～6孔为细胞对照，7～12孔不接种细胞为空白对照，显微镜下每日观察CPE，连续观察7d，中性红染色，在540nm波长测定OD值，将实验组与细胞对照组OD值相比计算细胞存活率，用Reed-Muench方法计算药物半数细胞中毒浓度(TD50)。
(4)抑毒试验：
参照文献(汪受传，王霖，陈超等，清肺口服液含药血清对病毒抑制作用的实验研究，南京中医药大学学报，2008；24(1)：25～27)的方法，将样品按稀释顺序(2-3～-14)横向接种于96板孔中的单层细胞上，每孔100uL，每稀释度纵向重复4孔，微孔板的A、B、C行加含100个TCID50的病毒100uL作为试验组，D行补充等容量细胞维持液为不同浓度药物对照，平行设F行作为病毒对照，E行的1～12作为细胞对照。37℃、5％CO2培养，每日观察CPE，连续观察4d。病毒对照出现90％以上CPE时，加1％中性红染色，用酶标仪在波长540nm波长读取A值，各组A值去除病毒对照组A值，将各试验组与细胞对照组A值相比，获得细胞存活率，用Reed-Muench方法计算半数抑毒浓度(IC50)，最终将TD50和IC50相比获得抑毒指数(TI)。
(5)结果：
①样品TD50的测定：对照组细胞显微镜下观察贴壁生长致密、形态良好。化合物III的TD50在HEK293为2-2.36。
②抑毒实验：对照组细胞贴壁致密、形态良好。镜下观察发现，HSV-1、HSV-2病毒对照组分别在第3d、3d出现90％以上的CPE，HSV1和HSV2在HEK293CPE则以肿胀、多细胞融合(HSV1致多个细胞融和成大泡，而HSV2致融合为小泡)、变圆、脱落为主要特征。
而抑毒试验各组细胞，按照化合物III样品稀释梯度，梯度规律出现CPE：HSV1-HEK293在第10稀释度之前、HSV2-HEK293组在第9稀释度之前细胞完全被保护，之后出现CPE，CPE随样品浓度减少逐渐加重。
将上述实验板用1％中性红染色、用酶标仪测450nmA值，各组A值减掉病毒对照组A值后，各实验组A值与细胞对照组A值相比获得IC50，IC50与TD50相比获得化合物III的TI：抑制HSV-1、HSV-2在HEK293细胞发生CPE，IC50分别为2-11.33、2-12.11，TI分别为501.5、861.1。
结论：化合物III具有显著的抗疱疹科病毒(包括HSV-1、HEV-2)的作用，而且安全性高，因此化合物III在治疗疱疹病毒感染疾病中具有广泛的应用背景。
(二)实验例：化合物III对呼吸道合胞病毒(RSV)的作用研究
(1)化合物III的配置：将化合物III溶于细胞维持液(含2％新生牛血清的MEM，GIBICO公司产品)中备用。
(2)细胞株与病毒株：
人胚肾细胞(HEK293，RSV病毒敏感细胞)购自美国Clontech公司；呼吸道合胞病毒(RSV)Long株引自中国CDC病毒病研究所。
(3)细胞毒性测定：
参照文献(汪受传，王霖，陈超等，清肺口服液含药血清对呼吸道合胞病毒抑制作用的实验研究，南京中医药大学学报，2008；24(1)：25～27)的方法，将样品以2倍比做系列稀释(20～-5)，然后按稀释顺序横向接种于96板孔中的HEK293上，每孔100uL，每稀释度纵向重复3孔(A、B、C行)，平行设微孔板D的1～6孔为细胞对照，7～12孔不接种细胞为空白对照，显微镜下每日观察CPE，连续观察7d，中性红染色，在540nm波长测定OD值，将实验组与细胞对照组OD值相比计算细胞存活率，用Reed-Muench方法计算药物半数细胞中毒浓度(TD50)。
(4)抑毒试验：
参照文献(汪受传，王霖，陈超等，清肺口服液含药血清对呼吸道合胞病毒抑制作用的实验研究，南京中医药大学学报，2008；24(1)：25～27)的方法，将样品按稀释顺序(2-2～-13)横向接种于96板孔中的单层细胞上，每孔100uL，每稀释度纵向重复4孔，微孔板的A、B、C行加含100个TCID50的病毒100uL作为试验组，D行补充等容量细胞维持液为不同浓度药物对照，平行设F行作为病毒对照，E行的1～12作为细胞对照。37℃、5％CO2培养，每日观察CPE，连续观察4d。病毒对照出现90％以上CPE时，加1％中性红染色，用酶标仪在波长540nm波长读取A值，各组A值去除病毒对照组A值，将各试验组与细胞对照组A值相比，获得细胞存活率，用Reed-Muench方法计算半数抑毒浓度(IC50)，最终将TD50和IC50相比获得抑毒指数(TI)。
(5)结果：
①样品TD50的测定：对照组细胞显微镜下观察贴壁生长致密、形态良好。化合物III对HEK293的TD50为2-1.02。
②抑毒实验：对照组细胞贴壁致密、形态良好。镜下观察发现，RSV病毒对照组在第2d出现90％以上的CPE，RSV在HEK293CPE以折光性增强、变圆、脱落、破碎为主要特征。
而抑毒试验各组细胞，按照样品稀释梯度，梯度规律出现CPE：
RSV-HEK293试验组细胞在第9稀释度之前，细胞完全被保护，之后出现CPE，CPE随样品浓度减少逐渐加重。
将上述实验板用1％中性红染色、用酶标仪测450nmA值，各组A值减掉病毒对照组A值后，各实验组A值与细胞对照组A值相比获得IC50，IC50与TD50相比获得TI：抑制RSV在HEK293细胞发生CPE，IC50为2-11.72，TI为1663.5。
结论：化合物III具有显著的抗副粘科病毒呼吸道合胞病毒RSV的作用，可以用来制备抗副粘科病毒呼吸道合胞病毒RSV药物。
(三)实验例：化合物III对甲型流感病毒的作用研究：
(1)细胞株与病毒株：狗肾细胞(MDCK，流感病毒敏感细胞)引自中国CDC病毒病研究所；流感病毒甲型(Flu A)1995.AII：32094地方株引自中国CDC病毒病研究所。
(2)细胞毒性测定：
参照文献(汪受传，王霖，陈超等，清肺口服液含药血清对病毒抑制作用的实验研究，南京中医药大学学报，2008；24(1)：25～27)的方法，将各样品以2倍比做系列稀释(2-1～-5)，然后按稀释顺序横向接种于96板孔中的MDCK上，每孔100uL，每稀释度纵向重复3孔(A、B、C行)，平行设微孔板D的1～6孔为细胞对照，7～12孔不接种细胞为空白对照，显微镜下每日观察CPE，连续观察7d，中性红染色，在540nm波长测定OD值，将实验组与细胞对照组OD值相比计算细胞存活率，用Reed-Muench方法计算药物半数细胞中毒浓度(TD50)。
(3)抑毒试验：
参照文献(汪受传，王霖，陈超等，清肺口服液含药血清对病毒抑制作用的实验研究，南京中医药大学学报，2008；24(1)：25～27)的方法，将样品按稀释顺序横向接种于96板孔中的单层细胞上，每孔100uL，每稀释度纵向重复4孔，微孔板的A、B、C行加含100个TCID50的病毒100uL作为试验组，D行补充等容量细胞维持液为不同浓度药物对照，平行设F行作为病毒对照，E行的1～12作为细胞对照。37℃、5％CO2培养，每日观察CPE，连续观察4d。病毒对照出现90％以上CPE时，加1％中性红染色，用酶标仪在波长540nm波长读取A值，各组A值去除病毒对照组A值，将各试验组与细胞对照组A值相比，获得细胞存活率，用Reed-Muench方法计算半数抑毒浓度(IC50)，最终将TD50和IC50相比获得抑毒指数(TI)。
(4)结果：
①样品TD50的测定：对照组细胞显微镜下观察贴壁生长致密、形态良好。化合物III的TD50在MDCK为2-1.91。
②抑毒实验：对照组细胞贴壁致密、形态良好。镜下观察发现，Flu A在MDCK CPE以折光性增强、坏死、破碎为主要特征。
而抑毒试验各组细胞，按照样品稀释梯度，梯度规律出现CPE：FluA-MDCK组细胞在第8稀释度之前细胞完全被保护，之后出现CPE，CPE随样品浓度减少逐渐加重。
将上述实验板用1％中性红染色、用酶标仪测450nm的A值，各组A值减掉病毒对照组A值后，各实验组A值与细胞对照组A值相比获得IC50，IC50与TD50相比获得TI：抑制Flu A在MDCK细胞发生CPE，IC50为2-9.22，TI为158.7。
结论：化合物III对甲型流感病毒具有很强的抑制作用，而且安全，因此化合物III在治疗甲型流感病毒感染疾病中具有广泛的应用背景。
Claims (6)
1.一种具有式III所示结构的闭花木酮Cleistanone衍生物及其药学上可接受的盐在制备抗病毒药物中的应用，其特征在于：所述病毒为甲型流感病毒，
2.一种具有式III所示结构的闭花木酮Cleistanone衍生物及其药学上可接受的盐在制备抗病毒药物中的应用，其特征在于：所述病毒为单纯疱疹病毒，
3.一种具有式III所示结构的闭花木酮Cleistanone衍生物及其药学上可接受的盐在制备抗病毒药物中的应用，其特征在于：所述病毒为呼吸道合胞病毒，
4.如权利要求2所述的一种具有式III所示结构的闭花木酮Cleistanone衍生物及其药学上可接受的盐在制备抗病毒药物中的应用，其特征在于：所述单纯疱疹病毒为单纯疱疹病毒1型或者单纯疱疹病毒2型。
5.如权利要求4所述的一种具有式III所示结构的闭花木酮Cleistanone衍生物及其药学上可接受的盐在制备抗病毒药物中的应用，其特征在于：所述单纯疱疹病毒1型为单纯疱疹病毒1型的Sm44株。
6.如权利要求4所述的一种具有式III所示结构的闭花木酮Cleistanone衍生物及其药学上可接受的盐在制备抗病毒药物中的应用，其特征在于：所述单纯疱疹病毒2型为单纯疱疹病毒2型333株。
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