CN104080732A - 热稳定酶及其产生和使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于增强酶活性、半衰期和/或热稳定性的组合物和方法。本发明还提供了包括增强的酶的组合物和方法。本发明还提供了与改良的诸如果胶酸裂合酶的果胶分解酶相关的方法和组合物，所述改良的果胶分解酶表现出增强的活性、热稳定性和/或较长的半衰期。
Description
背景
用于食品加工的商业酶制剂一般包含果胶酸裂合酶成分，该组分催化导致食品的品质改良的化学反应。因为酶制剂可能包括源自用于产生该酶的微生物的组分，在食品加工过程中尤其要考虑无菌性。
通常，高温可提供灭菌作用。然而，提供灭菌作用的高温可能导致酶变性。结果酶的活性可能降低或丧失
概述
本文提供了与具有增强的活性、半衰期和/或热稳定性相关的酶的组合物和方法。
在一些方面，提供了酶组合物。在一些实施方案中，酶组合物包括至少一种包含磷灰石部分的纳米颗粒，和至少一种酶，所述酶与纳米颗粒或磷灰石部分或以上二者相接触。在一些实施方案中，磷灰石部分包括羟磷灰石。在一些实施方案中，纳米颗粒包括具有约50nm至约200nm的直径的磷灰石部分。
在一些实施方案中，酶包括果胶分解酶。在一些实施方案中，果胶分解酶包括以下中的一种或多种：果胶酸裂合酶、果胶裂合酶、聚半乳糖醛酸酶、聚半乳糖醛酸裂解酶、果胶酯酶、果胶酶和内切型果胶酸裂合酶。在一些实施方案中，酶是果胶酸裂合酶、果胶裂合酶、聚半乳糖醛酸酶、聚半乳糖醛酸裂解酶、果胶酯酶、果胶酶、内切型果胶酸裂合酶，或其组合。
在一些实施方案中，酶来源于微生物，比如细菌或真菌。例如，在一些实施方案中，酶从以下中的一种或多种中来纯化：芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)、曲霉菌属物种(Aspergillus sp.)、青霉菌属物种(Penicillium sp.)、核盘菌属物种(Sclerotinia sp.)、韧革菌属物种(Stereum sp.)、欧文氏菌属物种(Erwinia sp.)、无枝酸菌属物种(Amycolata sp.)、耶尔森氏菌属物种(Yersinia sp.)、镰刀菌属物种(Fusarium sp.)、假单胞菌属物种(Pseudomonas sp.)、链霉菌属物种(Streptomyces sp.)、念珠菌属物种(Candida sp.)、红酵母属物种(Rhodotorula sp.)、和短梗霉属物种(Aureobasidium sp.)。在一些实施方案中，酶是由重组得到的。在一些实施方案中，酶包括重组的酶。
在一些实施方案中，组合物包括一种或多种阳离子。例如，在一些实施方案中，组合物包括至少一种二价阳离子。在一些实施方案中，二价阳离子包括钙。
在一些实施方案中，与不与纳米颗粒或磷灰石部分或以上二者相接触的相同的酶相比较，组合物中的酶表现出增高的活性。另外地或可选地，在一些实施方案中，与不与纳米颗粒或磷灰石部分或以上二者相接触的相同的酶相比较，组合物中的酶是更热稳定的。另外地或可选地，在一些实施方案中，与不与纳米颗粒或磷灰石部分或以上二者相接触的相同的酶相比较，在较高的温度下，组合物中的酶具有增高的活性。在一些实施方案中，与不与纳米颗粒或磷灰石部分或以上二者相接触的相同的酶相比较，在较高的温度下组合物中的酶具有增高的活性且是更热稳定的。在一些实施方案中，与不与纳米颗粒或磷灰石部分或以上二者相接触的相同的酶相比较，组合物中的酶具有更长的半衰期。在一些实施方案中，酶包括果胶分解酶。在一些实施方案中，酶是果胶分解酶。在一些实施方案中，酶包括果胶酸裂合酶。在一些实施方案中，酶是果胶酸裂合酶。
在一些方面，提供了产生热稳定酶组合物的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：将以下组合以形成混合物：i)多个纳米颗粒，其中所述纳米颗粒的至少一些包括磷灰石部分；和ii)至少一种酶；所述组合在酶与纳米颗粒或磷灰石部分或以上二者相接触的条件下进行。在一些实施方案中，磷灰石包括羟磷灰石。在一些实施方案中，酶包括果胶分解酶。在一些实施方案中，酶包括果胶酸裂合酶。在一些实施方案中，方法包括将一种或多种二价阳离子组合到混合物中。在一些实施方案中，所述一种或多种二价阳离子包括Ca2+、Mg2+、Mn2+、Co2+和Cd2+中的一种或多种。
在本方法的一些实施方案中，将混合物孵育。例如在一些实施方案中，将混合物在约55℃下孵育。另外地或可选地，在一些实施方案中，将混合物持续孵育约2小时至约5小时。在一些实施方案中，孵育在约8.5的pH下进行。在一些实施方案中，在组合前将酶纯化。
在一些方面，本文提供了处理含果胶物质的方法。在一些实施方案中，所述方法包括将所述物质与包括以下的组合物相接触：i)至少一种纳米颗粒，包括磷灰石部分；和ii)果胶分解酶，所述果胶分解酶与纳米颗粒或磷灰石部分或以上二者接触；与所述组合物的接触持续一定时间且在其中物质中的果胶的至少一些被酶裂解的条件下进行。在一些实施方案中，含果胶物质包括纺织物、植物、清洁剂、生物复合物、废水、纸、油、动物饲料、食物、饮料或其组合。在一些实施方案中，接触在大于或等于约55℃的温度下进行。在一些实施方案中，含果胶物质包括食物，且其中所述接触在大于或等于约90℃的温度下进行。在一些实施方案中，所述组合物还包括至少一种二价阳离子。在一些实施方案中，所述纳米颗粒、磷灰石部分或以上二者经由至少一种二价阳离子与果胶分解酶相接触。
在一些方面，提供了试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包括i)果胶分解酶；ii)包括磷灰石部分的多个纳米颗粒；和iii)用于将所述酶与所述纳米颗粒组合以形成酶组合物的说明书。在一些实施方案中，试剂盒包括用于将所述酶组合物应用于含果胶物质的说明书。另外地或可选地，在一些实施方案中，磷灰石部分包括羟磷灰石。在一些实施方案中，果胶分解酶包括果胶酸裂合酶。
以上的概述仅为示例性的，且并不意在以任何方式进行限制。除以上所描述的示例性的方面、实施方案和特征之外，另外的方面、实施方案和特征将通过参照以下的详细描述变得明显。
附图简述
图1显示了通过硫代巴比妥酸(TBA)测定，在具有和没有羟磷灰石纳米颗粒的情况下，孵育5小时后作为时间的函数的果胶酸裂合酶活性测定的比较研究的结果。
图2A和2B示出了在渐增的温度下(55℃-90℃)通过TBA测定，在存在或不存在任何Ca离子的情况下，在具有和没有羟磷灰石纳米颗粒的情况下，果胶酸裂合酶活性测定的比较研究的结果。图2A：无纳米颗粒或Ca2+；图2B：无纳米颗粒或Ca2+。
图3显示了羟磷灰石(“HPA”)纳米颗粒处理的果胶酸裂合酶的热激活的阿伦纽斯(Arrhenius)曲线。
图4显示了未处理的果胶酸裂合酶的热激活的阿伦纽斯曲线。
图5(a)-5(b)显示了HPA纳米颗粒未处理的(5A)和HPA纳米颗粒处理的(5B)果胶酸裂合酶的热失活的阿伦纽斯曲线。
图6(a)-6(b)分别示出了果胶酸裂合酶的温度和pH相关性。
图7是显示在不同的阳离子存在下果胶酸裂合酶的相对活性的图。
图8是显示在不同浓度的羟磷灰石纳米颗粒存在时酶活性的图。
图9显示了在不同浓度的钙存在下的相对酶活性。
详述
以下的详述参照了作为说明书的部分的附图。除非文中另外指明，在附图中，相似的符号通常代表相似的成分。在详述、附图和权利要求中描述的示例性实施方案并不意在进行限制。可使用其他实施方案，和作出其他改变，而不会脱离本发明主题的精神或范围。
本文所公开的是与热稳定酶的生产和使用相关的组合物和方法。在一些实施方案中，本文所公开的酶组合物和方法包括(1)一种或多种酶，比如果胶分解酶；和(2)至少一种纳米颗粒，其包括磷灰石部分。通常，磷灰石部分、纳米颗粒或以上二者与所述酶相接触。
I.纳米颗粒
在本文所描述的一些示例性实施方案中所提供的纳米颗粒是指最大尺寸在纳米米范围中的任何颗粒，和/或其中组合物包含多个纳米颗粒的情况，本文所描述的尺寸可指多个纳米颗粒的各自的尺寸的平均值。例如，在一些实施方案中，纳米颗粒具有小于1000nm的最大尺寸，例如，约999nm，约900nm，约800nm，约700nm，约600nm，约500nm，约400nm，约300nm，约200nm或约100nm。另外地或可选地，在一些实施方案中，纳米颗粒的最大尺寸为，例如，约100nm，例如，约90nm，约80nm，约70nm，约60nm，约50nm，约25nm，约20nm，约10nm，约5nm，约3nm，约2nm或约1nm或更小。
如以上所述，尺寸可指，例如，颗粒的最大尺寸。另外地或可选地，尺寸可指颗粒的最小尺寸。颗粒可具有任何形状。例如，在一些实施方案中，纳米颗粒可指至少基本上球形的颗粒。另外地或可选地，纳米颗粒可具有椭圆形、立方形、圆柱形或不规则的形状的形状。根据形状的不同，本文所描述的尺寸可指任何直径、半径、宽度、长度、高度、对角线和类似的尺寸。同样，在其中组合物包含多个纳米颗粒的情况中，本文所描述的尺寸可指多个纳米颗粒的各自的尺寸的平均值。例如，在一些实施方案中，多个纳米颗粒的各自的尺寸的平均值为约1000nm，约999nm，约900nm，约800nm，约700nm，约600nm，约500nm，约400nm，约300nm，约200nm或约100nm。另外地或可选地，在一些实施方案中，多个纳米颗粒的各自的尺寸的平均值是，例如，约100nm，例如，约90nm，约80nm，约70nm，约60nm，约50nm，约25nm，约20nm，约10nm，约5nm，约3nm，约2nm或约1nm。
在一些实施方案中，纳米颗粒具有基本上球形的形状和约2nm至约500nm的直径，例如，约10nm至约400nm，约25nm至约300nm，约50nm至约200nm，约80nm至约100nm。
在一些实施方案中，纳米颗粒包括磷灰石。在一些实施方案中，纳米颗粒包括羟磷灰石。
II.磷灰石部分
如本文所用的，术语磷灰石部分(或简称“磷灰石”)指磷酸盐矿物的组，包括在晶体中分别包含OH-、F-、Cl-或Br-离子的羟磷灰石、氟磷灰石、氯磷灰石和溴磷灰石。在一些实施方案中，这些端元的掺和物的化学式写作Ca10(PO4)6(OH，F，Cl，Br)2，和这些单独的矿物的晶体的晶胞式写作Ca10(PO4)6(OH)2、Ca10(PO4)6(F)2、Ca10(PO4)6(Cl)2和Ca10(PO4)6(Br)2。
磷灰石是由生物微环境系统所产生和使用的一些矿物其中之一。磷灰石是边界清楚的矿物，莫氏硬度5。羟磷灰石，又称作羟基磷灰石，是牙釉质和骨无机质的主要成分。在本文提供的一些实施方案中，磷灰石部分指羟磷灰石。羟磷灰石具有式Ca5(PO4)3(OH)，但通常写作Ca10(PO4)6(OH)2以表示晶体晶胞包括两个实体。在一些实施方案中，羟磷灰石是纳米颗粒的形式。
羟磷灰石(HPA)被认为是生物材料，且用作，例如，食品添加剂和营养添加物。HPA纳米颗粒(例如，纳米颗粒形式的HPA)显示无毒性反应且是生物相容的。因此，HPA可用于食品。
III.酶
在本文提供的一些实施方案中，至少一种酶与纳米颗粒、磷灰石部分或以上二者相接触。根据应用的不同，酶或酶组合物可包括任何适宜的酶。在一些实施方案中，酶或酶组合物包括果胶分解酶。如本文所用的，果胶分解酶(有时称作“果胶酶”)指水解果胶的酶。
在一些实施方案中，果胶分解酶包括果胶酸裂合酶。果胶酸裂合酶还被同义地称作内切型果胶酸裂合酶(或反式消除酶)、果胶酸裂合酶、多聚半乳糖醛酸裂解酶、内切型半乳糖醛酸反式消除酶、内切-α-1，4-聚半乳糖醛酸裂解酶、聚半乳糖醛酸裂解酶和α-1，4-D-内切聚半乳糖醛酸裂解酶。
例如，但非限制性地，果胶酶可见于水果和纺织物工业的应用中。这些酶将植物组织的复杂的多糖降解为较简单的分子，如半乳糖醛酸。这种果胶酶可以是酸性的或碱性的。酸性的果胶酶，例如，可用于降低饮料诸如果汁和/或蔬菜汁的浊度和苦味。碱性的果胶酶可用于纺织物工业以用于纤维作物、纸的生产、咖啡和茶的发酵、油提取和果胶废水(例如，来自果汁工业)处理的浸解和脱胶。
在一些实施方案中，果胶分解酶包括以下中的一种或多种：果胶酸裂合酶、果胶裂解酶、聚半乳糖醛酸酶、聚半乳糖醛酸裂解酶、果胶酯酶、果胶裂解酶酶、果胶酶和内切型果胶酸裂合酶。在一些实施方案中，果胶分解酶是以下中的一种或多种：果胶酸裂合酶、果胶裂解酶、聚半乳糖醛酸酶、聚半乳糖醛酸裂解酶、果胶酯酶、果胶裂解酶、果胶酶和内切型果胶酸裂合酶。在一些实施方案中，果胶分解酶包括果胶酸裂合酶。
酶可来源于多种细菌、真菌或重组来源。在一些实施方案中，酶是细菌来源的。另外地或可选地，在一些实施方案中，酶是重组来源的，例如，通过本领域中已知的方法进行重组。酶可从不同的来源获得，包括真菌和/或细菌。例如，酶可从以下中的一种或多种中获得或纯化：芽孢杆菌属物种、曲霉菌属物种、青霉菌属物种、核盘菌属物种、韧革菌属物种、欧文氏菌属物种、无枝酸菌属物种、耶尔森氏菌属物种、镰刀菌属物种、假单胞菌属物种、链霉菌属物种、念珠菌属物种、红酵母属物种和短梗霉属物种。
在一些实施方案中，酶包括聚半乳糖醛酸酶。聚半乳糖醛酸酶可从真菌和/或细菌中获得或纯化。例如，聚半乳糖醛酸酶可从以下中的至少一种中获得：日本曲霉(Aspergillus japonicus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、常现青霉(Penicillium frequentans)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)和紫韧革菌(Stereum purpureum)。另外地或可选地，聚半乳糖醛酸酶可通过本领域中已知的重组方法来获得。
在一些实施方案中，酶包括多聚半乳糖醛酸裂解酶。多聚半乳糖醛酸裂解酶可从真菌和/或细菌中获得或纯化。例如，聚半乳糖醛酸酶可从以下中的至少一种中获得：胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwiniacarotovora)、浸麻芽孢杆菌(Bacillus macerans)、无枝酸菌属物种(Amycolata sp.)、芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、芽孢杆菌TS44(Bacillus sp.TS44)、串珠镰刀菌(Fusarium monoliforme)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、边缘假单胞菌(Pseudomonas marginalis)、热普通链霉菌(Streptomyces thermovulgaris)和博伊丁念珠菌S2(Candida boidiniiS2)。另外地或可选地，多聚半乳糖醛酸裂解酶可通过本领域中已知的重组方法来获得。
在一些实施方案中，酶包括果胶酯酶。果胶酯酶可从真菌和/或细菌中获得或纯化。例如，聚半乳糖醛酸酶可从红酵母属物种、菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi B341)、黑曲霉和日本曲霉中的至少一种中获得。另外地或可选地，果胶酯酶可从本领域中已知的重组方法中获得。
在一些实施方案中，酶包括果胶裂解酶。果胶裂解酶可从真菌和/或细菌中获得或纯化。例如，果胶裂解酶可从黑曲霉NCIM548、黑曲霉A138、意大利青霉(Penicillium italicum CECT2294)、灰玫瑰青霉(Penicillium griseoroseum CCT6421)和出芽短梗霉(Aureobasidium pullalans LV10)。另外地或可选地，果胶裂解酶可通过本领域中已知的重组方法来获得。
在一些实施方案中，酶包括果胶酶。果胶酶可从真菌和/或细菌中获得或纯化。例如，果胶酶可从芽孢杆菌DT-7、芽孢杆菌TS47、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、丁香假单胞菌大豆致病变种(P.syringae pv.Glycinea)和意大利青霉(Penicillium italicum)中的至少一种中获得。另外地或可选地，果胶酶可通过本领域中已知的重组方法来获得。
酶可以是天然形式的(例如，天然的酶)或合成形式的(比如重组酶)酶。重组酶可以是，例如，商业上可获得的重组酶。
IV.阳离子
在一些实施方案中，本文所描述的组合物包括至少一种阳离子。如本文所用的，阳离子指携带至少一个正电荷的离子，所述至少一个正电荷例如，一个电荷(即，单价的)、两个电荷(即，二价的)、三个电荷(即，三价的)等。在一些实施方案中，本文所描述的组合物具有至少一个二价阳离子。在一些实施方案中，阳离子是金属离子，比如碱金属离子、碱土离子、过渡金属离子和类似的阳离子。在一些实施方案中，阳离子是单价阳离子，包括Li+、Na+、K+等。另外地或可选地，阳离子是二价阳离子，包括Be2+、Mg2+、Ca2+、Sr2+、Ba2+、Ra2+、Mn2+、Co2+和Cd2+等。例如，在一些实施方案中，二价阳离子选自由Ca、Mg、Mn、Co和Cd组成的组。
在一些实施方案中，将阳离子添加到组合物中，例如，包括诸如果胶分解酶的酶和包括至少一种磷灰石部分的纳米颗粒的组合物。另外地或可选地，在一些实施方案中，阳离子作为至少一个分子的部分存在于组合物中。例如，阳离子可以是磷灰石部分的钙离子。另外地或可选地，阳离子可以是另外添加到磷灰石部分的钙离子。
V.利用包括磷灰石部分的纳米颗粒处理酶
本文提供的是利用纳米颗粒处理诸如果胶分解酶的酶的方法。在一些实施方案中，处理方法包括将以下组合而形成混合物：i)多个纳米颗粒，其中所述纳米颗粒中的至少一些包括磷灰石部分；和ii)至少一种酶；所述组合在其中所述酶与纳米颗粒、磷灰石部分或以上二者相接触的条件下进行。
酶、纳米颗粒和磷灰石部分可以如以上所描述。在一些实施方案中，处理可进一步包括(除可能存在于磷灰石部分的二价阳离子之外的)将(外部的)二价阳离子添加到混合物中。可通过任何适宜的孵育技术孵育混合物，且条件可根据被孵育的物质而不同。例如，在一个实施方案中，在至少约55℃——例如，约60℃、约65℃、约70℃、约75℃、约80℃、约85℃或约90℃下孵育混合物。在另一个实施方案中，孵育可进行持续约10分钟至约10小时——例如，约10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时的时间，或持续从约2小时至约5小时、约3小时至约4小时的时间。在一些实施方案中，孵育可在微碱性条件下进行。例如，孵育可在至少约6的pH下进行——例如，pH约6.5，约7，约7.5，约8，约8.5，约9，约9.5或约10。在一些实施方案中，酶包括果胶分解酶。在一些实施方案中，酶包括果胶酸裂合酶。在一些实施方案中，纳米颗粒包括羟磷灰石。
根据所用的酶不同，处理可进一步包括在将其组合到混合物中之前纯化酶(例如，从细菌来源或真菌来源)。可选地，纯化的酶可易于与其他物质组合以形成混合物。
在一些实施方案中，利用包括磷灰石部分的纳米颗粒对酶的处理可改变酶的性质。如本文所用的“经处理的”酶指与包括磷灰石部分的纳米颗粒接触的或已经接触过的酶。在一些实施方案中，酶是与至少一种纳米颗粒的至少一部分接触的酶。另外地或可选地，在一些实施方案中，酶是与纳米颗粒、磷灰石部分或以上二者接触的酶。接触可通过多种机制进行，比如氢键合、范德华力等。在一些实施方案中，纳米颗粒包括羟磷灰石。
在一些实施方案中，利用包括磷灰石部分(例如，羟磷灰石)纳米颗粒进行的处理可导致改变的或改良的耐热性、稳定性和/或活性。根据环境和特定的性质的不同，本文所描述的改良可指性质程度的增高或降低。
例如，在一些实施方案中，与未与纳米颗粒、磷灰石部分或以上二者接触的相同的酶相比较，利用包括磷灰石的纳米颗粒处理的酶具有增高的活性。在一些实施方案中，增高可以为大于未接触纳米颗粒、磷灰石部分或以上二者的酶活性的至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％at least about60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约200％、至少约400％、至少约600％、至少约800％或至少约1000％。在一些实施方案中，增高可以为高于未接触纳米颗粒、磷灰石部分或以上二者的酶活性的至少一个数量级，比如10倍、20倍、30倍、40倍、50倍或更高倍。活性可通过任何易于获得的技术来测量。例如，在一些实施方案中，利用在550nm处激发样品之后来测量酶活性。在另外的实施方案中，如下文所描述，活性可通过动力学参数来表征，包括km、Vmax和活化能。例如，但非限制性地，在一个实施方案中，酶包括果胶酸裂合酶，且酶-底物复合物(例如，果胶酸裂合酶+PGA)和TBA导致了有颜色的化合物，其在550nm处被激发。
另外地或可选地，在一些实施方案中，与未用包括磷灰石部分的纳米颗粒处理的相同的酶相比较，经处理的酶表现出更多的热稳定性。例如，在一些实施方案中，利用包括磷灰石部分的纳米颗粒进行的处理可增高热稳定性。热稳定性可通过一些度量方法来测量和描述。例如，热稳定性的增高可指在将酶暴露于增高的温度持续一段时间后酶保留其活性。例如，在一些实施方案中，在本文的一些实施方案中提供的经处理的酶在被暴露于增高的温度持续至少2小时后保留活性，所述至少2小时例如，至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少8小时、至少10小时。在一些实施方案中，增高的温度指高于室温的温度——例如，至少30℃，至少37℃，至少40℃，至少45℃，至少50℃，至少55℃，至少60℃，至少65℃，至少70℃，至少75℃，至少80℃，至少85℃，至少90℃，至少95℃，至少100℃，至少105℃，至少110℃，至少115℃，至少120℃或更高。在一些实施方案中，酶包括果胶分解酶。在一些实施方案中，酶包括果胶酸裂合酶。
另外地或可选地，在一些实施方案中，与未用包括磷灰石部分的纳米颗粒处理的相同的酶相比较，利用包括磷灰石部分的纳米颗粒处理的酶较高的(或增高的)温度下可具有增高的活性。例如，在一些实施方案中，增高可以是大于未与纳米颗粒、磷灰石部分或以上二者接触的酶的活性的至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约200％、至少约400％、至少约600％、至少约800％或至少约1000％。在一些实施方案中，增高可以是高于未与纳米颗粒、磷灰石部分或以上二者接触的酶的至少一个数量级，比如10倍、20倍、30倍、40倍、50倍或更高的倍数。活性可通过任何易于获得的技术来测量。例如，在一些实施方案中，利用在550nm处激发样品之后的吸光度来测量酶活性。在一些实施方案中，增高的温度指高于室温的温度——例如，至少30℃，至少37℃，至少40℃，至少45℃，至少50℃，至少55℃，至少60℃，至少65℃，至少70℃，至少75℃，至少80℃，至少85℃，至少90℃，至少95℃，至少100℃，至少105℃，至少110℃，至少115℃，至少120℃或更高。在一些实施方案中，酶包括果胶分解酶。在一些实施方案中，酶包括果胶酸裂合酶。在一些实施方案中，，纳米颗粒包括羟磷灰石。
在一些实施方案中，与未用纳米颗粒处理的相同的酶相比较，利用包括磷灰石部分的纳米颗粒处理的酶可具有较长的半衰期。在一些实施方案中，与未用包括磷灰石部分的纳米颗粒处理的相同的酶相比较，半衰期的增加为比其长至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少100％、至少200％、至少400％、至少600％、至少800％、至少1000％。在一些实施方案中，增加可以是高至少一个数量级，比如高10倍、20倍、30倍、40倍、50倍。在一些实施方案中，酶包括果胶分解酶。在一些实施方案中，酶包括果胶酸裂合酶。在一些实施方案中，纳米颗粒包括羟磷灰石。
V.利用酶组合物对底物物质的处理
以上所描述的酶组合物可应用于处理含果胶物质(例如，底物)。例如，在一些实施方案中，方法包括：将含果胶物质与包括以下的组合物相接触：i)至少一种纳米颗粒，其包括磷灰石部分；和ii)与纳米颗粒、磷灰石部分或以上二者接触的果胶分解酶；所述与组合物的接触持续一定时间并在其中物质中的果胶的至少一些被酶裂解的条件下进行。
酶、纳米颗粒和磷灰石部分可以为如以上所描述。在一些实施方案中，含果胶物质包括纺织物、植物、清洁剂、生物复合物、废水、纸、油、动物饲料、食物、饮料或其组合。
在一些实施方案中，其中将物质与酶组合物相接触的条件类似于以上所描述的孵育条件。例如，在一些实施方案中，接触在高于或等于约55℃的温度下进行。在一些实施方案中，其中所述含果胶物质包括食物或饮料，且所述接触可在较高的温度下进行，例如，以对食物进行灭菌。例如，在一些实施方案中，接触在高于60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃的温度或高于或等于90℃或95℃的温度下进行。
在一些实施方案中，本文所提供的组合物可提供用于以下的稳健的催化剂替代物：用于在工业处理温度下降解含果胶物质；用于果汁和酒的提取和净化；用于含果胶物质的工业废水的处理；用于天然韧皮纤维(例如，麻类植物和亚麻织物)、棉织物和其组合的浸解或生物净化。
在一些实施方案中，由于本文所描述的组合物所提供的酶活性和/或热稳定性的增强可以是某些数量级的，可采用的高温确保了高度的食物安全性。因此，本文所公开的组合物和方法可用于多种食品工业应用中(例如，果酱加工、果汁净化)。
并且，本文所公开的组合物和方法可用于天然纤维的脱胶，和用来产生用于治疗用途的果胶片段。提高酶热稳定性同时保持在高温下的高活性的纳米启动的程序的应用不仅限于该领域，且可用于多种其他相关的工业酶学和农业相关的领域。例如，本文所提供的组合物和方法可用于处理果胶废水、日本纸的产生、造纸、油萃取、咖啡和茶发酵或其组合。
VI.示例性的用途
A.用于净化的酶组合物的用途
在工业规模中，化学净化是常见的，其通过从许多天然纤维中去除非纤维素物质提高了纺织物的水吸收能力和白度。化学净化过程中所用的烈性、危险性化学品如苏打灰、草酸、苛性钠导致了一些环境污染和纤维强度变弱。
虽然对用于生物精炼程序的酶方法是感兴趣的，目前所用的许多酶缺少精炼效率。缺少精炼效率可由于酶的热不稳定性和低活性而导致。热不稳定性导致了随时间推移活性的降低，这是由于热诱导的酶构象的改变所导致。较高的温度加速了活性的降低。低活性限制了可发生精炼的速率。精炼效率可通过利用包括果胶分解酶的组合物来提高，所述果胶分解酶具有如本文所描述的增高的热稳定性和酶活性。
B.纤维作物的浸解和脱胶
果胶分解酶常用于黄麻纤维、亚麻纤维、大麻纤维、苎麻纤维、南非槿麻(Hibiscus sativa)和来自椰壳的椰皮纤维的浸解和脱胶。浸解是发酵过程，其中某些细菌(例如，梭状芽孢杆菌(Clostridium)、芽孢杆菌)和某些真菌(例如，曲霉菌、青霉菌)分解树皮的果胶并释放纤维。商业上，浸解通过两种基本形式中之一来进行，且如本文所公开的热稳定酶组合物在该过程中将是有用的。
例如，苎麻纤维是优异的天然纺织物，但去皮的苎麻纤维包含20+-35％苎麻胶，所述苎麻胶主要由果胶和半纤维素组成；因此需要对纤维进行脱胶以符合纺织物的需要。本文所公开的热稳定酶组合物将有用于浸解该纤维。
C.果胶废水的处理
来自柑橘加工工业的废水包含含果胶物质，所述含果胶物质在活化的浆处理过程中几乎不会被微生物所分解。已开发了利用嗜碱性微生物的新型废水处理程序。已证明利用该细菌菌株进行的处理在从废水中取出果胶物质中是有用的。另外地或可选地，可利用本文所公开的热稳定酶组合物处理废水以去除果胶物质。利用本文公开的酶组合物将具有如下优点：消除污染的风险且无需与使用细菌系统常相关的另外的工作(例如，去除微生物的过程)。
D.日本纸的产生
由芽孢杆菌属物种和胡萝卜软腐欧文氏菌产生的碱性果胶酶由于其强浸化活性已用于三级皮韧皮纤维的浸解。已将这些经浸解的韧皮纤维用于日本纸的制备。来自细菌浸解的纸浆的强度与通过常规的苏打灰熬炼方法获得的纸浆强度一样高。由该纸浆制备的纸张极为平滑且触感柔软。因此，本文所公开的热稳定果胶分解酶在制备和生产日本纸的方法中将是有用的。
E.造纸
造纸工业正在开始使用酶来解决其生产过程中面临的问题。造纸是基本上连续的过滤过程，其中纤维、纤维片段(细屑)和无机填料粒子，比如粘土的稀悬浮液被过滤。在整个过程中，多糖类是非常棘手的物质。在这些多糖中重要的是果胶或聚半乳糖醛酸。聚半乳糖醛酸复合阳离子聚合物的能力(阳离子需求量)较大程度上取决于其多聚化的程度，半乳糖醛酸的单体、二聚体和三体不会产生可测量的阳离子需求量，但六聚体和长链具有高的阳离子需求量。果胶酶可解聚半乳糖醛酸的聚合物，并随之降低果胶溶液和来自过氧化物漂白的滤出液的阳离子需求量。因此，本文所公开的热稳定性果胶分解酶组合物在制备和生产纸浆和纸张的方法中将是有用的。
例如，酶组合物可与液体纸浆混合物相组合。根据所用的纸浆过程(例如，化学制浆对比机械制浆)、所用的纸浆物质的类型和需要的最终产物的不同，本领域技术人员将在过程的适当的点添加酶混合物，且本领域技术人员将理解，或可凭经验容易地确定添加多少量的酶混合物，以及将酶混合物与纸浆一起孵育多长时间。
F.油提取
来自菜籽(加拿大油菜)、椰子种子、向日葵种子、棕榈、种仁和橄榄的油通常通过利用有机溶剂来萃取。最常用的溶剂是己烷，其是潜在的致癌物质。细胞壁降解酶，包括果胶酶，可用于在含水过程中通过液化含油作物的结构细胞壁成分来萃取植物油。因此，本文所公开的热稳定果胶分解酶组合物在从多种植物来源中提取油的方法中将是有用的。
G.咖啡和茶发酵
在咖啡和茶发酵中果胶酶起重要的作用。利用果胶分解微生物对咖啡进行发酵以从咖啡豆中去除粘液皮。有时添加果胶酶以去除占果胶物质的四分之三的豆的果肉层。
真菌果胶酶也用于茶的生产。尽管通常对酶剂量进行严格调整以避免损害茶叶，酶处理仍加速了茶发酵。果胶酶的添加也改良了由破坏茶果胶得到的茶粉的泡沫形成性质。
因此，本文所公开的热稳定果胶分解酶组合物在发酵咖啡和茶的方法中将是有用的。
VII.试剂盒
本文所提供的组合物和处理方法可用于多种应用。例如，在一个实施方案中，组合物可以在试剂盒中提供。所述试剂盒包括，例如，i)果胶分解酶；ii)包括磷灰石部分的多个纳米颗粒；和iii)用于将所述酶与所述纳米颗粒组合以形成酶组合物的说明书。在一些实施方案中，所述试剂盒可进一步包括用于将所述酶组合物应用于含果胶物质的说明书。在一些实施方案中，果胶分解酶包括果胶酸裂合酶。在一些实施方案中，磷灰石部分包括羟磷灰石。
实施例
本发明的实施例描述了从芽孢杆菌中纯化示例性的果胶分解酶、果胶酸裂合酶，纳米颗粒物质羟磷灰石的形成和增强的果胶酸裂合酶组合物的生产。实施例还提供了增强的酶组合物的表征，包括，酶热稳定性、半衰期和活性的评估。本领域技术人员将理解，虽然以下示出了果胶酸裂合酶，其他具有相当作用的果胶分解酶也是可用的。
实施例1.从短小芽孢杆菌中纯化果胶酸裂合酶
通过三个连续的过程从短小芽孢杆菌中纯化细菌果胶酸裂合酶：(1)硫酸铵分级分离(0-30％；30％-80％)(2)离子交换层析(CMSepharose)；和(3)凝胶过滤层析(Sephadex G-75)(Basu，等人，(2008)Technology99：8088-8094)。简言之，将分离的果胶分解细菌菌株的过夜培养物接种到含于1000ml锥形培养瓶的200ml YP培养基中(NaCl0.5％，酵母提取物1.0％和果胶0.75％；pH7.0)。在30℃下在旋转震荡器(150rpm)上孵育培养瓶24小时。
从200ml YP培养肉汤(生长条件如以上所述)中纯化果胶酸裂合酶。利用硫酸铵(0-30％；30-80％)分级分离无细胞的上清液，并将含有活性的级分用于以后的研究。将沉淀物溶于最低量的Tris-HCl缓冲液(25mM，pH8.5)并针对相同的缓冲液进行透析。然后，将5ml的透析过的样品上样到CM-Sepharose柱上(5ml柱床体积)，利用Tris-HCl缓冲液(25mM，pH8.5)平衡。利用含(0-1M)NaCl浓度的Tris-HCl缓冲液洗涤柱以洗脱蛋白。将收集物用于1ml级分。通过Lowry等人，(1951)J.Biol.Chem.193，265-275的方法测量每个级分的蛋白含量，通过以下所描述的方法测定果胶酸裂合酶活性。利用Macrosep10K单元浓缩显示果胶酸裂合酶活性的级分，并将所述级分上样到填有Sephadex G-75的玻璃柱上(柱床体积30ml)并如以上所述利用Tris-HCl缓冲液来平衡。利用Tris-HCl缓冲液(25mM，pH8.5)进行蛋白的洗脱。如以上所描述进行级分的收集和蛋白与酶活性的测定。利用Bio-Rad电泳装置通过Laemmli，等人，(1970)Nature227，680-685的方法进行12％SDS-PAGE。通过银染色法对蛋白标志物和蛋白条带染色(Swain等人，(1994)Electrophoresis16，948-951.)。
实施例2.果胶酸裂合酶的活性测定
通过硫代巴比妥酸(TBA)测定确定果胶酸裂合酶活性，该测定测量550nm处的吸光度(Roberts等人，(1986)J.Bacterial.167，279-284)。将上清液的适宜稀释物(1ml)添加到5ml的PGA(聚半乳糖醛酸，钠盐)溶液(0.75％，w/v)。利用含1mM CaCl2的Tris-HCl缓冲液(25mM，pH8.5)使测定体积达到10.0ml，并在55℃下孵育2小时。然后添加约0.6ml的硫酸锌(9.0％，w/v)和0.6ml氢氧化钠(0.5M)。将样品离心(3000g，10分钟)并将5.0ml的澄清上清液添加到硫代巴比妥酸(3.0ml，0.04M)和HCl(1.5ml，0.1M)的混合物中。在沸水浴中加热混合物30分钟，在550nm处测量有颜色的溶液的吸光度，与含有与实验比色皿所含的试剂相同的试剂的对照比色皿相比较，其中对于所述对照比色皿，在添加酶和底物之前添加硫酸锌和氢氧化钠。一单位的活性定义为在测定的条件下导致吸光度改变0.01的酶的量。
实施例3.羟磷灰石纳米颗粒的合成
根据Mir等人，(2010)J.Mater.Sci.21：2365-2369.中描述的方法制备羟磷灰石(HPA)纳米颗粒。简言之，使用聚(乙烯)醇稳定的含水铁磁流体(PVA-ff)作为钙羟磷灰石(HPA)的结晶的纳米模板。对于HPA的相同起始组分利用20、40、60和80ml的PVA-ff合成四组PVA-ff-HPA纳米复合物。
a.材料
所用的所有化学品均是分析级的。氯化铁(FeCl3·6H2O)、氯化亚铁购自Rankem，聚(乙烯)醇(摩尔重量44,000)(PVA)来自Qualigenes，磷酸氢二铵和氨溶液(30％)来自Merck，和硝酸钙Ca(NO3)2·4H2O来自Himedia。
b.实验程序
为制备PVA-ff-HAp纳米复合物，使用了如下的湿法共沉淀方法：
10Ca(NO3)24H2O+6(NH4)2HPO4+8NH4OH→Ca10(PO4)6(OH)2+46H2O+20NH4NO3
制备了含0.5％PVA的碱性硝酸钙溶液，向其添加不同体积的含水PVA-ff(分别为20、40、60、80ml)。孵育24小时后，添加碱性磷酸氢二铵以沉淀HPA。使浆液的pH维持在10.5。然后将样品进行醇化，持续7天的时间，之后洗涤浆液直至pH7并用烘炉干燥。随后获得的粉末在结构上和磁性上与Mir等人，2010中所描述的相似。
利用透射电镜(TEM)(CM200CXPhilips在160kV下)确定颗粒的大小和形态。纳米颗粒(HPA晶体)具有约20nm的平均尺寸。
实施例4.未处理的果胶酸裂合酶的表征
a.未处理的果胶裂解酶的最佳温度和pH
为在一个测验条件下测量果胶酸裂合酶的最佳温度，将酶在范围从30℃到100℃的不同温度下保持10分钟。10分钟之后，如先前所描述的通过TBA测定确定酶活性。
为确定最佳pH，将酶的样品置于具有范围从3-10的pH的缓冲液中。确定酶活性以测量最佳pH。
发现果胶酸裂合酶在75℃时具有最佳温度。发现该酶最佳pH为8.5。酶活性的温度和pH依赖性示于图6(A)-6(B)中。
b.二价离子对果胶酸裂合酶活性的影响
将作为氯化物盐的金属离子(Ca2+、Mn2+、Mg2+、Co2+、Cd2+、Ni2+和Zn2+)添加到底物-缓冲液混合物(PGA0.75％；25mM Tris-HCl，pH8.5)以得到1mM的终浓度，如先前所描述的测量果胶酸裂合酶的活性。在金属离子抑制研究中每个测定系统包含93U的果胶酸裂合酶活性。
果胶酸裂合酶的活性被钙和镁所诱导，且被锌、镍和EDTA所抑制，图7。
实施例5.经处理的果胶酸裂合酶的表征
将从短小芽孢杆菌中纯化的果胶酸裂合酶(0.16mg/ml)与25mMTrisCl缓冲液中的聚半乳糖醛酸(pH8.5)在55℃下孵育2小时。在以下四种条件下(用于不同组的测验样品)孵育单独的样品：
(1)在不同浓度的HPA纳米颗粒存在下；
(2)在不同浓度的Ca2+存在下；
(3)在HPA纳米颗粒(8.8μg/ml)和Ca2+(40μg/ml)存在下；
(4)HPA纳米颗粒或Ca2+均不存在。
随后，通过利用以上所描述的硫代巴比妥酸(TBA)方法测量每组的果胶酸裂合酶活性。为评估温度和时间依赖性，孵育温度和时间各不相同。
a.HPA纳米颗粒和Ca 2+ 补充增强了果胶酸裂合酶的活性
在存在或不存在Ca2+的情况下，在将纯化的果胶酸裂合酶和其底物以及不同浓度的羟磷灰石纳米颗粒孵育之后，利用先前描述的TBA方法测量果胶酸裂合酶活性(550nm处的吸光度；酶-底物复合物果胶酸裂合酶+PGA和TBA产生颜色)。纳米颗粒处理的果胶酸裂合酶(甚至在缓冲液中不存在Ca2+离子时)显示了比仅补充Ca2+(无纳米颗粒)的酶显著更高的活性。并且，仅纳米颗粒处理过的酶显示出比补充Ca2+(在缓冲液中)的酶和纳米颗粒处理过的酶更高的活性。活性关系可表示为：
仅HPA＞HPA+Ca2+ (1)
仅HPA＞Ca2+ (2)
图8显示了五种不同浓度的(2.2μg/ml，4.4μg/ml，6.6μg/ml，8.8μg/ml和11μg/ml)HPA纳米颗粒对果胶酸裂合酶活性的影响。发现在50℃至90℃的温度范围中，纳米颗粒的最佳浓度为8.8μg/ml。图9显示了8种不同浓度的钙对未处理的果胶酸裂合酶的影响(0.1mM，0.25mM，0.5mM，0.75mM，1mM，2mM，5mM和10mM)。
b.纳米颗粒补充物促进了果胶酸裂合酶活性的保持
通过时间动力学检查了在存在纳米颗粒(8.8μg/ml)或不存在纳米颗粒的情况下，酶活性随时间的改变(若有的话)。在55℃下与底物孵育两小时之后，通过TBA方法测量果胶酸裂合酶(0.16mg/ml)活性，以1小时为间隔，持续5小时。
据观察，无纳米颗粒处理的酶在2小时处显示出最佳活性，其后活性随时间降低。然而，纳米颗粒处理的酶保持活性持续5小时(研究终止时间)。并且，发现活性随时间而增高(图1)。
此处可注意的是实验条件是相同的(除NP的存在和不存在之外)。还应进一步注意的是Ca2+在每种样品中均不存在；在测定系统中使用了新鲜的milliQ水而不添加任何额外的钙盐补充。
c.纳米颗粒补充改良了果胶酸裂合酶的温度耐受性并增强了酶的活 性
在存在和不存在羟磷灰石纳米颗粒的情况下评价了果胶酸裂合酶的温度依赖性。在测量酶活性之前，在不同的温度下孵育样品2小时。使用了0.16mg/ml的酶和8.8μg/ml的HPA纳米颗粒。
发现在90℃下纳米颗粒处理的酶表现出的活性超过未处理的酶活性的四倍。
还发现该增强不仅是短暂效应。在90℃下孵育2小时的纳米颗粒处理的酶保留了高于在55℃下孵育2小时的未处理的酶的活性(图2)。
d.处理的和未处理的果胶酸裂合酶的底物特异性
果胶酸裂合酶可催化果胶的降解。聚半乳糖醛酸酶(PG)一般水解果胶酸，而果胶酸裂合酶(PL)对于甲基酯化的底物是特异性的，其通过对果胶物质的β-消除裂解α-D-(1，4)糖苷键。果胶酸裂合酶相似地作用于合成的底物聚半乳糖醛酸(PGA)。
为测量酶活性(利用PGA作为底物)在高温下的保持，将处理的果胶酸裂合酶(0.16mg/ml酶和8.8μg/ml HPA纳米颗粒)在90℃下孵育1-5小时。孵育之后，如以上所描述的确定酶活性。相对于进行相似的孵育的未处理的酶的值来表示结果。利用0.015％苹果果胶(Sigma-Aldrich)作为底物进行相同的组的实验。
当利用果胶作为底物时，在2小时孵育后，经处理的果胶裂合酶的活性比未处理的果胶裂合酶的活性高5倍。而在4小时孵育后经处理的果胶酸裂合酶活性比未处理的果胶酸裂合酶高11倍。(表1)。5小时后，与4小时后的活性相比较，处理的果胶酸裂合酶活性降低了3倍。这显示利用合成底物和天然底物时，在高温下处理的果胶酸裂合酶显示了增强的活性。
表1：经处理的果胶酸裂合酶(NP-PL)和未处理的果胶酸裂合酶(PL)(底物果胶)在90℃时对活性的保持
e.原子吸收光谱(AAS)数据：
通过原子吸收光谱测量羟磷灰石纳米颗粒的Ca2+浓度和1mMCaCl2的Ca2+浓度，以比较在受热情况下活化果胶酸裂合酶并使其稳定所需要的最佳Ca。
结果提供于表8中。发现1mM CaCl2含有的Ca2+比羟磷灰石纳米颗粒高234.3％。
表2：通过AAS测量的Ca2+浓度
| 参数 | 羟磷灰石NP | 1mM CaCl2 |
| Ca2+浓度(μg/μl) | 0.44±0.013 | 1.47±0.015 |
实施例6.处理的和未处理的果胶酸裂合酶的动力学表征
工业程序中的酶反应通常在高温下进行以改良产率和/或保持无菌性。因此，更为有用的或有价值的酶通常对于较高的温度是耐受的(或在较高温度下是稳定的)。检查了动力学参数以研究纯化的HPA处理的和未处理的果胶酸裂合酶对温度的耐受性。对于酶动力学的研究，将不含外部钙离子——仅含HPA纳米颗粒的缓冲液(25mMTris-HCl，pH8.5)添加到每个测定系统。对于每个测定，果胶酸裂合酶浓度为0.16mg/ml，并使用了8.8μg/ml的HPA纳米颗粒。
a.经处理的和未处理的果胶酸裂合酶的Km和Vmax的确定
根据Liao，等人，(1997)J.Appl.Microbiol.83，10-16.的方法计算HPA处理的和未处理的纯化的果胶酸裂合酶的动力学参数，Km、Vmax和活化能(Ea)。使用的底物(PGA)浓度从0.015％到1.25％以确定Km和Vmax。根据Basu等人(2008)，从DKS1中纯化的果胶酸裂合酶的最佳温度为75℃；因此，在该温度下进行了关于Km和Vmax的一组实验。还在90℃下进行了各自的组的实验。结果显示了在90℃下处理的果胶酸裂合酶(NP-果胶酸裂合酶)的高活性。
在75℃和90℃时，与未处理的果胶酸裂合酶相比较，经处理的果胶酸裂合酶的Km值降低了而Vmax值增高了(表3)。因此，与未处理的酶相比较，纳米颗粒预处理增强了酶-底物亲和力且降低了活化能。在75℃时，相比未处理的果胶酸裂合酶系统，经处理的果胶酸裂合酶的Km值降低了63％，而Vmax增高了255.1％。同样在90℃下，相比未处理的果胶酸裂合酶系统，经处理的果胶酸裂合酶显示了80％降低的Km值且716.4％增高的Vmax值。结果总结于表3中。
b.经处理的和未处理的果胶酸裂合酶的活化能(E a )的确定
在50-90℃的温度范围内评估了经处理的和未处理的果胶酸裂合酶的活化能(Ea)。用于该计算的PGA浓度为0.75％(Basu等人，2008)。从阿伦纽斯曲线中计算活化能(Ea)(图3和4)。结果提供于表3中。
发现经处理的果胶酸裂合酶的活化能(Ea)小于未处理的果胶酸裂合酶的活化能。从阿伦纽斯曲线中，未处理的果胶酸裂合酶显示了-22.9kJ/摩尔的Ea值。参见表3和图3和4。
表3：计算的动力学参数的结果
c.经处理的和未处理的果胶酸裂合酶的耐热性和失活动力学
关于动力学对经处理的和未处理的纯化的果胶酸裂合酶的热失活进行检查。利用8.8μg/ml浓度的HPA纳米颗粒处理0.16mg/ml的果胶酸裂合酶。在40℃和90℃之间的温度下(313-363K)孵育未处理的果胶酸裂合酶和经处理的果胶酸裂合酶，持续达10分钟。失活参数包括半衰期(t1/2)、衰减常数(k)、去活化的能量(Ed)、焓(ΔH)、熵(ΔS)和自由能变化(ΔG)根据Ortega等人(2004)Int.J.Food Sci.Technol.39，631-639而获得。从热失活(热去活化)的阿伦纽斯曲线中计算经处理的和未处理的果胶酸裂合酶的去活化的能量，图5(a)-5(b)。用于该目的的PGA浓度为0.75％。利用纳米颗粒(“NP”)处理的和未处理的不同的果胶酸裂合酶的动力学参数的差异的结果显示于下表4-5和图5(a)-5(b)中。
为在HPA纳米颗粒存在下验证果胶酸裂合酶的热耐受性，将经处理的和未处理的酶在不同的温度下(30℃至90℃)预孵育10分钟。预孵育之后，通过如先前所描述的TBA测定确定酶活性。关于经处理的和未处理的酶的残余活性相对时间(50℃-90℃之间)的半对数曲线显示了其关系是线性的(数据未示出)。曲线表明未处理的果胶酸裂合酶是热失活的，符合一级动力学，但经处理的酶是热活化的，符合一级动力学。根据曲线计算了半衰期(t1/2)值(表4和5)。
表4：在50℃-90℃中未处理的果胶酸裂合酶的动力学参数的差异
表5：在50℃-90℃中处理的果胶酸裂合酶的动力学参数的差异
根据表4和5中的结果，显示出在高温90℃下，与未处理的酶相比较，HPA纳米颗粒的添加增高了果胶酸裂合酶的半衰期并提高了去活化的能量(Ed)。
与未处理的酶相比较，HPA纳米颗粒接触增强了酶-底物特异性，并降低了活化能。此外，在渐增的温度下，纳米颗粒/HPA补充物增加了果胶酸裂合酶的半衰期并降低了果胶酸裂合酶的衰变常数。
等效方式
虽然已经示出和描述了某些实施方案，应理解的是根据本领域一般技术可在其中作出改变和更改而不悖离其在如下权利要求中所定义的较宽泛的方面中的技术。
本发明并不限于本申请中所描述的特定实施方案。对本领域技术人员明显的是，可作出许多更改和变化而不悖离其精神和范围。除了本文所列举的那些，公开内容范围内的来自先前的描述中的功能上等效的方法和装置对于本领域技术人员将是明显的。这样的更改和变化意在落入所附权利要求的范围中。本公开内容仅通过所附权利要求一级所述权利要求所保护的全部范围的等效方式来限定。应理解本公开内容不限于特定的方法、试剂、化合物、组合物或生物系统，这些是可以不同的。还应理解的是，本文所用的术语仅用于描述特定的实施方案的目的，并不意在被限制。
此外，本公开内容中以马库什组(Markush group)描述的特征或方面，本领域技术人员将意识到，公开内容还以马库什组的任何单独的成员或成员的亚组来描述。
如将被本领域技术人员所理解的，为了任何和全部目的，尤其为提供书面说明书，本文所公开的所有范围还包括所有可能的子范围和其子范围的组合。当充分描述并使相同的范围被分为至少相等的两份、三份、四份、五份、十份等时，任何所列的范围可被容易地识别。作为非限制性的例子，本文所描述每个范围可被容易地分为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如将被本领域技术人员所理解的是，诸如“达到”、“至少”、“大于”、“小于”和类似的所有语言包括所引用的数目，并指随后可如以上所讨论的被分为子范围的范围。最后，如将本领域技术人员所理解的是，范围包括每个单独的成员。因此，例如，具有1-3个原子的基团指具有1个、2个或3个原子的基团。相似地，具有1-5个原子的基团指具有1个、2个、3个、4个或5个原子的基团，以及等等相似情况。
虽然本文已经公开了多个方面和实施方案，其他方面和实施方案对于本领域技术人员而言将是明显的。本文所公开的不同的方面和实施方案用于示例的目的且并不意在限制，其真正的精神和范围通过以下权利要求来表明。
Claims (33)
1.一种组合物，包括：
至少一种纳米颗粒，所述纳米颗粒包括磷灰石部分；和
至少一种与所述纳米颗粒、所述磷灰石部分、或以上二者相接触的酶，其中所述酶包括果胶分解酶。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述磷灰石包括羟磷灰石。
3.如权利要求1-2中任一项所述的组合物，其中所述纳米颗粒具有约50nm至约200nm的直径。
4.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述酶包括果胶酸裂合酶、果胶裂解酶、聚半乳糖醛酸酶、聚半乳糖醛酸裂解酶、果胶酯酶、果胶酶、内切型果胶酸裂合酶，或其组合。
5.如权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述酶是果胶酸裂合酶、果胶裂解酶、聚半乳糖醛酸酶、聚半乳糖醛酸裂解酶、果胶酯酶、果胶酶、内切型果胶酸裂合酶，或其组合。
6.如权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述酶从以下中的一种或多种中纯化的：芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)、曲霉菌属物种(Aspergillus sp.)、青霉菌属物种(Penicillium sp.)、核盘菌属物种(Sclerotinia sp.)、韧革菌属物种(Stereum sp.)、欧文氏菌属物种(Erwinia sp.)、无枝酸菌属物种(Amycolata sp.)、耶尔森氏菌属物种(Yersinia sp.)、镰刀菌属物种(Fusarium sp.)、假单胞菌属物种(Pseudomonas sp.)、链霉菌属物种(Streptomyces sp.)、念珠菌属物种(Candida sp.)、红酵母属物种(Rhodotorula sp.)、和短梗霉属物种(Aureobasidium sp.)。
7.如权利要求1-6中任一项所述的组合物，其中所述酶包括重组的酶。
8.如权利要求1-7中任一项所述的组合物，还包括至少一种二价阳离子。
9.如权利要求7所述的组合物，其中所述二价阳离子包括钙。
10.如权利要求1-9中任一项所述的组合物，其中，与未与所述纳米颗粒、所述磷灰石部分、或以上二者相接触的相同的果胶分解酶相比较，所述组合物中的所述酶具有增高的活性。
11.如权利要求1-10中任一项所述的组合物，其中，与未与所述纳米颗粒、所述磷灰石部分、或以上二者相接触的相同的果胶分解酶相比较，所述组合物中的所述酶是更热稳定的。
12.如权利要求1-11中任一项所述的组合物，其中，与未与所述纳米颗粒、所述磷灰石部分、或以上二者相接触的相同的果胶分解酶相比较，所述组合物中的所述酶在较高温度下具有增高的活性。
13.如权利要求1-12中任一项所述的组合物，其中，与未与所述纳米颗粒、所述磷灰石部分、或以上二者相接触的相同的果胶分解酶相比较，所述组合物中的所述酶在较高温度下具有增高的活性且是更热稳定的。
14.如权利要求1-13中任一项所述的组合物，其中，与未与所述纳米颗粒、所述磷灰石部分、或以上二者相接触的相同的果胶分解酶相比较，所述组合物中的所述酶具有较长的半衰期。
15.一种制备热稳定酶组合物的方法，所述方法包括：
将以下组合以形成混合物：
(a)多个纳米颗粒，其中所述纳米颗粒中的至少一些包括磷灰石部分；和
(b)至少一种酶；
所述组合在酶与纳米颗粒、磷灰石部分、或以上二者相接触的条件下进行。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述磷灰石包括羟磷灰石。
17.如权利要求15-16中任一项所述的方法，其中所述酶是果胶酸裂合酶。
18.如权利要求15-17中任一项所述的方法，还包括将一种或多种二价阳离子组合到所述混合物中。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述一种或多种二价阳离子选自由Ca2+、Mg2+、Mn2+、Co2+和Cd2+组成的组。
20.如权利要求15-19中任一项所述的方法，还包括孵育所述混合物。
21.如权利要求15-20中任一项所述的方法，其中在约55℃的温度下孵育所述混合物。
22.如权利要求15-21中任一项所述的方法，其中所述孵育的进行持续约2小时至约5小时的时间。
23.如权利要求15-22中任一项所述的方法，其中所述孵育在约8.5的pH下进行。
24.如权利要求15-23中任一项所述的方法，还包括在所述组合前纯化所述酶。
25.一种处理含果胶物质的方法，所述方法包括：
将所述物质与包括以下的组合物相接触：
(a)至少一种纳米颗粒，所述纳米颗粒包括磷灰石部分；和
(b)果胶分解酶，所述果胶分解酶与所述纳米颗粒、所述磷灰石部分、或以上二者相接触，
所述与组合物的接触持续一定时间且在物质中的果胶的至少一些被酶裂解的条件下进行。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述含果胶物质包括纺织物、植物、清洁剂、生物复合物、废水、纸、油、动物饲料、食物、饮料或其组合。
27.如权利要求25-26中任一项所述的方法，其中所述接触在高于或等于约55℃的温度下进行。
28.如权利要求25-27中任一项所述的方法，其中所述含果胶物质包括食物，和其中所述接触在高于或等于约90℃的温度下进行。
29.如权利要求25-28中任一项所述的方法，其中所述组合物还包括至少一种二价阳离子。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述纳米颗粒、所述磷灰石部分、或以上二者经由至少一种二价阳离子与所述果胶分解酶相接触。
31.一种试剂盒，包括：
(a)果胶分解酶；
(b)多个纳米颗粒，所述纳米颗粒包括磷灰石部分；和
(c)说明书，所述说明书用于将所述酶和所述纳米颗粒相组合以形成酶组合物。
32.如权利要求33所述的试剂盒，还包括用于将所述酶组合物应用于含果胶物质的说明书。
33.如权利要求31-32中任一项所述的试剂盒，其中所述磷灰石部分包括羟磷灰石。
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