CN104046694A - 一种鉴定或辅助鉴定待测拟南芥是否为雄性不育株系的方法 - Google Patents

一种鉴定或辅助鉴定待测拟南芥是否为雄性不育株系的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鉴定或辅助鉴定待测拟南芥是否为雄性不育株系的方法。本发明提供了一种鉴定或辅助鉴定待测拟南芥是否为雄性不育株系的方法，包括如下步骤：检测待测拟南芥中ACT8基因核苷酸序列第982位核苷酸，若第982位核苷酸为G，则待测拟南芥为或候选为雄性可育株系，若第982位核苷酸为A，则待测拟南芥为或候选为雄性不育株系。本发明的实验证明，本发明发现了ACT8基因单点突变体fiz1的纯合株系，可用ACT8基因第982位核苷酸的多态性确定待测拟南芥是否雄性可育。

Description

一种鉴定或辅助鉴定待测拟南芥是否为雄性不育株系的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种鉴定或辅助鉴定待测拟南芥是否为雄性不育株系的方法。
背景技术
植物雄性不育是指植物在有性繁殖过程中，由于受到遗传或环境因素的影响造成雌性器官正常而雄性器官不正常，不能产生正常功能的花粉的现象。植物雄性不育是利用植物杂种优势的有效途径，在生产实践上具有重要的利用价值。如利用雄性不育的品种为母本，选配好与特定父本品种的杂交组合，就可以免除人工去雄手续，节约人力，降低种子成本，并且可以保证种子的纯度，提高杂交种子的生产效率。目前人们已经在许多作物中利用雄性不育性进行杂交种子的生产。
植物雄性不育是受核不育基因控制，或者受核不育基因和细胞质不育基因相互作用共同控制的。根据对雄性不育的相关基因和分子机理的研究，可将雄性不育分为以下几类：减数分裂异常导致的雄性不育、胼胝体代谢异常导致的雄性不育、绒粘层发育异常导致的雄性不育、花粉壁发育异常导致的雄性不育、花药开裂异常导致的雄性不育以及其他类型的雄性不育。
减数分裂是真核生物进行有性生殖形成生殖细胞所经历的一个高度保守的细胞分裂过程。亲本生殖细胞染色体只复制一次，而细胞连续分裂两次，使得最终形成的配子中染色体数目减半。减数分裂是一个高度复杂调控的过程，在此过程中，一系列基因精确而有序的表达，确保减数分裂过程顺利完成。然而任一基因发生突变都有可能影响减数分裂过程中染色体的行为和育性。植物中大多数雄性不育都发生在减数分裂的某个时期(Bhatia et al.2001)。
微丝，或肌动蛋白丝，是组成真核生物细胞骨架的最纤细的丝状结构，在进化中高度保守。它是由单个肌动蛋白单体聚合而成直径为7nm的线状结构，具有高度灵活性，能够作用于细胞的胞质分裂和变形运动，改变细胞形状，响应机械应力等。在减数分裂过程中，微丝和微管一起组装成减数分裂特有的细胞骨架装配，确保核分裂和胞质分裂的精确完成。肌动蛋白是一种单体多肽链的球状蛋白质，它广泛的存在于真核细胞中，一般由374-377个氨基酸组成。在拟南芥中，已经有10个ACTIN基因被鉴定出来，但到目前为止，尚未有人报道拟南芥中肌动蛋白的基因在减数分裂中的生物学功能。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测拟南芥是否为雄性不育株系的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：检测待测拟南芥中ACT8基因核苷酸序列第982位核苷酸，若第982位核苷酸为G，则待测拟南芥为或候选为雄性可育株系，若第982位核苷酸为A，则待测拟南芥为或候选为雄性不育株系。
上述方法中，所述检测待测拟南芥中ACT8基因核苷酸序列的方法包括如下步骤：以所述待测拟南芥的基因组作为模板，用由序列5所示的单链DNA分子和序列表中序列6所示的单链DNA分子组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，测序PCR扩增产物。
上述方法中，待测拟南芥为野生型拟南芥和/或与野生型拟南芥相比仅在ACT8基因核苷酸序列第982位核苷酸发生由G到A的突变的拟南芥。
本发明另一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测拟南芥是否为雄性不育株系的试剂盒。
本发明提供的试剂盒，包括比对卡，所述比对卡上记载ACT8基因野生型序列和ACT8基因突变型序列；
所述ACT8基因野生型序列为序列表中序列3；
所述ACT8基因突变型序列为序列表中序列1。
本发明提供的试剂盒，所述试剂盒还包括引物对，所述引物对为由序列5所示的单链DNA分子和序列表中序列6所示的单链DNA分子组成的引物对。
上述的试剂盒在鉴定或辅助鉴定待测拟南芥是否为雄性不育株系中的应用也是本发明保护的范围。
本发明第三个目的是提供一种蛋白。
本发明提供的蛋白，是如下(a)或(b)：
(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由序列2衍生的蛋白质。
编码上述蛋白的DNA分子也是本发明保护的范围。
上述DNA分子是如下(1)-(3)中任一种的DNA分子：
(1)编码区为序列表中的序列1所示的DNA分子；
(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码且具有相同功能的蛋白的DNA分子；
(3)与(1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码具有相同功能蛋白的DNA分子。
上述严格条件为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
含有上述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。
扩增上述DNA分子全长或其任意片段的引物对也是本发明保护的范围。
上述蛋白、上述DNA分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在鉴定或辅助鉴定待测拟南芥是否为雄性不育株系中的应用也是本发明保护的范围。
本发明第四个目的是提供一种培育雄性不育拟南芥的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：使野生型拟南芥的基因组中ACT8基因的第982位核苷酸由G变为A，基因组其它序列不变，获得雄性不育拟南芥。
本发明的实验证明，本发明发现了ACT8基因单点突变体fizzy1(以下简称fiz1)的纯合株系，可用直接测序法检验ACT8基因第982位核苷酸的多态性以确定待测拟南芥是否雄性可育，与现有技术相比，该方法具有高效率、高灵敏度、高准确性等特点，它能够直观地得到突变碱基的类型及其准确位置，并且大大降低了实验成本。
附图说明
图1为野生型和突变体中ACT8基因的测序结果
图2为野生型和突变体的株高比较
图3为野生型和突变体的角果比较
图4为野生型和突变体的花粉扫描电镜图像
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、ACT8基因与雄性不育之前关系的研究
1、拟南芥的培养
将营养土和蛭石以1:1的体积比混合，高压蒸汽灭菌40min，装入盆中后用自来水浸透。经过4℃春化处理1天后野生型拟南芥和fiz1突变体(记载在如下文献中：Defects in Dynamics and Functions of Actin Filament in ArabidopsisCaused by the Dominant-Negative Actin fiz1-Induced Fragmentation of Actin Filament，Plant Cell Physiol,51(2):333-338(2010)；公众可从中国科学院植物研究所获得)的种子，用牙签均匀地点在营养土的表面，并覆盖保鲜膜5d。拟南芥的培养条件为22℃，16h光照，8h黑暗。
2、拟南芥ACT8基因的鉴定
分别提取野生型拟南芥和fiz1突变体的基因组DNA，以如下引物进行PCR扩增。
正向引物：ACT8-f5’-ATGGCCGATGCTGATGACATTCAAC-3’(序列5)
反向引物：ACT8-r5’-TTAGAAGCATTTTCTGTGGACAATG-3’(序列6)
得到1409bp的PCR产物(野生型)和1409bp的PCR产物(fiz1)。
测序PCR产物(野生型)，其核苷酸序列为序列表中序列3，编码序列表中序列4所示的蛋白；
PCR产物(fiz1)，其核苷酸序列为序列表中序列1，编码序列表中序列2所示的蛋白。
测序结果如图1所示，与野生型相比，fiz1突变体中ACT8基因核苷酸序列为将序列3自5’末端第982位核苷酸由鸟嘌呤G突变成腺嘌呤A，命名为ACT8m基因，编码的蛋白为ACT8m。
上述可以看出，野生型拟南芥和fiz1突变体的基因组中，只有ACT8基因核苷酸序列的第982位核苷酸有差别，猜测会带来表型编号，因此下面对野生型和突变体进行表型观察。
3、形态学观察
1)地上部生长发育比较
对突变体fiz1和野生型拟南芥进行株型观察，结果如图2所示，其中左侧为野生型，右侧为突变体，可以看出，在营养生长阶段fiz1突变体表现在地上部的卷曲和节点的结节，野生型生长直立，茎部无卷曲
2)角果比较
对突变体fiz1和野生型拟南芥(WT)生殖生长阶段角果大小和角果内的种子数目进行比较，结果如图3所示，A为角果大小，B为角果中种子数目，可以看出，fiz1突变体的角果明显小于野生型的角果，突变体中每个角果的种子数目也少于野生型。
由于突变体的每个角果中的结实量均少于野生型，因此推测fiz1突变体中配子发育可能存在异常。
3)花粉观测
(1)固定将突变体fiz1和野生型拟南芥花粉在FAA固定液中固定24h；固定后的样品直接转入95％乙醇中过夜；
(2)脱水将固定好的花粉进行梯度酒精脱水，95％酒精→100％酒精，每级20min；
(3)乙酸异戊酯置换将材料经75％无水乙醇+25％乙酸异戊酯→50％无水乙醇+50％乙酸异戊酯→25％无水乙醇+75％乙酸异戊酯→100％乙酸异戊酯系列脱水，每级20min；
(4)干燥二氧化碳临界点进行干燥；
(5)粘台干燥的材料在解剖镜下，用双面胶黏在金属台上；
(6)镀膜在离子溅射仪上对金属台进行喷金，镀膜；
(7)扫描电镜下进行观察，拍照。
结果如图4所示，A为花粉粒整体图，B为单个花粉粒放大图；可以看出，突变体的花粉粒表现出整体性的不正常，选取单个花粉粒进行放大后观察，与野生型相比，突变体的花粉粒表现出了干瘪的现象，说明fiz1突变体的雄配子发育是不正常的。
将fiz1突变体培育，为雄性不育型。
可以看出，fiz1突变体与野生型拟南芥相比，仅为ACT8基因核苷酸序列第982位核苷酸的区别，可用其来鉴定待测拟南芥是否为雄性不育；
检测待测拟南芥的ACT8基因，若ACT8基因核苷酸序列第982位核苷酸为A，则该基因为突变型基因，待测拟南芥为或候选为雄性不育；
若ACT8基因核苷酸序列第982位核苷酸为G，则该基因为野生型基因，对应的植株为待测拟南芥为或候选为雄性可育。
实施例2、ACT8m基因在鉴定待测拟南芥是否为雄性不育中的应用
将10株待测拟南芥的幼苗提取基因组DNA，用如下正向引物和反向引物进行PCR扩增，得到1409bp的PCR产物ACT8基因。
正向引物：ACT8-f5’-ATGGCCGATGCTGATGACATTCAAC-3’(序列5)
反向引物：ACT8-r5’-TTAGAAGCATTTTCTGTGGACAATG-3’(序列6)
将1409bp的PCR产物进行测序.
结果编号为1-3的待测拟南芥的ACT8基因第982位核苷酸为A，其为雄性不育型；
编号为4-10的待测拟南芥的ACT8基因第982位核苷酸为G，其为雄性可育型。
将上述编号为1-3的待测拟南芥用活体测定法—通过统计自然结实率来判断，为雄性不育，将上述编号为4-10的待测拟南芥用活体测定法—通过统计自然结实率判断，为雄性可育。
说明本发明的方法正确。

Claims (10)

1.一种鉴定或辅助鉴定待测拟南芥是否为雄性不育株系的方法，包括如下步骤：检测待测拟南芥中ACT8基因核苷酸序列第982位核苷酸，若第982位核苷酸为G，则待测拟南芥为或候选为雄性可育株系，若第982位核苷酸为A，则待测拟南芥为或候选为雄性不育株系。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述检测待测拟南芥中ACT8基因核苷酸序列的方法包括如下步骤：以所述待测拟南芥的基因组作为模板，用由序列5所示的单链DNA分子和序列表中序列6所示的单链DNA分子组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，测序PCR扩增产物。
3.一种鉴定或辅助鉴定待测拟南芥是否为雄性不育株系的试剂盒，包括比对卡，所述比对卡上记载ACT8基因野生型序列和ACT8基因突变型序列；
所述ACT8基因野生型序列为序列表中序列3；
所述ACT8基因突变型序列为序列表中序列1。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括引物对，所述引物对为由序列5所示的单链DNA分子和序列表中序列6所示的单链DNA分子组成的引物对。
5.权利要求3或4所述的试剂盒在鉴定或辅助鉴定待测拟南芥是否为雄性不育株系中的应用。
6.一种蛋白，是如下(a)或(b)：
(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由序列2衍生的蛋白质。
7.编码权利要求6所述蛋白的DNA分子，其是如下(1)-(3)中任一种的DNA分子：
(1)编码区为序列表中的序列1所示的DNA分子；
(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码且具有相同功能的蛋白的DNA分子；
(3)与(1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码具有相同功能蛋白的DNA分子。
8.含有权利要求7所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；或扩增权利要求7所述DNA分子全长或其任意片段的引物对。
9.权利要求1所述蛋白、权利要求2或3所述DNA分子或权利要求4所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在鉴定或辅助鉴定待测拟南芥是否为雄性不育株系中的应用。
10.一种培育雄性不育拟南芥的方法，包括如下步骤：使野生型拟南芥的基因组中ACT8基因的第982位核苷酸由G变为A，基因组其它序列不变，获得雄性不育拟南芥。
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