CN104045711A - 人源抗h7n9禽流感病毒中和性抗体b5、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种利用噬菌体表面展示技术筛选获得的人源抗H7N9禽流感病毒中和性抗体B5，其轻链和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。该抗体能够特异性识别H7N9病毒颗粒抗原，可与H7N9病毒发生显著的酶联免疫反应且具有抗H7N9病毒感染的中和活性功能。此外，可将本发明的抗体制成预防和治疗H7N9禽流感病毒的特异性抗体药物，从而在临床中用于预防和治疗由H7N9病毒引起的急性呼吸道传染病。

Description

人源抗H7N9禽流感病毒中和性抗体B5、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及基因工程及噬菌体表面展示技术，具体地说，涉及人源抗H7N9禽流感病毒中和性抗体B5、其制备方法及应用。

背景技术

H7N9禽流感是由H7N9禽流感病毒引起的急性呼吸道传染病。自2013年2月以来，上海市、安徽省、江苏省先后发生不明原因重症肺炎病例。患者一般表现为流感样症状，如发热，咳嗽，少痰，可伴有头痛、肌肉酸痛和全身不适。重症患者病情发展迅速，表现为重症肺炎，体温大多持续在39℃以上，出现呼吸困难，可伴有咯血痰；可快速发展出现急性呼吸窘迫综合征、纵隔气肿、脓毒症、休克、意识障碍及急性肾损伤等，死亡率较高。

由H7N9病毒引起的急性呼吸道传染病目前没有相应的疫苗和特异性药物，因此制备高效、价廉、副反应小的被动免疫制剂成为研究的热点。利用含有特异性抗体的人源或动物血清免疫球蛋白来预防和治疗传染病由来已久。单克隆抗体的体外抗病毒中和活性和体内保护机体抵抗病毒攻击已获得许多实验证明，如汉坦病毒、麻疹病毒、RSV病毒、狂犬病毒等中和性单克隆抗体可以在体内100％保护动物免受病毒攻击。

免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig)作为抗体成分主要来自捐献者(恢复期病人)免疫血清，从获得阳性血清到通过安全性检测耗时较长，且需投入大量的人力和财力，这就使其大量制备受到限制，同时由于抗体主要来源于血清，因此容易发生血源性传播疾病的感染。而使用人源基因工程产品替代血制品则可克服这些缺陷，随着人源基因工程抗体研究的不断深入，给这一领域的生物制品发展带来了新的希望和广阔前景。

90年代初兴起的噬菌体抗体基因库技术(Barbas,C.F.等,1991)和整个基因工程抗体技术研究领域的发展，极大促进了人源或基因工程抗体的开发研究，并已由基础研究阶段步入实质性应用研究和开发阶段。人源抗病毒基因工程抗体，尤其是人源全抗体的研究成功，给各种病毒性传染病的特异性预防和治疗开辟了新思路，并在抗病毒感染生物医药领域中逐渐开发出一类新的抗病毒药物。

发明内容

本发明的目的是提供一种人源抗H7N9禽流感病毒中和性抗体B5、其制备方法及应用。

为了实现本发明目的，本发明的一种人源抗H7N9禽流感病毒中和性抗体B5或其活性片段，其轻链高变区CDR1、CDR2和CDR3以及重链高变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列如表1所示：

表1轻链和重链高变区的氨基酸序列

前述的中和性抗体B5，i)其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；ii)其重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

本发明中所述的人源抗H7N9禽流感病毒中和性抗体B5的活性片段是指能够与抗原结合的人源抗H7N9禽流感病毒中和性抗体B5的Fab段。

本发明还提供编码所述人源抗H7N9禽流感病毒中和性抗体B5的基因。其中，编码轻链可变区和编码重链可变区的核苷酸序列分别如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。

本发明还提供含有编码所述人源抗H7N9禽流感病毒中和性抗体B5的基因的载体及宿主细胞。

本发明还提供一种制备人源抗H7N9禽流感病毒中和性抗体方法，利用噬菌体表面展示技术，采集多个H7N9禽流感病人恢复期外周血淋巴细胞，通过基因工程方法构建了人源抗H7N9禽流感病毒基因工程抗体文库，并筛选获得特异性抗H7N9禽流感病毒的基因工程抗体Fab段。

该抗体是由存在于抗体轻链和重链基因可变区中的高变区(CDRs)特异性基因序列决定的，并能够在原核细胞中获得有效表达的特异性结合H7N9禽流感病毒的功能性抗体。它特异性识别H7N9禽流感病毒颗粒抗原，与H7N9禽流感病毒具有明显的酶联免疫(ELISA)反应和抗H7N9禽流感病毒感染的中和活性功能。

H7N9禽流感B5特异性的轻链和重链可变区基因来源于对人源抗H7N9禽流感病毒抗体基因库的特异性富积筛选，该抗体库的建立来源于中国H7N9禽流感病毒病人外周血淋巴细胞基因。其轻链和重链可变区相应的三个CDR区序列组合及其CDR区之间的框架区序列构成了该抗体可变区序列特征，H7N9禽流感B5属于抗体轻链家族VK1。抗体蛋白功能由存在于抗体基因轻链和重链可变区的决定族互补区CDR1、CDR2和CDR3中特异性核苷酸序列及其互补序列所决定，6个相应的CDR区氨基酸序列构成了抗体的特异性抗原结合区域，决定了本发明抗体的抗原结合特征和抗H7N9禽流感病毒功能特征。

此外，考虑到密码子的简并性，例如可在其编码区，在不改变氨基酸序列的条件下，对编码上述Fab段抗体的基因序列进行改造，获得编码具有相同功能的抗体的基因。本领域技术人员可以根据表达抗体宿主的密码子偏爱性，人工合成改造基因，以提高抗体的表达效率。

进一步地，本发明将上述Fab抗体的轻链可变区和重链可变区进行重组，获得分子量更小的单链抗体(ScFv)，该抗体同样能够特异性识别H7N9禽流感病毒表面抗原，具有细胞内免疫的作用。单链抗体穿透力强，易于进入局部组织发挥作用。参照朱进,王辛,焦永军,冯振卿,曹伯良,管晓虹.高亲和力抗Met人源基因工程抗体scFv的筛选与特性分析[J].中国肿瘤生物治疗杂志，2006，6：417-422。

可将上述编码Fab抗体的基因、ScFv基因克隆到表达载体中，进而转化宿主，通过诱导表达获得Fab抗体以及单链抗体。

此外，可将上述Fab抗体的轻链编码基因和重Fd段基因克隆到全抗表达载体中，并导入宿主细胞中，获得表达抗H7N9禽流感病毒的全抗免疫球蛋白。参照Christoph Rader,Mikhail Popkov,John A.Neves,and Carlos F.Barbas III.Integrinαvβ3-targeted therapy for Kaposi.ssarcoma with an in vitro-evolved antibody.The FASEB Journal.(October18,2002)10.1096/fj.02-0281fje。

利用ELISA、SDS-PAGE、中和实验等方法对获得的Fab抗体(即中和性抗体B5)进行功能鉴定，结果表明人源Fab抗体B5针对H7N9病毒A/Anhui/1/2013株病毒颗粒均有特异性结合，利用中和实验对Fab抗体进行功能鉴定，结果表明人源Fab抗体B5具有较好的中和活性。

本发明还提供所述中和性抗体B5或其活性片段在制备预防或治疗由H7N9禽流感病毒引起的疾病，特别是呼吸道疾病的药物中的应用。

本发明进一步含有所述中和性抗体B5或其活性片段的药物或检测试剂。

本发明利用噬菌体表面展示技术，成功筛选获得了特异性针对H7N9禽流感病毒的人源中和性抗体B5；利用上述获得的人源中和性抗H7N9禽流感病毒基因工程抗体可变区基因、Fab抗体基因以及基于该抗体基因的全抗体基因，可以在原核细胞、真核细胞(包括酵母细胞)及任何重组系统中表达和生产该抗体或以此为基础的改造后的含有该抗体基因的任何其他基因，获得具有中和H7N9禽流感病毒感染的抗体产物，制成临床上用于预防和治疗由H7N9禽流感病毒引起的疾病，如急性呼吸道传染病的特异性抗体药物。

附图说明

图1为本发明实施例1中纯化后H7N9禽流感B5抗体的SDS-PAGE电泳图；其中，1为纯化抗体H7N9禽流感B5，M为蛋白Marker。

图2为本发明实施例1中抗H7N9禽流感病毒人源H7N9禽流感B5抗体的ELISA检测(A/Anhui/1/2013株)结果；其中，阳性对照为商业鼠抗，阴性对照为EV71抗体。

图3为本发明实施例1中抗H7N9禽流感病毒人源H7N9禽流感B5抗体的中和实验结果。

图4为本发明实施例3中H7N9禽流感B5抗体构建全抗体IgG后的SDS-PAGE电泳图；其中，1为H7N9禽流感B5全抗体IgG，M为蛋白Marker。

图5为本发明实施例3中抗H7N9禽流感病毒人源H7N9禽流感B5全抗体IgG的中和实验结果，阴性对照为EV71抗体。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1  人源抗H7N9禽流感病毒中和性抗体B5及其制备

1材料和方法

1.1病毒、细胞及载体来源：H7N9病毒A/Anhui/1/2013株已在文献(Gao R,Cao B,Hu Y,Feng Z,Wang D,Hu W,Chen J,Jie Z,Qiu H,Xu K,Xu X,Lu H,Zhu W,Gao Z,Xiang N,Shen Y,He Z,Gu Y,ZhangZ,Yang Y,Zhao X,Zhou L,Li X,Zou S,Zhang Y,Li X,Yang L,Guo J,Dong J,Li Q,Dong L,Zhu Y,Bai T,Wang S,Hao P,Yang W,Zhang Y,Han J,Yu H,Li D,Gao GF,Wu G,Wang Y,Yuan Z,Shu Y.2013.Humaninfection with a novel avian-origin influenza A(H7N9)virus.N Engl J.Med.368:1888–1897)中公开，由中国医学科学院病原生物学研究所提供。用于H7N9禽流感病毒体外中和实验的细胞为MDCK细胞，购自ATCC。构建噬菌体抗体库所使用的菌株为XL1-Blue(Stratagene，美国)，载体pComb3H(由美国Scripps研究所提供)。

1.2抗原制备

H7N9病毒纯化：收获H7N9病毒A/Anhui/1/2013株感染MDCK细胞后培养上清，经甲醛灭活和安全检查后，用30％-60％蔗糖密度梯度35000g，4℃离心3h纯化病毒颗粒(Beckman SW28)。

1.3噬菌体抗体库的构建

用淋巴细胞分离液(Sigma，美国)从H7N9禽流感病人恢复期抗凝血液中分离淋巴细胞，用RNeasy Mini Kit(QIAGEN，德国)提取细胞总RNA，以Oligo-dT为引物，提取的RNA为模板，采用Invitrogen公司的第一链合成试剂盒(SuperScriptTMⅢFirst-Strand SynthesisSystem for RT-PCR.Cat No.18080-051)逆转录生成cDNA。用一组扩增人源抗体IgG1重链Fd及轻链Kappa(κ链)和Lambda(λ链)的引物，使用的引物序列如下：

(一)重链Fd区引物

5'端

VH1a  5'-CAG GTG CAG CTC GAG CAG TCT GGG-3'

VH1f  5'-CAG GTG CAG CTG CTC GAG TCT GGG-3'

VH2f  5'-CAG GTG CAG CTA CTC GAG TCG GG-3'

VH3a  5'-GAG GTG CAG CTC GAG GAG TCT GGG-3'

VH3f  5'-GAG GTG CAG CTG CTC GAG TCT GGG-3'

VH4f  5'-CAG GTG CAG CTG CTC GAG TCG GG-3'

VH6f  5'-CAG GTG CAG CTA CTA GAG TGG GG-3'

VH6a  5'-CAG GTA CAG CTC GAG CAG TCA GG-3'

3'端

CG1Z  5'-GCA TGT ACT AGT TTT GTC ACA AGA TTT GGG-3'

(二)轻链引物

κ链可变区5'端

VK1a  5'-GAC ATC GAG CTC ACC CAG TCT CCA-3'

VK2a  5'-GAT ATT GAG CTC ACT CAG TCT CCA-3'

VK3a  5'-GAA ATT GAG CTC ACG CAG TCT CCA-3'

κ链可变区3'端

CK1d  5'-GCG CCG TCT AGA ATT AAC ACT CTC CCC TGT TGA AGCTCT TTG TGA CGG GCG AAC TCA-3'

λ链可变区5'端

VL1  5'-AAT TTT GAG CTC ACT CAG CCC CAC-3'

VL2  5'-TCT GCC GAG CTC CAG CCT GCC TCC GTG-3'

VL3  5'-TCT GTG GAG CTC CAG CCG CCC TCA GTG-3'

VL4  5'-TCT GAA GAG CTC CAG GAC CCT GTT GTG TCT GTG-3'

VL5  5'-CAG TCT GAG CTC ACG CAG CCG CCC-3'

VL6  5'-CAG ACT GAG CTC ACT CAG GAG CCC-3'

λ链可变区3'端

CL25'-CGC CGT CTA GAA TTA TGA ACA TTC TGT AGG-3'

对人源轻链和重链Fab基因进行PCR扩增。PCR条件为:94℃1min，54℃1min，72℃2min，共35个循环。建库方法基本按文献(Barbas,C.FⅢ.,Kang,A.S.,and larner,R.A.Assembly ofcombinatorial antibody libraries on phage surface:the gene Ⅲsite.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1991；88(18):7978-7982)进行。具体如下：

首先将所有不同的重链和轻链PCR产物分别按各自组群混合。取经XbaI和SacI酶切消化，并经电泳纯化后的pComb3H载体DNA1.5-2μg与轻链混合物500-700ng，加入2μl高浓度连接酶(NEB2000U/μl)，加入连接缓冲液，l6℃过夜连接。次日加入100μl纯化水，加入3M NaAc16μl，加2.5-3倍无水乙醇沉淀DNA，离心沉淀，用20μl纯水重悬沉淀后加入到电转感受态菌XL1-Blue中，电压2.5kv，电击1分钟。电转后立即加入2mL SOC培养液，然后立即转入细菌培养箱中，37℃振荡培养1小时。将菌液全部涂于含氨苄青霉素的LB平皿上，37℃培养过夜。次日向平皿中加入10-15mL培养液，刮取菌斑，分装于离心管，12000rpm离心后弃上清，全部用QIAGEN大提质粒试剂盒提取质粒pComb3H-L，混合后冻存于-20℃待用。将克隆入L链的pComb3H-L和Fd链纯化PCR产物，分别用XhoI和SpeI进行双酶切反应，37℃3-4h。电泳回收相应的条带，将质粒和Fd酶切后回收产物定量。取酶切消化后回收纯化的载体DNA2μg，重链PCR产物600ng左右，加入2μl高浓度连接酶，加入相应的连接缓冲液，16℃连接过夜。次日加100μl纯化水，加3M NaAc16μl，加2.5-3倍无水乙醇沉淀DNA，离心沉淀，用20μl纯水重悬沉淀并加入到电转感受态菌XL1-Blue中，电压2.5kv，电击1分钟。电转后立即加入2mL SOC培养液，然后立即转入细菌培养箱中，37℃200rpm振荡培养1h。将菌液转入一个三角瓶中，加入含20μg/ml氨苄青霉素的l0mL SB培养基，37℃200rpm振荡培养1小时。加入100ml SB培养液(含100μg/mL的Amp和20μg/mL的Tet)，震荡培养1小时。加入10¹²pfu辅助噬菌体VCSM13，37℃静止感染20min，然后37℃培养2h加入终浓度为70μg/ml的Kan，37℃培养过夜。待OD600约为1时，将菌液4℃4000rpm离心15min，转移上清至无菌三角瓶中，加入4％(w/v)PEG8000和3％(w/v)NaCl，完全溶解后冰浴30min以上以沉淀噬菌体。4℃9000rpm离心20-30min，弃上清将沉淀用2mL PBS重悬，瞬时离心，上清即为Fab噬菌体抗体库。

1.4噬菌体抗体库的富集筛选及Fab段抗体的诱导表达

以超速离心纯化的灭活病毒颗粒A/Anhui/1/2013株为筛选抗原。使用时用0.1M NaHCO₃(pH8.6)溶液稀释，包被免疫管，用含4％脱脂奶的PBS液，于37℃封闭2h后，加入上述噬菌体抗体库，每管1mL，37℃孵育2h，用含5％Tween-20的TBS液反复洗20遍，最后每管用1mLpH2.2的甘氨酸-盐酸洗脱液洗脱，并用pH9.6的Tris液中和。洗脱后的噬菌体继续感染2mL新鲜的OD₆₀₀约为1的XL1-Blu菌，经辅助噬菌体VCSM13(Stratagene，美国)感染后进行下一轮筛选。如此反复筛选3～4次。具体富集筛选方法及Fab段的诱导表达基本按文献(Barbas,C.FⅢ.,Kang,A.S.,and larner,R.A.Assembly of combinatorial antibodylibraries on phage surface:the gene Ⅲsite.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1991；88(18):7978-7982)进行。

噬菌体抗体库的富集：用0.1M NaHCO₃(pH8.6)的溶液将纯化的A/Anhui/1/2013株按1:100稀释分别包被96孔板，4℃过夜。次日用PBS-T(20mM PBS加入0.05％吐温-20)洗去未吸附的抗原，用3％的脱脂奶37℃封闭1h。弃封闭液，每孔加入60μl噬菌体抗体库，37℃孵育2h。弃去孔中未结合的噬菌体，用TBS-T(50mM Tris-HCl，150mMNaCl，0.5％吐温-20，pH7.5)洗液冲洗各孔，冲洗时用移液器反复吹打，共洗20次，以充分洗去未吸附的噬菌体。最后用ddH₂O洗两遍，吸净孔中剩余液体。每孔加入50μl甘氨酸-HCl(pH2.2)的洗脱液，室温孵育10min，在此过程中，用移液器吸头反复吹打(注意勿吹出气泡)。将洗脱液集中于一个离心管，按照每孔3μl的比例加入2M Tris，使溶液pH值约为7，以中和洗脱下的噬菌体。将洗脱的噬菌体立即加入2mL新鲜的XL1-Blue菌液中(OD₆₀₀＝1)，室温孵育20min。转入一个250mL三角瓶中，加入10mL SB(含氨苄青霉素20μg/ml和四环素20μg/mL)，立即取10μl涂于氨苄平皿，用于滴定噬菌体。其余液体37℃振荡培养1h。加入100mL SB(含氨苄青霉素100μg/ml和四环素20μg/mL)，37℃振荡培养2h。之后，加入辅助噬菌体VCSM13(9×10¹²pfu/mL)1mL，37℃静止20min，37℃振荡培养2h。加入卡那霉素(终浓度70μg/mL)，37℃振荡培养过夜。待细菌长到OD₆₀₀约为1时，将菌液4℃6500rpm离心15min，转移上清至无菌三角瓶，加入4％(w/v)PEG8000和3％(w/v)NaCl，完全溶解后冰浴30min以上以充分沉淀噬菌体。4℃9000rpm离心20-30min，弃上清。将沉淀用2mL PBS重悬，瞬时离心，上清即为第一轮富集筛选Fab噬菌体抗体库。

Fab阳性克隆的表达：随机挑选1600个经3次富集筛选后的单菌落于96深孔板中，每孔800μl培养基，37℃培养过夜。次日以1:20的比例转接至含有800μl SB培养基(含Amp100μg/mL)的96孔板中，37℃培养至OD₆₀₀＝0.2-0.3时，加入终浓度为1mM的IPTG，30℃诱导表达8-10h。4℃4000rpm离心15min，上清用于检测。

1.5人源抗H7N9病毒Fab抗体的ELISA检测

(1)检测Fab的表达

用0.1M NaHCO₃(pH9.6)溶液将抗人Fab抗体(1:2000稀释后使用，Sigma，美国)包被于酶标板上，4℃过夜；4％脱脂奶封闭，37℃1h，加入表达的Fab抗体，37℃1h；加入酶标抗人Fab二抗(1:2000稀释后使用，Sigma，美国)，37℃1h；显色液显色，2M H₂SO₄终止反应，酶标仪检测吸光度A值。

(2)间接酶联免疫法检测Fab与H7N9病毒结合活性

用纯化的灭活H7N9病毒颗粒作为包被抗原，其余步骤同上。

1.6人源Fab抗体可变区基因的核酸序列分析

用Qiagen Miniprep Kit(QIAGEN，德国)制备质粒DNA进行核酸序列分析。轻重链的测序引物分别为5＇-AAACTAGCTAGTCGCCAAGGA-3＇和5＇-CCGCGGTGGCGGCCGCAAAT-3＇。将测序结果与Internet V-Base基因库中IgG基因序列进行比较。

1.7人源抗H7N9病毒Fab抗体的纯化

用抗人Fab的抗体(Sigma，美国)制备2mL亲和层析柱，将滤过的含Fab抗体的菌液加于亲和层析柱中，反复循环30min至1h。加入pH值6.8的PBS预洗缓冲液，洗去非特异性吸附蛋白。加入pH值2.7的甘氨酸盐酸缓冲液洗脱结合的Fab抗体蛋白，加入pH值9.0的Tris-HCl缓冲液中和洗脱下来的溶液，然后用浓缩柱离心浓缩。取纯化浓缩后的Fab片段蛋白10-20μg进行SDS-PAGE电泳。

1.8人源抗H7N9病毒Fab抗体的中和实验检测

(1)实验步骤

将100TCID50H7N9禽流感A/Anhui/1/2013株病毒50μl和倍比稀释的抗体50μl于37℃共同孵育2小时，然后加入浓度为2×10⁵个MDCK细胞/mL的细胞培养液100μl。观察4天，记录细胞病变结果。

(2)结果判定

以可以保护50％细胞不发生病变的最高稀释度的倒数作为中和抗体的滴度。

2结果

2.1人源抗H7N9病毒抗体库的筛选

用纯化的H7N9病毒颗粒A/Anhui/1/2013株对噬菌体抗体库进行富集筛选，3轮筛选后随机挑取1600个克隆。用抗人Fab抗体(1:2000稀释后使用，Sigma，美国)和H7N9禽流感病毒颗粒A/Anhui/1/2013株抗原包被96孔板，加入待测样品上清，用酶标抗人Fab二抗(1:2000稀释后使用，Sigma，美国)检测。结果显示共获得1146个人源Fab表达阳性克隆，其中，935个克隆能够特异性结合H7N9禽流感病毒颗粒A/Anhui/1/2013株(表2)。

表2 A/Anhui/1/2013株对噬菌体抗体库富集筛选结果

2.2人源抗H7N9禽流感病毒Fab抗体的序列分析

用DNASTAR序列分析软件对Fab片段进行分析处理，比较Internet V-Base基因库中的IgG序列，在上述935个特异性结合H7N9禽流感病毒的人源Fab单克隆抗体中，有23个Fab片段的序列不同。因此本发明成功筛选并克隆出23个带有不同的抗体轻重链可变区序列及其组合的抗体。其中，人源抗H7N9禽流感病毒中和性抗体B5属于抗体轻链家族VK1，其轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，编码轻链可变区和编码重链可变区的核苷酸序列分别如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。

2.3人源抗H7N9禽流感病毒Fab抗体的纯化

用抗人Fab的抗体(Sigma，美国)制备2mL亲和层析柱，纯化Fab抗体表达上清，通过SDS-PAGE检验Fab抗体的表达及纯化情况，结果证实得到较纯蛋白，可清晰观察到解链后的抗体轻链和Fd链(图1)。

2.4人源抗H7N9禽流感病毒Fab抗体的ELISA检测

分别用纯化的灭活H7N9禽流感病毒颗粒A/Anhui/1/2013株作为包被抗原，检测抗体的结合活性，结果如图2所示。

抗原结合活性的ELISA检测：用0.1M NaHCO₃(pH9.6)的溶液包被纯化的灭活H7N9禽流感病毒颗粒A/Anhui/1/2013株，4℃过夜，用PBS-T洗液洗板3次，充分去除液体加入5％脱脂奶100μl，37℃温育1h，PBS-T洗液洗板3次，充分去除液体，加入原核表达的抗体上清50μl，再向每孔中加入5％PBS-脱脂奶50μl轻微晃动混匀，37℃温育1h。PBS-T洗液洗板6次，充分去除液体，加入酶标抗人Fab抗体(Sigma公司，1:2000稀释使用)100μl，37℃温育1h，PBS－T洗液洗板6次，充分去除液体，加入显色液A、B室温显色10min，2M H₂SO₄终止反应，OD₄₅₀读数。

2.5人源抗H7N9禽流感病毒Fab抗体的中和实验

用H7N9禽流感病毒A/Anhui/1/2013株作为攻毒毒株，在MDCK细胞中检测抗体的中和活性。结果如图3所示(纵坐标为样本稀释倍数)。

实验步骤：用H7N9禽流感病毒A/Anhui/1/2013株作为攻毒毒株，在MDCK细胞中检测抗体的中和活性。

将50μl的100TCID50H7N9禽流感病毒A/Anhui/1/2013株和50μl倍比稀释的抗体B5于37℃共同孵育2小时后加入2×10⁵个细胞/mL的细胞悬液100μl中。观察4天，记录细胞病变结果。

其中，所使用的H7N9禽流感病毒(A/Anhui/1/2013株)经过如下处理：1:100稀释，然后做系列半对数稀释，使之成10^-2、10^-2.5、10^-3、10^-3.5……10^-7。每孔含100μl病毒液，每个稀释度重复4孔，各加入细胞板内，每孔100μl，每个稀释度加入4孔细胞；每孔加细胞悬液100μl，35℃培养4d，观察细胞病变；待细胞病变停止发展时，根据Reed-Muench两氏法对病毒滴度进行计算，计算出病毒的TCID50/100μl。

实施例2  人源抗H7N9禽流感病毒中和性抗体B5的应用

目前预防和治疗由H7N9病毒引起的急性呼吸道传染病并无特异性的疫苗和药物，临床上所使用的免疫球蛋白往往来源于感染病毒的病人恢复期血清，这就使其大量制备受到限制，同时由于来源于血清所以容易发生血源性传播疾病的感染。采用本发明获得的人源抗H7N9禽流感病毒基因工程抗体B5替代血源性免疫球蛋白，为由H7N9病毒引起的急性呼吸道传染病的治疗提供了新途经。

实施例3  利用中和性抗体B5制备全抗体免疫球蛋白IgG的方法

1、全抗体IgG的表达和纯化

①全抗体重组表达质粒的构建：先用引物(上游引物5'-CCCAAGCTTGTTGCTCTGGATCTCTGGTGCCTACGGGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCC-3'，下游引物5'-CTAGTCTAGAATTAACACTCTCCCCTG-3')扩增获得Fab抗体的轻链段，用XbaI/HindIII酶切，克隆入PIgG载体(美国Scripps研究所提供)(Christoph Rader,Mikhail Popkov,John A.Neves,and CarlosF.Barbas III.Integrinαvβ3-targeted therapy for Kaposi.s sarcoma withan in vitro-evolved antibody.The FASEB Journal.(October18,2002)10.1096/fj.02-0281fje.)，得到载体PIgG-L。再用引物(上游引物5'-GAGGAGCTCACTCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGAC-3'，下游引物5'-GAGGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGT-3')扩增Fab抗体的重链段，利用SacI/ApaI酶切克隆入载体PIgG-L，构建成全抗体表达载体。

②转染：采用购自美国Invitrogen公司的转染试剂盒，操作方法略述如下：将5μg重组质粒DNA与转染试剂混合后，转染生长密度为70％的293T细胞，37℃5％CO2培养。

③全抗体IgG纯化：培养3d后收集上清，采用购自Amersham公司的Protein-A亲和层析柱直接纯化表达上清(Harlow E,Lane D.Antibodies:A Laboratory Manual[M].New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1988)。采用ELISA和IFA对获得的纯化IgG抗体的功能特性进行鉴定。

图4为构建得到的全抗体IgG的SDS-PAGE电泳结果。

2、血凝抑制实验

选择禽流感病毒H7N9代表毒株A/Anhui/1/2013进行血凝抑制试验，分析全抗体IgG对毒株的血凝抑制作用。

(1)实验步骤

将待测单抗进行倍比稀释，每孔保留25μl，然后每孔各加入25μl病毒液(4个凝集单位的抗原)；混匀室温孵育30min，然后每孔加入0.5％马红细胞悬液50μl，混匀室温孵育30min，观察红细胞凝集抑制试验结果。

(2)结果判定

当特定抗体与相应的红细胞凝集素抗原结合后，可以抑制病毒引起的红细胞凝集现象，红细胞凝集抑制效价是指抑制红细胞凝集出现时血清的最高稀释度的倒数。结果表明，全抗体IgG对A/Anhui/1/2013株发生血凝抑制所需的最低抗体量为1.6μg/ml。

表3B5全抗体IgG对A/Anhui/1/2013株血凝抑制实验

3、全抗体IgG中和实验

为了进一步验证全抗体IgG的中和活性，用H7N9禽流感病毒A/Anhui/1/2013株作为攻毒毒株，在MDCK细胞中检测抗体的中和活性。

(1)实验步骤

将100TCID50H7N9禽流感A/Anhui/1/2013株病毒50μl和倍比稀释的全抗体IgG50μl于37℃共孵育2小时，然后加入浓度为2×10⁵个MDCK细胞/mL的细胞培养液100μl。观察4天，记录细胞病变结果。

(2)结果判定

以可以保护50％细胞不发生病变的最高稀释度的倒数作为中和抗体的滴度。结果表明，全抗体IgG对A/Anhui/1/2013株发生中和抑制所需的最低抗体量为0.04μg/ml。(图5)

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.人源抗H7N9禽流感病毒中和性抗体B5或其活性片段，其特征在于，其轻链及重链高变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列如下表所示： 

。

2.根据权利要求1所述的中和性抗体B5，其特征在于， 

i)其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；以及 

ii)其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。 

3.编码权利要求2所述中和性抗体B5的基因。 

4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于，编码轻链可变区和重链可变区的核苷酸序列分别如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。 

5.含有权利要求3或4所述基因的载体。 

6.含有权利要求3或4所述基因的宿主细胞。 

7.权利要求1所述中和性抗体B5或其活性片段经改造得到的单链抗体ScFv或全抗体免疫球蛋白IgG。 

8.一种制备人源抗H7N9禽流感病毒中和性抗体方法，其特征在于，利用噬菌体表面展示技术，采集H7N9禽流感病人恢复期外周血淋巴细胞，通过基因工程方法构建了人源抗H7N9禽流感病毒基因工程抗体文库，并筛选获得特异性抗H7N9禽流感病毒的基因工程抗体Fab段。 

9.权利要求1或2所述中和性抗体B5或其活性片段在制备预防或 治疗由H7N9禽流感病毒引起的疾病的药物中的应用。 

10.含有权利要求1或2所述中和性抗体B5或其活性片段的药物或检测试剂。