CN104031921A - 一种西维因的核酸适体、衍生物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种西维因的核酸适体、衍生物及其应用，西维因的核酸适体的核苷酸序列为：CCTGCCACGCTCCGCAAGCTTGGTTTGGTTTCTGCAGCGATTCTTGATCGTGCATGGCTCCTTAGCCTCGTAAGCTTGGCACCCGCATCGT或其互补的核苷酸序列所示的DNA分子。本发明的西维因的核酸适体、衍生物可以用于西维因分离和检测分析。本发明的优点在于：制备步骤简单、效率高、品质均一、稳定性好、开发周期短、生产成本低、操作简单、安全性高。

Description

一种西维因的核酸适体、衍生物及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种西维因的核酸适体、衍生物及其应用。

背景技术

氨基甲酸酯类农药是一种高效、广谱型杀虫剂，其毒理机制是抑制害虫体内胆碱酯酶，使乙酰胆碱积累，影响神经兴奋传导，从而使害虫发生痉挛、麻痹死亡，常用来处理种子，抑制害虫生长。西维因是目前应用最为广泛的广谱性杀虫剂之一，但是使用不当，在蔬菜、牧草和农作物上都会有大量的残留，动物进食了含有农药的饲料或者饮用水都可能中毒，积累大量的农药在体内，人直接进食农作物或间接进食肉类，都可能会引发中毒事件。因此，对于西维因的残留检测是一个民生问题。当前，主要检测的技术有生物传感技术、免疫检测技术、分光光度技术等。但这些方法都存在着前期处理烦琐、精度低、使用成本高等缺点。

核酸适体是一类体外人工合成并具有确定二级或三级结构的单链DNA或RNA寡核苷酸分子，其能够对靶分子进行特异性识别。通过指数富集的配基系统进化技术，经过体外筛选、扩增和富集过程可以从随机寡核苷酸库中筛选出针对多种靶分子的适体。传统SELEX技术以小分子为靶标物质筛选时，目标靶通常以在同相基质上的固定态与寡核苷酸分子结合。利于后续的分离过程，但必须在小分子上修饰活性基团才能将其与固相载体结合，因此在一定程度上会影响目标靶的构象；以农药为靶分子，对其改造时，既要保证其杀虫活性结构不被破坏又不能掩盖与核酸的结合位点。而利用溶液中的自由态可以简化筛选步骤。适体的优点包括易合成与标记、无批间差异和化学稳定性好等，因此对食品、环境中西维因农药残留检测具有耗时短、成本低、灵敏度高的特点，有很好的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型SELEX技术筛选的到能够与西维因结合的适体，并提供西维因适体在残留检测分析中高灵敏和快速检测的应用方法：与其它组合化学库如肽库、抗体库相比从核酸库中筛选出适体具有简便、快速、经济等特点。本发明提供一种西维因适体替代免疫法和酶法在西维因农残快速检测中应用，以克服现有技术中的不足。

本发明的技术方案：一种用于检测西维因残留的适体，它为核苷酸序列，具体序列如下：

CCTGCCACGCTCCGCAAGCTTGGTTTGGTTTCTGCAGCGATTCTTGATCGTGCATGGCTCCTTAGCCTCGTAAGCTTGGCACCCGCATCGT或其互补的核苷酸序列所示的DNA分子。

所述西维因适体的衍生物为进行氨基化或巯基化或同位素化修饰的核酸序列。所述西维因适体的衍生物具有相同功能用途。

所述的西维因核酸适体包括置换、缺失和增加碱基后具有相同功能用途的核酸序列。

所述的西维因适体，包括在核酸上偶联各种荧光素或酶或HIS标签或生物素或地高辛或纳米材料或胶体金。

一种西维因适体分离西维因的应用，包括以下步骤：

（1）将西维因适体偶联于磁颗粒或固体载体上；

（2）将偶联载体的适体与待分离的液体组分充分混合；

（3）将固液分离，清洗固相后将西维因从适体上解离，从而获得单一组分。

一种西维因适体用于检测分析西维因的应用，步骤如下：

（1）准备检测序列：

F	GCGGAGCGTGGCAGG (5'FAM)
		Q	TACCGCAAAAAAAAACAAGAATCGCTGCAG (3'DABCYL)

（2）将待鉴定的核酸适体序列（250 nmol/L）、F序列（125 nmol/L）以及Q序列（1000 nmol/L）混合溶入PBS中后，95℃变性3 min后室温条件下孵育1 h；

（3）加入靶分子溶液后于室温下作用30 min；

（4）测定加入靶分子的体系荧光强度，以荧光数值为纵坐标，以标准浓度为横坐标，做标准曲线。

F序列和Q序列分别是一段与适体互补的核酸片段，F序列带有荧光信号基团，Q序列带有荧光淬灭基团。当样品中存在西维因时，将破坏西维因适体与Q序列的结合，从而使淬灭作用失效，荧光值升高，因此通过检测分离后的可检测标记物的信号而获得西维因浓度。

一种利用西维因核酸适体在西维因检测分析中的应用，包括以下步骤：

（1）快速检测西维因农药残留的适体胶体金试纸，由吸水垫、NC膜、金标结合垫、样品吸液层顺次粘贴在底板上组成。金标结合垫上含有西维因适体组装的纳米颗粒聚集体（经生物素标记），在NC膜上有互补序列构成的隐形检测线（经生物素标记），以及由链亲和素形成的隐形质控线。

（2）把试纸的样品吸液层端插入果汁、蔬菜浸出液中，1min后取出，由于毛细作用进行侧向层析，5-10min观察结果。检测西维因浓度0.9μg/mL以上，NC膜上出现一条红线为阳性；0.9μg/mL以下出现双红线为阴性；0.9μg/mL时检测线处为一条模糊阴影线为界限值。

将标记生物素标记后的西维因适体与胶体金颗粒结合，用其互补序列作为检测线，用链亲和素作为质控线，当样品中存在西维因时，适体不能与互补序列结合，则只有一条线显色，而不存在西维因时两条线都显色，达到检测的目的。

本发明的有益效果：具有简便、快速、经济等特点：

1）本发明的西维因适体是寡核甘酸，分子量小，可以化学合成且便于修饰；

2）重复性和稳定性好，且易于保存，即对高温和剧烈条件不敏感：

3）检测方法灵活，易于优化；

4）胶体金试纸组装比传统免疫胶体金方法简单。因此，核酸适体技术具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为实施例1中特异性鉴定结果。

具体实施方式

下面的实施例是对本发明的进一步详细描述。

实施例1：

西维因适体特异性鉴定，包括以下步骤：

西维因适体：CCTGCCACGCTCCGCAAGCTTGTGGTATCTTCTGCAGCGA TTCTTGATCGACCGGTCGTTGTTCGCTGATTAAGCTTGGCACCCGCATCGT，F序列：GCGGAGCGTGGCAGG (5'FAM)和Q序列：TACCGCAAAAAAAAACAAGAATCGCTGCAG (3'DABCYL)均为化学合成。

将待鉴定的核酸适体序列（250 nmol/L）、F序列（125 nmol/L）以及Q序列（1000 nmol/L）混合溶入PBS中后，95℃变性3 min后室温条件下孵育1 h；加入靶分子溶液后于室温下作用30 min；测定加入靶分子的体系荧光强度。以上步骤在暗环境中操作。以荧光数值为纵坐标，比较适体的特异性。

实施例2

西维因适体分离西维因，包括以下步骤：

将西维因适体偶联于磁颗粒上；

将偶联载体的适体与待分离的液体组分充分混合；

固液分离，清洗固相后将西维因从适体上解离，从而获得单一组分。

实施例3

西维因核酸适体及其互补序列在西维因检测分析中的应用，包括以下步骤：

组装快速检测西维因农药残留的适体胶体金试纸。金标结合垫上含有西维因适体组装的纳米颗粒聚集体，在NC膜上有互补序列构成的隐形检测线，以及由链亲和素形成的隐形质控线。

把试纸的样品吸液层端插入果汁、蔬菜浸出液中，1min后取出，由于毛细作用进行侧向层析，5-10min观察结果。检测西维因浓度0.9μg/mL以上，NC膜上出现一条红线为阳性；0.9μg/mL以下出现双红线为阴性；0.9μg/mL时检测线处为一条模糊阴影线为界限值。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

〈110〉王耘、张驰、周骏贵、杨军、凌睿

〈120〉一种西维因的核酸适体、衍生物及其应用

〈160〉1

〈210〉1

〈211〉91

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉1

CCTGC CACGC TCCGC AAGCT TGGTT TGGTT 30

TCTGC AGCGA TTCTT GATCG TGCAT GGCTC 60

CTTAG CCTCG TAAGC TTGGC ACCCG CATCG T 91

Claims (9)

1.一种西维因的核酸适体,其特征在于:该适体的核苷酸序列为: CCTGCCACGCTCCGCAAGCTTGGTTTGGTTTCTGCAGCGATTCTTGATCGTGCATGGCTCCTTAGCCTCGTAAGCTTGGCACCCGCATCGT或其互补的核苷酸序列所示的DNA分子。

2.如权利要求1所述的西维因的核酸适体，其特征在于：所述西维因核酸适体序列上偶联荧光素、酶、HIS标签、生物素、地高辛、纳米材料、胶体金、荧光基团或发光物质中的一种。

3.如权利要求1所述的西维因的核酸适体，其特征在于：将所述西维因核酸适体序列置换、缺失或增加碱基后具有相同功能用途的核酸序列。

4.一种如权利要求1所述的西维因的核酸适体的衍生物，其特征在于：该衍生物为所述核酸适体经巯基化或同位素化修饰，得到的与所述西维因核酸适体具有相同功能的西维因核酸适体衍生物。

5.如权利要求1-4任一项权利要求中所述的西维因的核酸适体或衍生物在西维因分离和检测分析中的应用。

6.如权利要求1-4任一项权利要求中所述的西维因的核酸适体或衍生物分离西维因的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：

将西维因适体偶联于磁颗粒或固体载体上；

将偶联载体的适体与待分离的液体组分充分混合；

将固液分离，清洗固相后将西维因从适体上解离，从而获得单一组分。

7.如权利要求1-4任一项权利要求中所述的西维因的核酸适体或衍生物检测分析西维因的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：

（1）准备检测序列：

F GCGGAGCGTGGCAGG (5'FAM) Q TACCGCAAAAAAAAACAAGAATCGCTGCAG (3'DABCYL)

（2）将待鉴定的核酸适体序列（250 nmol/L）、F序列（125 nmol/L）以及Q序列（1000 nmol/L）混合溶入PBS中后，95℃变性3 min后室温条件下孵育1 h；

（3）加入靶分子溶液后于室温下作用30 min；

（4）测定加入靶分子的体系荧光强度，以荧光数值为纵坐标，以标准浓度为横坐标，做标准曲线。

8.如权利要求7所述的检测分析方法，其特征在于：F序列和Q序列分别是一段与适体互补的核酸片段，F序列带有荧光信号基团，Q序列带有荧光淬灭基团。

9.如权利要求1-4任一项权利要求中所述的西维因的核酸适体或衍生物快速检测西维因残留的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：

（1）将标记生物素标记后的西维因适体与胶体金颗粒结合，用其互补序列作为检测线，用链亲和素作为质控线；

（2）将含有西维因适体的试纸插入果汁、蔬菜浸出液中，1min后取出，由于毛细作用进行侧向层析，5-10min观察结果，当样品中存在西维因时，适体不能与互补序列结合，则只有一条线显色，而不存在西维因时两条线都显色。