CN104017074A - 一种特异性识别克诺罗杆菌的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种特异性识别克诺罗杆菌的单克隆抗体及其应用。所述的单克隆抗体可良好地识别克诺罗杆菌的不同种或亚种，具备对于克诺罗杆菌的广谱识别能力，但不与其它种属菌株发生交叉反应，特异性和灵敏度均非常高。

Description

一种特异性识别克诺罗杆菌的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及微生物学和免疫学领域，更具体地，本发明涉及一种特异性识别克诺罗杆菌的单克隆抗体及其应用。

背景技术

克诺罗杆菌(原称阪崎肠杆菌)是婴幼儿乳制品中的重要致病菌，能引起严重的新生儿脑膜炎、小肠结肠炎和茵血症，造成严重的后遗症和死亡，死亡率高达50％以上，成人感染则症状轻微。目前尚不清楚克诺罗杆菌的污染来源，许多病例报告表明婴儿配方粉是目前发现的主要感染渠道。

克诺罗杆菌是一种属革兰氏阴性、不会形成孢子而呈棒状的细菌，属肠杆菌科，最适宜在37至43℃之间生长。除了奶粉外，克诺罗杆菌还被从不同环境和食物中分离出来，如水、温泉、水稻种子、啤酒杯、咸肉等等。

因此，准确地鉴定克诺罗杆菌对于食品检测业而言是很重要的。现有技术中，已经开发了一些针对克诺罗杆菌的抗体，并建立了一些检测方法，包括常规生化鉴定、PCR测定、血清学检测方法等。

目前检测克诺罗杆菌的方法主要通过常规生化鉴定和PCR测定其16SRNA。这些检测方法耗时较长，对检验员的要求较高，假阴性较高。PCR法检测则费用昂贵，对仪器设备及检测环境的要求很高。血清学检测成本低廉，易于操作；但血清学检测的缺点是易产生交叉反应，不适合作为独立的检测方法应用。

并且，克诺罗杆菌有很多的种或亚种)，现有的检测抗体(多为多克隆抗体)往往难以准确地对多种种或亚种)发挥识别作用。

综上，本领域迫切需要找到能够特异性识别克诺罗杆菌多种亚型或亚种，但与克诺罗杆菌以外的其它菌株没有交叉反应的特异性检测抗体。以用于进一步开发克诺罗杆菌的快速、准确、灵敏的检测方法，控制食源性致病菌感染，以及用于研究克诺罗杆菌流行病学。

发明内容

本发明的目的在于提供一种特异性识别克诺罗杆菌的单克隆抗体及其应用。

在本发明的第一方面，提供一种单克隆抗体，其是由保藏号为CGMCCNO.7808的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。

在本发明的第一方面，提供所述的单克隆抗体的用途，用于制备特异性检测克诺罗杆菌的检测试剂盒。

在一个优选例中，所述的克诺罗杆菌包括：ATCC 29544、DSM 18702、DSM18703、DSM 18705、DSM 18706、DSM 18707、ATCC51329、CGMCC10403-22、CGMCC10403-23、NCTC9529、CGMCC 10419、CGMCC 10439、CGMCC 10456、CGMCC 10457、CGMCC 10462、CGMCC 10468、CGMCC 10473、CGMCC 10483、CGMCC 30417、CGMCC 30418。

在另一优选例中，所述的检测克诺罗杆菌包括：(1)定性检测克诺罗杆菌；或(2)定量检测克诺罗杆菌。

在本发明的第一方面，提供一种杂交瘤细胞株，其在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏号是CGMCC NO.7808。

在本发明的第一方面，提供一种用于检测克诺罗杆菌的测试条(如试纸或试纸条)，其包括固相载体，以及附着于所述固相载体上的所述的单克隆抗体。

在一个优选例中，所述的测试条是免疫胶体金测试条。

在本发明的第一方面，提供一种制备包含所述的单克隆抗体的免疫胶体金测试条的方法，所述方法包括：所述的单克隆抗体以1～4mg/mL(如2mg/ml)的包被浓度，点到硝酸纤维素膜上，羊抗鼠二抗以0.8-1.2mg/ml作为Control线点到硝酸纤维素膜上；干燥；将单抗标记为标记量10-11μg、OD值23-27的金标溶液，选择喷量为2.5-3.5μL/cm点到聚酯膜上干燥的金标条，组合上pH3-4样品垫制成试剂条；采用pH7.4含1.5％非离子型聚氧乙烯(20)油醇的0.05MPBST缓冲液作为样品缓冲液。

在本发明的第一方面，提供一种检测克诺罗杆菌的试剂盒，其中包括所述的单克隆抗体或所述的杂交瘤细胞株。

在一个优选例中，所述的试剂盒中还包括：第二抗体，固相载体；较佳地，所述的单克隆抗体包被于所述的固相载体；较佳的，所述的第二抗体还连接有标记物。

在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括：

与标记物相对应的底物；

显色剂；

洗涤液；和/或

终止液。

在本发明的第一方面，提供一种检测克诺罗杆菌的试剂盒，其中包括所述的测试条。

在本发明的第一方面，提供一种检测克诺罗杆菌的方法(较佳地，所述方法为非诊断方法，例如其可以是针对食品、乳制品或药品的检测方法)，所述方法包括：利用所述的单克隆抗体或所述的测试条与待测样品进行反应，若反应阳性，则表明待测样品中包含克诺罗杆菌。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、杂交瘤技术制备单克隆抗体地主要线路流程。

图2、克诺罗杆菌免疫胶体金快速检测试纸条结构示意图。其中1为样品垫，2为胶体金结合垫，3为硝酸纤维素膜，4为检测线(T线)，5为控制线(C线)，6为吸水垫，7为不干胶，8为PVC背衬。

具体实施方式

本发明人经过广泛的研究，首次揭示一种特异性识别克诺罗杆菌的单克隆抗体。所述的单克隆抗体可良好地识别克诺罗杆菌的不同种或亚种(具备对于克诺罗杆菌的广谱识别能力)，但不与其它菌株发生交叉反应，特异性和灵敏度均非常高。

本领域技术人员均了解，细菌包含有多种蛋白抗原，每种抗原可能含有多个抗原表位(抗原决定簇)，因此，针对一种细菌可以获得难以计数的抗体，这些抗体对抗原(细菌)的结合特性(如特异性等)均可能是不同的。因此，针对一种细菌，往往需要进行大量的反复比较、筛选和鉴定，才能找到适合于特异性结合的单抗。

本发明人在研究中发现，一些利用克诺罗杆菌的某蛋白制备的抗体或利用克诺罗杆菌的裂解蛋白制备的抗体，当用于实际检测时，遭遇到与克诺罗杆菌结合特性差的问题，这可能是由于待测样品中与该抗体相应的抗原决定簇被包在蛋白结构内部，无法接触到抗体造成的。此外，由于克诺罗杆菌有很多的种或亚种菌株，针对其中一种株型的克诺罗杆菌的抗体往往难以识别其它株型的克诺罗杆菌，这也给该菌株的检测带来了难题，难以找到一种具备对于克诺罗杆菌的广谱识别能力但具备该菌株特异性(不与其它菌株发生交叉反应)的抗体。

针对上述技术难题，本发明人选取了多种克诺罗杆菌(制备成裂解蛋白液)的来免疫动物，获取动物的脾细胞用于制备杂交瘤细胞株，经过大量的单克隆筛选和验证，从而获得本发明的5A8单克隆抗体。以所述的单克隆抗体为基础，可制备准确地检测克诺罗杆菌的检测试纸条及检测试剂盒。

本发明的单克隆抗体利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6:511，1976；Kohler等，Eur.J.Immunol.6:292，1976；Hammerling等，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的单克隆抗体的一种杂交瘤的制备方法是：

(1)小鼠免疫：选择适龄的小鼠，以菌株裂解蛋白对小鼠进行免疫；

(2)小鼠骨髓瘤细胞的培养：培养小鼠骨髓瘤细胞SP2/0并使之保持良好的生长状态用于细胞融合；

(3)细胞融合：以小鼠脾细胞作为饲养细胞。将(1)中备好的小鼠处死，制备免疫脾细胞悬液。收集(2)中的小鼠骨髓瘤细胞。将上述两种细胞混合离心，然后进行细胞融合。融合后的细胞适当稀释，接种至培养板，适当条件培养；

(4)杂交瘤细胞的筛选：将上述培养物在选择性培养基中培养。在细胞集落长到大小合适时，吸取培养液上清做抗体鉴定，筛选阳性克隆；

(5)杂交瘤细胞的克隆化：以有限稀释法克隆杂交瘤细胞，将稀释到一定密度的细胞接种至多孔板，使每孔只有一个细胞生长。形成细胞集落的孔取上清做酶联免疫吸附实验(ELISA)，鉴定阳性克隆。可以重复克隆若干次，直到杂交瘤细胞的阳性孔率达到100％。将克隆化后的杂交瘤细胞扩大培养做抗体鉴定；

(6)小鼠腹水的诱导：在接种杂交瘤细胞前，给小鼠腹腔注射液体石蜡，然后接种阳性杂交瘤细胞，培养一段时间后收集腹水后离心，测定抗体效价，并纯化单克隆抗体；

(7)单克隆抗体的纯化：经protein G柱等方法纯化腹水上清中的单克隆抗体。

在获得了所述杂交瘤的情况下，可按照常规的动物细胞培养方法，体外培养扩增所述的杂交瘤细胞，从而使之分泌所述的单克隆抗体。作为一种实施方式，所述的单克隆抗体可以由下列制备方法制备：(1)提供佐剂预处理的小鼠；(2)在小鼠腹腔内接种所述的杂交瘤细胞并分泌单克隆抗体；(3)抽取腹水，分离获得所述的单克隆抗体。作为一种方式，从腹水中分离单克隆抗体的方法是：收集腹水，用经硫酸铵、辛酸沉淀，接着用Protein G预装层析柱纯化，获得高纯度的抗克诺罗杆菌的单克隆抗体。

在获得了本发明的抗体后，本领域技术人员可以通过本领域已知的测序技术来获得该单抗的序列信息，例如测得其重链和轻链的序列。从而可应用生物工程技术人工制备。

本发明的单克隆抗体可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。本领域人员均了解，在得到了所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞系或通过测序等手段得知所述的单克隆抗体后，本领域人员可以方便地获得所述的抗体。

检测试剂盒

在获得了本发明的抗克诺罗杆菌单克隆抗体后，本领域人员可通过多种途径来灵敏地检测样品中是否存在克诺罗杆菌或其浓度，采用的技术可以是免疫学领域中常用的技术。包括定性检测和定量检测方法。较佳地，所述的定性检测包括：通过免疫印迹方法或免疫荧光的方法鉴定克诺罗杆菌的存在情况；例如通过ELISA法对克诺罗杆菌进行测定。

本发明提供了一种用于检测样品中是否存在克诺罗杆菌的检测试剂盒，该试剂盒中含本发明的抗克诺罗杆菌单克隆抗体。

所述试剂盒中除了含有本发明的抗克诺罗杆菌单克隆抗体以外，还可以包含其它检测试剂或辅剂，如显色剂、标记物、二抗、抗抗体、增敏剂等。本领域人员应理解，各种变化形式的检测试剂盒均是包含在本发明中的，只要其中利用了本发明的抗克诺罗杆菌单克隆抗体作为与克诺罗杆菌特异性结合的试剂。

所述的抗克诺罗杆菌单克隆抗体可被包被在固相载体上。本发明对所采用的固相载体没有特别的限制，只要其能够与包被抗体相偶联(连接)即可。例如，所述的固相载体选自：微量滴定板(如96孔板)、或微球等。

如本文所用，所述的“标记物”是指用于确定待检测样品中克诺罗杆菌的存在与否以及存在的量的标志物。在确定了本发明的试剂盒所采用的包被抗体和/或检测抗体后，可以采用本领域常规用于与检测抗体结合来进行检测的各种已知的标记物。本发明对所采用的标记物没有特别的限制，只要是能够与所述的检测抗体结合，且在适当处理后能够准确地指示待检测样品中克诺罗杆菌的存在与否以及存在量的标记物均是可以用的。所述的标记物可以直接被设置于检测抗体上；或者，所述的标记物也可以被设置于特异性抗检测抗体的抗抗体上，本领域人员可根据所采用的抗体的种类和特性，选择适宜的标记物。例如，所述的标记物可以选自：辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酯酶(AP)、葡萄糖氧化酶、β–D-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶、或葡萄糖淀粉酶。

当采用如上所示的一些酶标记物时，还需要采用一些与相应的酶结合的底物，从而可通过显色等方式来报导标记物的存在情况或者存在量。如本文所用，所述的“与标记物相对应的底物”是指可被标记物所催化显色，用于显示检测抗体与克诺罗杆菌发生结合的识别信号。所述的底物例如：用于辣根过氧化物酶的邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)、ABTS；用于碱性磷酸酯酶的对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate，p-NPP)；等等。本领域人员可根据所采用的标记物的种类和特性，选择适宜的底物。

作为本发明的优选方式，所述的抗克诺罗杆菌单克隆抗体被制备成一种测试条(如试纸或试纸条)，其包括固相载体(通常为测试条，如试纸(条))，以及附着于所述固相载体上的所述的单克隆抗体。更优选地，所述的抗克诺罗杆菌单克隆抗体被制备成免疫胶体金测试条。

本领域常用的制备免疫胶体金测试条的方法均可包括在本发明中，用于制备包含所述的抗克诺罗杆菌单克隆抗体的测试条。更优选地，制备该测试条的方法包括：将所述的单克隆抗体以1～4mg/mL(如2mg/ml)的包被浓度，点到硝酸纤维素膜上，羊抗鼠二抗以0.8-1.2mg/ml作为Control线点到硝酸纤维素膜上；干燥；将单抗标记为标记量10-11μg、OD值23-27的金标溶液，选择喷量为2.5-3.5μL/cm点到聚酯膜上干燥的金标条，组合上pH3-4样品垫制成试剂条；采用pH7.4含1.5％非离子型聚氧乙烯(20)油醇的0.05M PBST缓冲液作为样品缓冲液。

此外，在所述试剂盒中还可包含使用说明书，用于说明其中装载的试剂或测试条的使用方法。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、抗体制备

利用杂交瘤技术制备单克隆抗体，其主要线路流程如图1。

1.1 主要试剂：

DMEM培养基(高糖)、胎牛血清(Gibco)，福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂、HAT、HT、PEG-1450(Sigma)，Protein G(GE)，Tryptone、Yeast Extract(Oxoid)，其余均为国产分析纯。

1.2 主要仪器

二氧化碳培养箱(日本三洋)，倒置显微镜(上海蔡康)，超净工作台(上海上净)，恒温摇床(上海天呈)，超声破碎仪(宁波新芝)，酶标仪(美国Thermo)。

1.3 操作方法及步骤

1.3.1 抗原处理

作为免疫抗原的菌株接种于50ml LB培养基中，37℃ 250rpm过夜，0.5％甲醛灭活，37℃过夜，离心(10000rpm，10分钟)，弃去上清，收集菌体，菌体用10ml无菌PBS重悬，菌体悬液超声裂解，超声功率300W，超声12秒，停12秒，每轮3分钟，2轮。裂解液离心(10000rpm，10分钟)，弃去沉淀，上清即为细菌裂解蛋白溶液，菌株裂解蛋白溶液用BCA法确定蛋白浓度，即为抗原蛋白。

1.3.2 小鼠免疫

抗原用PBS稀释至1.5mg/ml，分装冻存于-20℃，第一天，取1000ul抗原与1000ul福氏完全佐剂混合，乳化，腹腔注射6只小鼠；第十五天，取1000ul抗原与1000ul福氏不完全佐剂混合，乳化，腹腔注射6只小鼠；第二十九天，取1000ul抗原与1000ul福氏不完全佐剂混合，乳化，腹腔注射6只小鼠；第三十六天，小鼠眼眶静脉采血，收集血清，ELISA检测小鼠血清效价，第四十三天，取1000ul抗原与1000ul福氏完全佐剂混合，乳化，腹腔注射6只小鼠；选定合格的小鼠后，取50ug抗原直接腹腔注射，三天后进行细胞融合。

1.3.3 酶联免疫检测

包被：将抗原用CBS稀释为10ug/ml，加入酶标板中，每孔100ul，4℃过夜；封闭：将包被液弃去，每孔加入200ul封闭液(5％脱脂奶粉)，37℃放置1.5小时；加入样本：弃去封闭液，加入样品，每孔100ul加入酶标板，37℃放置1小时；洗涤：用自来水冲洗10次，拍干加入二抗：酶标羊抗鼠用封闭液稀释至工作浓度，每孔100ul加入酶标板，37℃放置30分钟；洗涤：用自来水冲洗10次，拍干；加入TMB显色底物：每孔100ul加入酶标板，37℃放置15分钟；加入终止液：每孔加入2M H₂SO₄50ul，读数：酶标仪OD₄₅₀nm读数。

1.3.4 细胞融合

SP2/0的收集

①选择生长状态良好的SP2/0细胞(保持细胞处于对数生长期，融合前一天应换液)，用弯头吸管将细胞吹下，收集于50ml离心管中，1200rpm离心5分钟；

②弃去上清，用20ml DMEM培养基将细胞重悬，记数，取3×10⁷细胞，1200rpm离心5分钟；

③弃去上清，用20ml DMEM培养基将细胞重悬，置孵箱中备用。

脾细胞的收集

①小鼠摘眼球取血(37℃放置1小时后8000rpm离心10分钟，吸出上清即为血清，可作为阳性对照，分装冻存于-20℃)，颈椎脱臼处死，放入75％乙醇中消毒5分钟；

②小鼠转入超净台中，左侧向上，将皮肤剪一小口，从开口处拉开皮肤暴露腹膜，用无菌手术剪剪开腹膜，取出脾脏放入筛网中；

③筛网中研磨脾脏，用15ml DMEM培养基冲洗筛网收集脾细胞，1200rpm离心5分钟，弃去上清，用10ml DMEM培养基将细胞重悬。

细胞融合

①将脾细胞与SP2/0细胞混匀，1200rpm离心5分钟；

②弃去上清，将细胞弹松，吸1ml预热的融合剂(PEG1450)，在1分钟内逐滴加入，再放置37℃水浴中反应1分钟，然后加入终止液(在5分钟内加入25ml DMEM培养基，并轻轻搅拌细胞)，1200rpm离心5分钟；

③弃去上清，加入100ml预热的HAT培养基，将细胞重悬，轻轻混匀(用吸管从底部吸起细胞，在液面顶部轻轻盘旋滴入)。用排枪加入预先接种饲养细胞的96孔板中，每孔100ul，铺10块板，置孵箱中培养(37℃，5％CO₂)。

融合板的检测

融合后每天观察96孔板，看克隆的生长状况、有无污染，保证细胞正常生长。

待观察到克隆团细胞数目达到数百个以上后(7天左右)，准备换液。用排枪将融合板中的培养上清吸光，弃去，然后每孔补加200ul新鲜的HT培养基，置孵箱中培养(37℃，5％CO₂)。

换液2天后，将孔板中的上清每孔吸出100ul转入包被好抗原(克诺罗杆菌菌株的蛋白裂解溶液)的96孔酶标板，并作相应的编号，ELISA检测上清中是否有特异性抗体。

ELISA结果为阳性的孔，对应板上的编号观察孔内有无细胞，若有细胞则将孔内培养液吸出并补加200ul新鲜HT培养基，置孵箱中培养(37℃，5％CO₂)。

换液2天后，孔板中的上清每孔吸出100ul转入酶标板，并作相应的编号，ELISA复检。

1.3.5 亚克隆及建株

复检结果为阳性的孔，准备进行亚克隆。

用移液枪将96孔板中的细胞吹打制成悬液，取少量悬液苔盼蓝染色计数，根据计数结果取120个细胞加入10ml HT培养基中，各接种于预先接种饲养细胞的96孔板中，每孔100ul，孔板上作好标记，置孵箱中培养(37℃，5％CO₂)

每天观察96孔板，看克隆的生长状况、有无污染，保证细胞正常生长，96孔板中克隆生长到全孔的1/6时，标记单克隆及多克隆，每块板选择24个生长良好的克隆，编号。

1天后，将孔板中的上清每孔吸出100ul转入酶标板中，并作相应的编号，ELISA检测上清。

ELISA结果为阳性的孔，选择吸光值比较高且生长状态良好的单克隆细胞，继续亚克隆，重复3-4次，直到所有的孔中细胞上清ELISA结果均为阳性，可以建株。

建株后将细胞从96孔板转到24孔板中，细胞长满后转入T-25方瓶中，细胞长满后转入T-75方瓶中，待细胞状态良好时准备冻存。

用弯头吸管将细胞吹打制成悬液，取少量计数，计算细胞总数，1200rpm离心6分钟。

弃去上清，用冻存液将细胞重悬，分装入冻存管中(2×10⁶细胞/ml/管)，作好标记，封口膜封口。

将细胞放入程序降温盒中，转入-70℃冰箱。

2天后，复苏1支细胞，第二天镜检细胞活率>80％证明冻存合格，一周内转入液氮罐中；若细胞活率<80％，需重新冻存。

1.3.6 单抗生产

杂交瘤细胞的复苏

①从液氮中取出1支细胞，迅速投入37℃水浴中，并不断搅拌。

②待细胞完全融化后用75％酒精擦拭冻存管放入超净台中，将细胞吸出转入10ml DMEM培养基中，1200rpm离心5分钟。

③弃去上清，将沉淀弹松，用5ml完全培养基混匀，转入1个T-25方瓶中，置孵箱中(37℃，5％CO₂)培养。

杂交瘤细胞的接种

①预先腹腔注射石蜡油到小鼠体内(0.5ml/只，注射石蜡油至少7天后方可用于制备腹水)。

②待细胞基本布满瓶底，细胞状态良好时收集细胞。将杂交瘤细胞用弯头吸管吹打制成悬液，计数，1200rpm离心5分钟。

③弃去上清，用少量DMEM将细胞重悬，腹腔注射入石蜡鼠体内(每只小鼠注射2×10⁶细胞)。

腹水的收集和保存

①小鼠接种杂交瘤细胞后需注意每天观察小鼠状态。

②在小鼠濒死前颈椎脱臼处死，用手术剪剪开皮肤，撕开皮肤暴露腹膜，再在腹膜上剪一小口，用滴管将腹水吸出。

③腹水3000rpm离心30分钟，吸取上清，分装冻存于-70℃，并取少量ELISA检测腹水效价。

抗体纯化

①取1ml腹水离心，12000转/分，离心4分钟，取上清加入4ml PBS稀释。

②取出protein G柱(柱体积1ml)，用10ml PBS平衡，待PBS流干后，腹水上样过柱，收集流穿。

③用10ml PBS平衡，流干后，加入1ml的0.1M的PH2.5甘氨酸溶液，流干后再加入2.5ml的0.1M的PH2.5甘氨酸溶液，收集洗脱液，加入250ul 1MTris溶液(pH8.8)中和。

④加入10ml PBS平衡，流干后加入2ml的20％乙醇，4℃保存柱子。

⑤将抗体洗脱液用PBS透析过夜，ELISA检测效价。

实施例2、单抗筛选

采取实施例1的步骤，本发明人分别以克诺罗杆菌不同代表株ATCC29544、ATCC51329、NCTC9529、DSM 18702、DSM 18703、DSM 18705、DSM 18706、DSM 18707的裂解蛋白作为抗原，分别制备单克隆抗体，从获得的数千个阳性克隆细胞株中筛选单抗中，通过抗原抗体反应进一步确定9株单抗(5A8、1A5、1F2、1B11、2B3、2A6、4H11、2C9、2H8)可以对多于一种克诺罗杆菌菌株具有特异性。

为了获得对于尽可能多的克诺罗杆菌菌株具有特异性识别能力(即具备对于克诺罗杆菌菌株广谱识别能力)但对于克诺罗杆菌以外的其它菌株不识别的单抗，本发明人对前述获得的9株单抗进行进一步的筛选。

应用多种克诺罗杆菌菌株，包括ATCC29544、ATCC51329、NCTC9529、DSM 18702、DSM 18703、DSM 18705、DSM 18706、DSM 18707、ATCC51329、CGMCC10403的多个种或亚种(-22/23，可获自中科院微生物研究所)、NCTC9529、CGMCC 10419、CGMCC 10439、CGMCC 10456、CGMCC 10457、CGMCC 10462、CGMCC 10468、CGMCC 10473、CGMCC 10483、CGMCC30417、CGMCC 30418等，来鉴定所获得的各株单克隆抗体的识别性能，以期找出具有广谱识别能力的菌株。此外，应用普通变形杆菌、枸橼酸杆菌、大肠杆菌等多种非克诺罗杆菌菌株来鉴定单克隆抗体的特异性是否理想。鉴定方法如下：

裂解液准备：接种细菌，摇床培养过夜(220rpm，35℃)。每种细菌取20ml培养液，离心(10000rpm，10分钟)，弃去上清，沉淀用2ml PBS重悬，超声裂解(300W，每次10秒，停留10秒)，直至裂解液澄清为止。

ELISA鉴定：

(1)包被：菌株的超声裂解液加入酶标板中，每孔100ul，4℃过夜；

(2)封闭：将包被液弃去，每孔加入200ul封闭液(10％小牛血清)，37℃放置1.5小时；

(3)加入一抗：弃去封闭液，加入用封闭液稀释的待筛选的单抗(一抗)，每孔100ul加入酶标板，37℃放置1小时；

(4)洗涤：用自来水冲洗10次，拍干；

(5)加入二抗：酶标羊抗鼠用封闭液稀释至工作浓度，每孔100ul加入酶标板，37℃放置30分钟；

(6)洗涤：用自来水冲洗10次，拍干；

(7)加入TMB显色底物：每孔100ul加入酶标板，37℃放置15分钟；

(8)加入终止液：每孔加入2M H₂SO₄50ul；

(9)读数：酶标仪OD450nm读数。

获得的ELISA反应的结果如表1所示，表中，以加黑字体标示相应单抗结合阳性。阴性对照是其他与克诺罗杆菌不同种属细菌菌株的裂解液。

表1

由表1可见，筛选到一株单抗5A8，其对于所有受试克诺罗杆菌菌株均呈现抗原抗体反应阳性，而对于克诺罗杆菌菌株以外的其它菌株，则均呈现抗原抗体反应阴性。单抗1A5尽管也能识别较多种克诺罗杆菌菌株，但是其不识别CGMCC 10457和CGMCC 10462，且其对于克诺罗杆菌以外的多种菌株也发生交叉结合。

综上，获得一株对于克诺罗杆菌具有广谱识别能力且特异性良好的单克隆抗体5A8。5A8是以DSM 18705免疫小鼠制备的杂交瘤细胞产生的。

实施例3、胶体金制备

1、单抗(5A8)标记量的确定

将克诺罗杆菌单克隆抗体5A8用pH7.4PBS液稀释成1、2.5、5、10、15、20、25、30μg/mL，各取0.1mL分别加到1mL胶体金溶液中，另设一管不加蛋白质的对照管，5分钟后加入0.1mL 10％ NaCl溶液，混匀后静置2小时，不稳定的金溶胶将发生聚沉，能使胶体金稳定的最适蛋白量再加10％即为最佳标记蛋白量。

结果如表2，胶体金溶液中克诺罗杆菌单克隆抗体的最适蛋白量为10μg。根据能使胶体金稳定的最适蛋白量再加10％即为最佳标记蛋白量原则，克诺罗杆菌单克隆抗体的最佳标记蛋白量为11μg。

表2、克诺罗杆菌单克隆抗体的最佳标记蛋白量

2、包被浓度的确定

将其中单抗5A8用pH7.4PBS缓冲液稀释成0.25、0.5、1、2、4、8、12mg/mL共7个不同浓度，稀释后抗原按喷量1.0μL/cm²包被到硝酸纤维素膜上，作为T线(Test线)；同时将原浓度为26.56mg/mL的羊抗鼠二抗稀释到1.0mg/mL按喷量1.0μL/cm²也包被到硝酸纤维素膜上，作为C线(Control线)，37℃烘箱干燥2小时；将单抗5A8配合金标抗体(标记量11μg/mL、喷量3.0μL/cm²)组装成试剂板；分别用阴性样本和阳性样本进行检测。

单抗包被浓度判断标准：用阳性样本检测时，检测线(T线)的显色为红色，视觉效果良好；用阴性样本检测时，检测线(T线)不显色，没有浅影。线条完整，背景色浅，没有上下深浅不一的现象。

将抗体稀释为一系列的浓度，测试适宜的包被浓度。从表3可以看出最适包被浓度在1～4mg/mL。

表3、克诺罗杆菌单抗包被浓度的选择

3、金标抗体喷量的确定

选用2mg/mL的克诺罗杆菌单抗5A8按喷量1.0μL/cm包被到硝酸纤维素膜上，作为T线；同时将原浓度为1.0mg/mL的羊抗鼠二抗按喷量1.0μL/cm²也包被到硝酸纤维素膜上，作为C线，37℃烘箱干燥2小时；将此张大卡配合不同喷量(喷量1.0μL/cm、2.0μL/cm、3.0μL/cm、5.0μL/cm、8.0μL/cm)的金标抗体(标记量11μg/mL)和空白样品垫组装成试剂板；用不同浓度的阳性样本进行检测，观察显色深浅及梯度大小。

结果如表4。从表4可见，克诺罗杆菌单抗-胶体金结合物的喷量为3.0μL/cm²时，T/C线显色深浅适中，阳性样本梯度明显。

表4、克诺罗杆菌单抗-胶体金结合物喷量的选择

4、样品缓冲液的选择

选用2mg/mL的克诺罗杆菌单抗5A8按喷量1.0μL/cm包被到硝酸纤维素膜上，作为T线；同时将原浓度为1.0mg/mL的二抗按喷量1.0μL/cm也包被到硝酸纤维素膜上，作为C线，37℃烘箱干燥2小时；选用金标抗体喷量3.0μL/cm的胶体金结合垫和空白样品垫组装成试纸条。

用以下8种不同缓冲液进行滴板检测：

pH7.4 0.01 M PBST缓冲液；

pH7.4 0.02 M PBST缓冲液；

pH7.4 0.05 M PBST缓冲液；

pH7.4 0.01 M PBST缓冲液(含1％ S17)；

pH7.4 0.01 M PBST缓冲液(含4.5％ S17)；

pH7.4 0.01 M PBST缓冲液(含8％ S17)；

pH7.4 0.05 M PBST缓冲液(含1.5％ S17)；

pH7.4 0.1 M PBST缓冲液(含3％ S17)。

从表5可见，pH7.4 0.05 M PBST缓冲液(含1.5％S17)和pH7.4 0.1 M PBST缓冲液(含3％S17)均能达到较好的显色效果，但是从原料方面考虑pH7.4 0.1 MPBST缓冲液(含3％S17)用料较多，故采用pH7.4 0.05 M PBST(含1.5％S17)缓冲液为佳。

表5、样品缓冲液的选择

注：S17为表面活性剂非离子型聚氧乙烯(20)油醇。

5、样品垫pH值的确定

选用2mg/mL的克诺罗杆菌单抗5A8按喷量1.0μL/cm包被到硝酸纤维素膜上，作为T线；同时将原浓度为1.0mg/mL的二抗GXM按喷量1.0μL/cm也包被到硝酸纤维素膜上，作为C线，37℃烘箱干燥2小时。选用金标抗体喷量3.0μL/cm的胶体金结合垫。选择PH分别为1-2、3-4、5-6、11-12的表面活性剂S6(用NaOH和HCl调)浸泡样品垫，37℃烘箱烘干。将上述组分组装成试纸条，用pH7.4 0.05 M PBST(含1.5％ S17)缓冲液和不同浓度的阳性样本进行检测。

从表6可见，采用PH 3-4的样品垫较为合适。

表6、不同pH值的样品垫的显色结果

6、试纸条各指标描述

抗克诺罗杆菌抗体5A8原浓度12.08mg/ml，用普通稀释液稀释到2mg/ml作为T线，点到硝酸纤维素膜上，羊抗鼠二抗原浓度26.56mg/ml稀释到1.0mg/ml作为C线点到硝酸纤维素膜上。点好的卡放在25℃的干燥室干燥一夜。将单抗标记为标记量10、OD值25的金标溶液，选择喷量为3.0μL/cm点到聚酯膜上干燥的金标条，组合上pH3-4样品垫制成试剂条。

该免疫试纸条的结构如图2所示。

实施例4、试纸条应用

1、灵敏度测试

取克诺罗杆菌标准菌株ATCC 29544，接种5 mL肉汤37℃过夜培养，将菌液进行10倍梯度稀释，每个梯度各取1mL进行平板计数，剩余菌液无菌操作加入购买的牛奶，使细菌终浓度达到10¹～10⁸CFU/mL，取检样100mL加入已预热至44℃装有900mL缓冲蛋白胨水的锥形瓶中，用手缓缓地摇动至充分混匀，36℃±1℃培养18h±2h。将每个梯度的菌液取1mL进行胶体金试纸条检测，同时以缓冲蛋白胨水作为空白对照，确定本方法的灵敏度。

结果显示，试纸条检测灵敏度为10⁵CFU/ml。

2、特异性测试

取克诺罗杆菌标准菌株代表株C.sakazakii，ATCC 29544；C.malonaticus，DSM 18702；C.turicensis，DSM 18703；C.genomospecies 1，NCTC 9529；C.muytjensii，ATCC 51329；C.dublinensis，DSM 18705； C.dublinensis subsp.lausannensis，DSM 18706；C.dublinensis subsp.lactaridi，DSM 18707、分离菌株及其他阴性菌株包括沙门氏菌ATCC14028，克雷伯氏菌ATCC46114，沙雷氏菌ATCC33077，大肠杆菌ATCC25922，阴沟肠杆菌ATCC13047，枸橼酸杆菌ATCC8090，志贺氏菌ATCC51335，变形杆菌ATCC33420。上述菌株分别接种于5mL肉汤37℃过夜培养，取1mL进行胶体金试纸条检测，同时以缓冲蛋白胨水作为空白对照，确定胶体金试纸条检测特异性。

结果显示，试纸条仅对克诺罗杆菌检测为阳性，对其他细菌检测结果均为阴性，特异性非常理想，交叉反应性比例为0。

生物材料保藏

本发明筛选获得的小鼠杂交瘤细胞株5A8保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国北京)，保藏号CGMCC NO.7808；保藏日2013年6月25日。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种单克隆抗体，其是由保藏号为CGMCC NO.7808的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。

2.权利要求1所述的单克隆抗体的用途，用于制备特异性检测克诺罗杆菌的检测试剂盒。

3.一种杂交瘤细胞株，其在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏号是CGMCC NO.7808。

4.一种用于检测克诺罗杆菌的测试条，其特征在于，其包括固相载体，以及附着于所述固相载体上的权利要求1所述的单克隆抗体。

5.如权利要求4所述的测试条，其特征在于，其是免疫胶体金测试条。

6.一种制备包含权利要求1所述的单克隆抗体的免疫胶体金测试条的方法，其特征在于，所述方法包括：将权利要求1所述的单克隆抗体以1～4mg/mL的包被浓度点到硝酸纤维素膜上，羊抗鼠二抗以0.8-1.2mg/ml作为Control线点到硝酸纤维素膜上；干燥；将单抗标记为标记量10-11μg、OD值23-27的金标溶液，选择喷量为2.5-3.5μL/cm点到聚酯膜上干燥的金标条，组合上pH3-4样品垫制成试剂条。

7.一种检测克诺罗杆菌的试剂盒，其特征在于，其中包括权利要求1所述的单克隆抗体或权利要求3所述的杂交瘤细胞株。

8.如权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括：第二抗体，固相载体；较佳地，权利要求1所述的单克隆抗体包被于所述的固相载体；较佳的，所述的第二抗体还连接有标记物。

9.一种检测克诺罗杆菌的试剂盒，其特征在于，其中包括权利要求4或5所述的测试条。

10.一种检测克诺罗杆菌的方法，其特征在于，所述方法包括：利用权利要求1所述的单克隆抗体或权利要求4或5所述的测试条与待测样品进行反应，若反应阳性，则表明待测样品中包含克诺罗杆菌。