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Abstract

本发明公开了一段具有明显镇痛作用的多肽，属多肽。该多肽能应用于神经病理性疼痛镇痛。提供筛选该肽段的方法及其在神经病理性疼痛镇痛中的应用。所述肽段可干扰神经病理性疼痛(chronic constriction injury，CCI)小鼠前扣带回(anterior cingulate cortex，ACC)小窝蛋白‑1(Caveolin‑1，Cav‑1)与N‑甲基‑D‑天冬氨酸受体2B亚单位(N‑Methyl‑D‑aspartate receptor2B subunit，NMDA‑NR2B)相互作用介导的疼痛而发挥镇痛作用。

Description

一段具有明显镇痛作用的多肽
技术领域
本发明涉及一段多肽，尤其是涉及一段具有明显镇痛作用的多肽，该多肽能应用于神经病理性疼痛镇痛。
背景技术
神经病理性疼痛已被公认是慢性痛之“王”，是临床最顽固的且对现有镇痛药几乎都不敏感的一类痛，无论周围或中枢起源的神经病理性疼痛都会对个体和社会持续造成很大的负担，尤其是残疾率的增加、生产力和生活质量的下降以及持续增长的医疗卫生投入等方面。因此深入研究神经病理性疼痛发生、发展、维持的机制，可为该病痛的诊疗提供理论依据，为新药的研发寻找新的靶点。
越来越多的神经影像和电生理研究证实前扣带回(anterior cingulated cortex，ACC)参与了疼痛调节过程。无论是伤害性刺激还是被告知可能会有伤害性刺激，均能激活ACC脑区(Koyama,et.al.,Neuroreport1998；Rainville,et.al.,Science1997；Sikes,et.al.,J Neurophysiol1992)。ACC参与处理疼痛的不愉快感受并促进疼痛相关情感、认知和反应的抉择，参与痛觉情绪信息的编码，将痛的感觉和认知信息与情绪信息联合,从而形成完整的痛觉体验(Auvray,et.al.,Neurosci Biobehav Rev2010；Alexander,et.al.,NeuroImage2010)。在神经病理性疼痛动物ACC区EPSCs频率和振幅均增高(Li,et.al.,Science2010)。在CFA模型，ACC区突触前膜囊泡数量和递质释放均增多，而神经病理性疼痛模型动物ACC区突触前膜囊泡数量不增加仅递质释放增多。ACC区细胞因子IL-8和TNF-a能通过增加突触前膜递质的释放使突触传递增强而调节疼痛(Cu,et.al., Molecular Pain2012)。
小窝是细胞膜上的微结构域---膜筏的重要一种，主要有胆固醇、鞘脂、小窝蛋白组成，是多种信号分子聚集进行信号交易的平台。小窝蛋白-1是小窝蛋白的一种，是细胞膜表面小窝的标记蛋白(Sargiacomo,et.al.,Proc Natl Acad Sci U.S.A.1995),Cav1作为支架蛋白与多种信号分子组成信号分子复合物，参与信号转导、物质转运、细胞增殖等活动(Okamoto,J.Biol.Chem.1998)。Cav1可募集谷氨酸受体和多种神经营养因子受体锚定于细胞膜上而增强神经元信号转导，NMDA受体和BDNF受体就是这样，Cav1敲除小鼠NMDA受体和BDNF受体介导的信号通路中断，恢复其表达后相关信号通路也恢复，Cav1也可使神经元树突分支增多等(Head,et.al.,J.Biol.Chem.2011)。在CFA诱导的大鼠神经炎性痛中，CFA足底注射24h后，其背根神经节Cav1mRNA表达增高，48h后又降低(Fiza,Methods in Molecular Biology2010)。
ACC区是慢性疼痛调制的非常重要和关键脑区，对于其调控的具体分子机制还不清楚，信号分子总是通过支架蛋白组织在一起形成复杂的信号分子复合物，从而对细胞发挥精确、协调的功能调节。Cav-1是位于细胞膜信号交易活跃的微域---小窝上的主要蛋白(Lisanti,et.al.,Trends Cell Biol.1994；Couet,J.Biol.Chem.1997；Ostrom,Mol.Pharmacol2002)，能与多种信号分子形成复合物而对机体功能的调节发挥重要作用。我们已经证实神经病理性疼痛小鼠ACC区Cav-1表达增加，在ACC区定位注射靶向Cav-1的siRNA降低Cav-1的表达可缓解疼痛，采用慢病毒系统在ACC区过表达Cav-1可诱导疼痛，Cav-1的这种作用与其能使NR2B在神经元膜表面定位增加有关。于是我们根据文献报道的Cav-1和NR2B的蛋白质特性设计了一段多肽以干扰二者结合而达到减轻疼痛的目的。
Cav-1的82-101位氨基酸构成了它的缴手架区，是其与其它信号分子相互作用的关键部位，特异性结合芳香族氨基酸残基，含有芳香族氨基酸的多肽可与体内固有与其相互作用的信号分子竞争结合其缴手架区，从而抑制Cav-1与信号分子的结合。文献报道Cav-1与NR2B有相互结合，我们用免疫共沉淀方法也同样检测到了二者的相互结合。而NR2B发挥功能主要依靠其碳末端。
发明内容
本发明的第一个目的在于，提供一段具有镇痛作用的多肽。
本发明的另一个目的在于，提供Cav-1作为治疗神经病理性疼痛的新靶点。
提供该多肽在神经病理性疼痛镇痛中的应用。
一段具有明显镇痛作用的多肽，含有芳香族氨基酸。
所述的多肽，其氨基酸序列为：rrefdeielayrrrp，其中f为苯丙氨酸(Phenylalanine)、y为酪氨酸(Tyrosine)。
所述的多肽序列的应用方法是定位注射在神经病理性疼痛小鼠的前扣带回。
所述的多肽的应用是其能够干扰神经病理性疼痛小鼠前扣带回小窝蛋白-1与N-甲基-D-天冬氨酸受体2B亚单位的相互作用，从而使N-甲基-D-天冬氨酸受体2B亚单位在神经元膜上定位减少而发挥镇痛作用的。
所述的多肽的应用是该小肽与N-甲基-D-天冬氨酸受体2B亚单位竞争结合小窝蛋白-1的缴手架区，从而使小窝蛋白-1与N-甲基-D-天冬氨酸受体2B亚单位的结合减少，在神经元膜上定位减少。
所述多肽能明显缓解坐骨神经慢性压迫引起的神经病理性疼痛，具体的：该多肽能干扰CCI小鼠ACC区Cav-1与NR2B相互作用,使NR2B在神经元膜上 定位减少，从而使NR2B相关信号通路不能完成，达到缓解疼痛的目的。
附图说明：
图1A是显示肽段及对照肽段序列(A为所述肽段、B为将所述肽段芳香族氨基酸突变后肽段、C为在NR2B碳末端随机选择含芳香族氨基酸肽段)。
图1B、C、D分别显示肽段A、B、C对CCI小鼠热痛觉行为学的影响(用热缩爪潜伏期表示)。
图2是形态学显示各肽段对CCI小鼠ACC区Cav-1与NR2B相互作用的影响。
图3是免疫共沉淀方法显示各肽段对CCI小鼠ACC区Cav-1与NR2B相互作用的影响。
具体实施方式：
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
本发明中使用的试剂：
肽段合成：上海波泰生物科技有限公司
rabbit anti-t-Cav-1(sc894):Santa Cruz Biotechnology；
goat anti-NR2B(sc-1469):Santa Cruz Biotechnology；
Alexa488Donkey Anti-Goat IgG(H+L)(A11055):Molecular Probes；
Alexa Fluor546Donkey Anti-Rabbit IgG)(A10040):Molecular Probes；
Catch andReversible Immunoprecipitation System(17-500):Mlippore公司；
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate(34078):Pierce公司；
PVDF膜：Mlippore公司；
驴血清：solarbio公司；
无特别注明外，其它化学试剂均购自sigma公司。
实验动物：雄性昆明种小鼠，清洁级，20～25g，由徐州医学院实验动物中心提供
我们在生物信息学网站http://hits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan预测到NR2B碳末端与其它分子相互作用的模体序列位于其1099-1113(rrefdeielayrrrp)位氨基酸，而且我们利用BioEdit软件对NR2B氨基酸序列进行疏水性分析显示1099-1113位氨基酸具有亲水性。于是我们人工合成了NR2B的1099-1113位氨基酸残基即肽段A，将其中的f突变为a、y突变为g，得到对照肽段B序列为:rreadeielagrrrp，在NR2B碳末端随机选择的含有芳香族氨基酸的肽段C序列为：rrqhsydtfvdl。如图1A所示。
神经病理性疼痛(CCI)模型的制备：
根据Bennett和Xie描述的方法实施CCI手术：小鼠用10％的水合氯醛(0.3ml/100g,i.p.)，暴露右侧坐骨神经中上段(本研究均是结扎右侧坐骨神经)，在坐骨神经分叉处用5-0号丝线结扎三道(间距1mm)。对照组(sham)只暴露不结扎。逐层缝合切口，伤口用抗生素处理。以往的研究显示CCI引起的疼痛至少可持续数月。
热痛觉过敏测定：
在CCI及sham组7天小鼠ACC区分别定位注射肽段A、B、C(1.0μg/0.5μl)，在注射0.5h、1h、2h、4h进行行为学检测，方法如下：将有机玻璃箱置于3mm厚的玻璃板上，按Hargreaves法用热辐射刺激仪照射大鼠足底紧贴玻璃板部位。 记录照射开始至小鼠出现抬足时间(截止时间为20s)，即缩爪潜伏期(paw withdrawal latency)，缩爪潜伏期越长说明疼痛缓解作用越好。每只动物测定3次，取其平均值，每次测定间隔5min。结果显示肽段A在注射后1h具有明显的缓解疼痛的作用，如图1B所示。肽段B、C不具有缓解疼痛的作用，如图1C、D所示。
免疫荧光：将各组动物用10％水合氯醛(0.3ml/100g,i.p.)麻醉，开胸，经左心室向升主动脉快速灌注37℃生理盐水30-50ml，接着灌注0℃-4℃的4％多聚甲醛液，先快后慢于1h内灌注完。为切片方便，固定时将实验动物拉直，夹闭腹主动脉，减少固定液用量和节约时间，灌注结束后断头取脑，去除小脑和嗅球，于4％多聚甲醛液后固定6-8h。②蔗糖脱水：将全脑依次移入含20％和30％蔗糖的磷酸盐缓冲液中进行梯度脱水，置于4℃冰箱中至组织块沉底，此操作可减少快速冷冻时冰晶的形成，提高切片质量。③行冰冻切片，每片25μm。④将切好的脑片用0.01M的PBS在摇床上洗三遍(5min/遍)；封闭过夜。再用0.01M PBS洗三遍(5min/遍)。加一抗，4℃，48-72h。用0.01M PBS洗三遍(5min/遍)。加二抗，室温，2h。0.01MPBS洗三遍(5min/遍)。封片，拍照。
由图2结果可知：CCI小鼠NR2B和t-Cav-1在ACC区胞膜上定位与sham组相比明显增多，而肽段A可使NR2B在胞膜上定位减少，我们推测肽段A是通过干扰NR2B和t-Cav-1结合从而使NR2B在胞膜上定位减少而缓解疼痛。
免疫共沉淀：
小鼠ACC区脑组织蛋白的提取：
将小鼠直接断头，冰上剥离脑组织，取bregma前2.34mm，后0.22mm，旁开0.6mm的大脑皮层，即是我们关注的ACC区脑组织，每只小鼠一侧ACC区脑组织加入80μl全细胞裂解液，行超声破碎，置冰上30分钟，以12000rpm离 心15min，上清液为全细胞裂解液，测定蛋白浓度后分装备用。
共沉淀操作按照Catch andReversible Immunoprecipitation System(17-500)说明书进行。
Western blot检测按常规步骤进行。
由图3结果进一步证明肽段A是通过干扰NR2B和t-Cav-1结合使NR2B在胞膜上定位减少而缓解疼痛。
综上所述：本发明可干扰神经病理性疼痛(chronic constriction injury，CCI)小鼠前扣带回(anterior cingulate cortex，ACC)小窝蛋白-1(Caveolin-1，Cav-1)与N-甲基-D-天冬氨酸受体2B亚单位(N-Methyl-D-aspartate receptor2Bsubunit，NMDA-NR2B)相互作用介导的疼痛而发挥镇痛作用。

Claims (1)

1.一段具有明显镇痛作用的多肽，其特征在于含有芳香族氨基酸，其氨基酸序列为：RREFDEIELAYRRRP，其中F为苯丙氨酸、Y为酪氨酸。
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