CN103992983B - 一种鲤鱼肝损伤模型及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的是提供一种用于筛选保肝药物的鲤鱼肝损伤模型及其应用，本发明通过2，3，7，8‑四氯二苯‑对‑二恶英对鲤鱼肝组织切片进行处理，建立鲤鱼肝损伤模型，再用检测药物处理肝损伤模型，判断药物对鲤鱼肝损伤的治疗效果。本发明所建立的鲤鱼肝损伤模型来源一致、培养环境可控、可重复性强，可满足多种药物的同批次筛选，周期短、大大节约药物筛选所需时间和成本。

Description

一种鲤鱼肝损伤模型及其应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种鲤鱼肝损伤模型，及将该模型应用于筛选保肝药物。
背景技术
2，3，7，8-四氯二苯-对-二恶英(TCDD)是一种毒性很强的化合物，主要来源于工业垃圾以及农药滥用等，它不仅给水产和畜牧业带来巨大的经济损失，对生态平衡和人类健康也构成严重的威胁，研究二恶英的毒性机制已经成为当前科学研究热点之一，但是目前关于二噁英的毒性机制研究方面相关报道还比少。TCDD是一种对鱼产生负效应的稳定持久环境污染物，鱼对水污染特别敏感，鱼组织吸收了污染物会影响其许多生理和生化作用。通常情况下，TCDD是在肝中进行生物转化，所以肝是TCDD的主要储存部位和靶器官。
精密肝切片技术是一种新兴的技术手段，既保留了肝细胞的功能特点，又维持了组织完整性，使该系统更接近在体情况。精密肝切片培养系统在预测药物的体内代谢和毒性方面比其他体外方法如混合肝细胞培养有更多的优越性。对水产动物而言，国内外没有应用鱼类肝精密组织切片损伤模型来筛选鱼类保肝药物的报道，从而制约了鱼类保肝药物的研究和开发。将精密肝切片技术应用于新鱼药开发方面有很大研究前景，对于研究药物代谢分子机制及临床用药也具有很好的指导意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种鲤鱼肝损伤模型，该模型建立方法重复性强、可满足多种药物的同批次筛选、周期短。
一种鲤鱼肝损伤模型，由以下步骤制得：
步骤1，取鲤鱼肝组织进行肝切片；
步骤2，将步骤1所得肝切片用含浓度为0.1～0.6μg/L的2，3，7，8-四氯二苯-对-二恶英的L-15培养基，在5％CO2、27℃条件下培养造模3～4小时；
步骤3，清洗掉2，3，7，8-四氯二苯-对-二恶英，得到鲤鱼肝切片损伤模型。
作为上述发明的进一步改进，步骤1中鲤鱼肝组织取出后置于预先以氧饱和的冰浴的L-15培养液中，用低熔点琼脂糖进行包被处理。
作为上述发明的进一步改进，步骤1中肝切片的厚度为300μm。
作为上述发明的进一步改进，步骤2所用的L-15培养基中，3，7，8-四氯二苯-对-二恶英的浓度为0.3μg/L。
资料显示，TCDD对小龙虾的半数致死量为0.30μg/kg、对鳟鱼的半数致死量为0.171μg/kg，而在鲤鱼上面未见有TCDD半数致死量相关报道。通过试验中测定切片活力ATP发现，当TCDD浓度达到0.6μg/L时，切片活力极显著下降，引起了切片重度损伤，这可能会造成切片中组织的死亡，从而对后面的给药处理的恢复效果造成严重影响，因此没有将浓度超过0.6μg/L。当TCDD浓度为0.3μg/L时，TCDD实验组精密肝切片培养上清液中的GPT、GOT、SOD、MDA水平和肝切片匀浆液中LDH均有极显著的升高，ATP活性出现极显著降低，精密肝切片受到了明显损伤。因此，0.3μg/L为造模的最佳浓度。
上述鲤鱼肝损伤模型在筛选鱼类保肝药物中的应用。
本发明与现有技术相比，其显著优点在于：第一，来源一致、培养环境可控，因此可重复性强；第二，切片数量可根据需要进行分离，可满足多种药物的同批次筛选，可比性强；第三，周期短，可大大节约药物筛选所需时间和成本。
具体实施方式
实施例1
鲤鱼肝损伤模型的建立
选取重量为900g左右实验鲤鱼用100mg/L的MS-222进行麻醉，然后将麻醉好的鲤鱼放入超净工作台无菌条件下取肝脏，置于预先以氧饱和的冰浴的L-15培养液中，选取约4mm×4mm肝组织块用低熔点琼脂糖进行包被处理，将包被好的肝组织块放入含L-15培养液的切片机标本槽中进行切片，切片厚度为300μm，持续通氧。切片完成后，选取完整切片置于含1mL L-15培养基(含10％新生小牛血清、2.5μg/mL两性霉素、0.1mg/mL链霉素、100IU/mL青霉素，pH7.0)的12孔板中，6片/孔，放入5％CO2、27℃培养箱中振荡培养。
将所得肝切片换用含TCDD浓度为0、0.1、0.2、0.3、0.6μg/L的L-15培养基，在5％CO2、27℃培养箱中振荡培养，培养3h后留取上清培养基，并收集精密肝切片(用无菌镊子夹取肝组织切片)制备组织匀浆(将取出的肝组织切片用PBS冲洗2遍，对精密肝切片进行称重，称重结束后加入0.9％生理盐水进行研磨，肝组织与生理盐水比例为1:9，制成10％的组织匀浆，3000r/min离心10min，留取上清液)，分别测定组织匀浆中乳酸脱氢酶(LDH)、三磷酸腺苷(ATP)和上清培养液中谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)指标。
表1不同浓度TCDD对鲤鱼肝切片培养液中GPT、GOT、SOD和MDA影响(平均值±S.D.，n＝6)
表2不同浓度TCDD对鲤鱼肝切片组织匀浆中LDH和ATP影响(平均值±S.D.，n＝6)
与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。
与空白对照组相比较，TCDD组精密肝切片培养上清液中的GPT、GOT、SOD、MDA水平和肝切片匀浆液中LDH有所升高、ATP活性出现降低，表明精密肝切片受到了损伤。当TCDD浓度为0.3μg/L时，TCDD组精密肝切片培养上清液中的GPT、GOT、SOD、MDA水平和肝切片匀浆液中LDH有极显著的升高，ATP活性出现极显著降低，表明精密肝切片受到了明显损伤，说明用TCDD诱导造成的精密肝切片损伤模型是成功的。
实施例2
鱼类保肝药物筛选实验
步骤1，用振动切片机制备鲤鱼精密肝组织切片，切片厚度为300μm；
步骤2，将步骤1所得精密肝组织切片进行随机分组，分为正常对照组、TCDD模型对照组和受试药物组，其中受试药物组包括甘草多糖高、中、低剂量组(200、400、800μg/mL)和甘草酸高、中、低剂量组(6.25、12.5、25μg/mL)，正常对照组、TCDD模型对照组和受试药物的高、中、低剂量组的每组为6个肝组织切片；
步骤3，将正常对照组和TCDD模型组用L-15培养基在5％CO2、27℃培养箱中振荡培养，受试药物组用含高、中、低剂量(200、400、800μg/mL)甘草多糖和高、中、低剂量(6.25、12.5、25μg/mL)甘草酸的L-15培养基在5％CO2、27℃培养箱中振荡培养；
步骤4，3小时后弃掉上清培养基，正常对照组换用新鲜L-15培养基、模型组和受试药物组加入含0.3μg/L TCDD的L-15培养基在5％CO2、27℃培养箱中振荡培养，培养3h后留取上清培养基，并收集精密肝切片制备组织匀浆，分别测定组织匀浆中乳酸脱氢酶(LDH)、三磷酸腺苷(ATP)和上清培养液中谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)指标。
表3不同浓度药物对TCDD致鲤鱼精密肝切片损伤培养液中GPT、GOT、SOD和MDA影响(平均值±S.D.，n＝6)
表4不同浓度药物对TCDD致鲤鱼精密肝切片损伤匀浆液中LDH影响(平均值±S.D.，n＝6)
与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。
与正常对照组相比较，TCDD模型对照组精密肝切片培养上清液中的GPT、GOT、SOD、MDA水平和肝切片匀浆液中LDH有极显著的升高(P<0.01)，ATP活性出现极显著降低(P<0.01)，表明精密肝切片受到了明显损伤，说明用TCDD诱导造成的精密肝切片损伤模型是成功的。而在TCDD造模后，用不同浓度的甘草多糖和甘草酸与精密肝切片共培养3小时，则能显著降低肝细胞培养上清中的GPT、GOT、SOD、MDA和LDH水平(P<0.01)，表明甘草多糖和甘草酸都具有抗TCDD诱导精密肝切片损伤的功效，同时也表明本发明所提供的用精密肝切片损伤模型来筛选鱼类保肝药物的方法是切实可行的。

Claims (3)

1.一种鲤鱼肝损伤模型，其特征在于：由以下步骤制得：
步骤1，取鲤鱼肝组织进行肝切片；
步骤2，将步骤1所得肝切片用含浓度为0.1～0.6µg/L的2，3，7，8-四氯二苯-对-二恶英的L-15培养基，在5%CO2、27℃条件下培养造模3～4小时；
步骤3，清洗掉2，3，7，8-四氯二苯-对-二恶英，得到鲤鱼肝切片损伤模型；
其中，步骤1中鲤鱼肝组织取出后置于预先以氧饱和的冰浴的L-15培养液中，用低熔点琼脂糖进行包被处理；步骤1中肝切片的厚度为300μm。
2.根据权利要求1所述的鲤鱼肝损伤模型，其特征在于：步骤2所用的L-15培养基中，3，7，8-四氯二苯-对-二恶英的浓度为0.3µg/L。
3.权利要求1所述的鲤鱼肝损伤模型在筛选鱼类保肝药物中的应用。
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