CN103992982A

CN103992982A - 骨髓细胞用于长期培养胰腺胰岛细胞的用途

Info

Publication number: CN103992982A
Application number: CN201410050889.4A
Authority: CN
Inventors: 罗履广
Original assignee: Roger Williams General Hospital
Current assignee: Roger Williams General Hospital
Priority date: 2006-11-21
Filing date: 2007-11-20
Publication date: 2014-08-20
Also published as: WO2008063640A3; JP2010509936A; JP5474559B2; AU2007321983B2; US20100143306A1; EP2092057A4; CA2670289A1; WO2008063640A2; CN101652470A; EP2092057B1; EP2092057A2; AU2007321983A1

Abstract

业已表明，骨髓细胞可用于在一定时间内持久维持共培养的胰岛β细胞的存活力、结构和/或功能。还发现骨髓细胞在降低炎性细胞因子释放和减少凋亡的同时促进β细胞生长。而且，已表明与骨髓细胞共培养的胰岛细胞保持胰岛素响应功能，并在糖尿病小鼠模型的胰岛细胞移植中起作用，以恢复正常的胰岛素分泌。脐血细胞和分离的外周CD34+血细胞不能支持β胰岛细胞生长或提高存活。

Description

骨髓细胞用于长期培养胰腺胰岛细胞的用途

本申请是2007年11月20日提交的题为“骨髓细胞用于长期培养胰腺胰岛细胞的用途”的PCT／US2007／024258号发明专利申请的分案申请，原申请进入中国国家阶段获得的国家申请号为200780049872.5。

相关申请的参考

本申请要求保护2006年11月21日申请的美国临时专利申请序号60／860,637的优先权，该临时专利申请整体在此引入作为参考。

关于联邦支持研究的声明

本发明经国立卫生研究所(NIH)资助号P20RR018757得到美国政府支持。因此，美国政府拥有本发明的一定权益。

发明领域

本发明一般来说涉及胰岛细胞培养领域。更具体地说，本发明涉及骨髓细胞用于在移植前长期培养并可能扩增胰岛细胞的用途。本发明还包括在骨髓细胞存在下培养的胰岛细胞在患者中体内替代人胰岛功能的用途。

发明背景

糖尿病是一个重大且病例不断增长的全球性健康问题[1]。基于标准胰岛素的治疗方案尽管管理血糖水平，但不是治愈性的，患者仍遭受该病的许多长期并发症[2，3]。胰腺移植可治愈该病，但受限于组织可获得性和对免疫抑制疗法的响应[4]。为了保持胰岛细胞的存活力，需要由供体相对快速地收集胰腺。标准移植免疫抑制方案对胰腺移植物并非总是有效。而且，免疫抑制疗法可导致对肾脏的进一步伤害，这常常使需要胰腺移植的患者的功能受损。或者，胰岛β细胞移植可能有效，且几乎不需要猛烈的免疫抑制方案；然而，胰岛细胞的可周性不如胰腺[5]。一次成功的胰岛细胞移植经常需要由2个或3个供体收集细胞，这进一步限制了可通过该方法治疗的个体的数目。分离用

于移植的胰岛β细胞也是重要的。

在胰岛的分离、储存和运输过程中经历的事件与导致胰岛功能丧失并限制胰岛移植对糖尿病患者的治疗潜力的细胞死亡相关。采用β细胞胰岛移植方案的关键问题涉及在体外或体内难以保持存活的胰岛以及不能通过体外培养扩增胰岛组织。研究已表明，在由供体收获胰腺后尽快进行的由胰腺收获之间没有培养细胞时，胰岛细胞移植是最成功的。不出意料的是，在进行大部分移植的中心的移植也是最成功的。由于这种强有力的培养环境的缺乏，所以用于胰岛细胞移植的供体必须在组织收获时邻近较大的移植中心，受体必须生活在较大的移植中心附近，经常长时间等待一个以上的供体。

发明概述

本发明包括持续维持培养中的胰岛β细胞存活力、结构和／或功能的方法。所述方法包括将胰岛β细胞与骨髓细胞一起培养。发现骨髓细胞在降低炎性细胞因子释放和凋亡的同时，促进胰岛β细胞的生长和存活力，并改善β胰岛细胞的功能和形态。已表明胰岛细胞保持胰岛β细胞功能，这通过基础和诱导的胰岛素释放证实。脐血细胞和分离的外周CD34+血细胞不能支持β胰岛细胞生长或增加存活。

本发明包括将胰岛β细胞与多种骨髓细胞一起培养以扩增培养的胰岛β细胞的方法，其包括降低共培养的凋亡的方法。发现骨髓细胞至少部分通过减少凋亡促进胰岛β细胞生长，也通过增加胰岛β细胞数促进胰岛β细胞生长。扩增胰岛细胞的能力是降低单个受体需要多个供体所必需的，从而潜在地允许广泛应用胰岛β细胞移植。

本发明包括将胰岛β细胞与多种骨髓细胞一起培养以促进培养中的胰岛聚集的方法。骨髓细胞刺激胰岛聚集的过程。

本发明进一步包括降低培养胰岛β细胞的细胞因子和其它炎性调节物的释放的方法。所述方法包括将胰岛β细胞与骨髓细胞一起培养。与没有骨髓细胞时培养的胰岛β细胞相比，胰岛β细胞与骨髓细胞的共培养降低炎性细胞因子如白介素(IL)-1β的释放。这可能导致患者响应于胰岛β细胞移植的炎性反应下降。

本发明包括将胰岛β细胞与多种骨髓细胞一起培养以增加内分泌细胞特异性基因(包括胰腺特异性转录因子)的基因表达的方法。所述因子包括内分泌细胞特异性基因GCG(胰高血糖素，α-细胞基因)、INS(胰岛素，β-细胞基因)和SST(促生长素抑制素，γ-细胞基因)；以及β细胞胰腺和十二指肠同源框1转录因子(PDX1或IPF1)、神经元素3(NGN3)、成对盒基因6(PAX6)、胰岛-1(ISL1)、v-maf肌肉腱膜纤维肉瘤癌基因同源物A(MAFa)和Mist1。所述方法包括将胰岛β细胞与骨髓细胞一起培养。所述方法进一步包括增加NGN3的表达，以增加β细胞再生。所述方法进一步包括通过增加PDX1、IPF1、NGN3、PAX6、ISL1和MAFa中至少一种的表达促进β细胞的长期存活。所述方法还包括通过增加Mist1的表达促进新胰腺组织组织化的方法。

本发明包括治疗需要胰岛细胞移植的个体的方法，其包括：获得胰岛β细胞，在骨髓细胞存在下培养胰岛细胞，并将合并的胰岛β细胞和骨髓细胞植入需要治疗的患者中。该方法包括移植骨髓，以通过直接移植在骨髓(优选自体骨髓)存在下培养的胰岛细胞，在需要治疗的患者体内改善和／或替代胰腺细胞功能，改善被降低的或丧失的胰腺细胞功能。需要胰岛β细胞移植的患者可为罹患I型或II型糖尿病的个体。糖尿病可为由于疾病或由于至少部分胰腺切除(如胰腺癌)而损害胰腺引起的。本发明可进一步包括选择或鉴定需要胰岛细胞移植或者需要改善或替代胰岛细胞功能的患者。本发明还可以包括监测患者的改善的胰腺活性。

本发明进一步包括实施本发明方法的药盒。所述药盒可以包括例如骨髓细胞或如何获得骨髓细胞的说明书，以及如何通过本发明的方法培养胰腺细胞的说明书。药盒可进一步包括在骨髓细胞存在下培养胰岛细胞的试剂，或者测定与骨髓细胞一起培养生长的胰岛细胞的存活力、功能和／或特征的试剂。

附图简述

图1a-1d.有或没有骨髓细胞培养6天或156天的胰岛细胞的相差显微镜检查(图像放大倍数20x)。图1a显示了单独培养6天的胰岛β细胞。图1b显示了与骨髓细胞一起培养6天的胰岛β细胞。图1c显示了单独培养156天的胰岛β细胞。图1d显示了与骨髓细胞一起培养156天的胰岛β细胞。

图2a-c.使用细胞类型特异性标记进行的胰岛β细胞和骨髓细胞的免疫荧光和免疫组织化学分析。图2a显示了采用胰岛素原抗体(由箭头指示)、CD45(骨髓细胞，由细箭头指示)(下图)的荧光免疫组织化学染色和采用DAPI的核染色。图2b显示了对胰岛素原(由粗箭头指示)和CD45(由细箭头指示)的免疫组织化学染色。(图像放大倍数x40)。图2c为柱形图，显示了与第28天的骨髓-胰岛细胞共培养物相比单独的胰岛培养物中的胰岛素原阳性细胞数。(*=p<0.01，n=6)。

图3.在培养153天时使用细胞类型特异性标记进行的胰岛α和β细胞的免疫荧光分析。图像为相差显微镜检查(左图)和在胰岛表面(中图)和中间(右图)的共聚焦显微镜检查。α细胞用胰高血糖素抗体染色(由亮箭头指示)，β细胞用胰岛素原抗体染色(由暗箭头指示)。

图4a-b.有或没有骨髓细胞一起生长的胰岛β细胞的功能分析。图4a为经过一系列时间点的基础胰岛素分泌图。图4b为经过一系列时间点一直到第204天响应于高葡萄糖的胰岛素释放图。(*=p<0.01，n=6)。

图5a-f.培养胰岛的生长。图5a为测定的示意图。图5b显示了在不存在(上图)或存在(下图)骨髓细胞的情况下于格栅上生长的胰岛。图5c为定量培养胰岛生长的柱形图。(*=p<0.05，n=6)。图5d显示了在新生(左图)或重建(右图，超过13个月)过程中与骨髓细胞一起在栅格上生长的胰岛(放大倍数5x)。图5e为在图5d的右图中显示的胰岛由培养的第322天至第406天的胰岛素释放图。图5f为在第360天、第369天和第399天响应于高葡萄糖刺激的胰岛素分泌图。仅胰岛的培养物于相同的时间点没有检测到胰岛素分泌。

图6.使用细胞类型特异性标记于第153天进行的有或没有骨髓细胞的胰岛β细胞培养物的形态和免疫荧光分析。左图图像为有(上图)或没有(下图)骨髓细胞一起培养的胰岛β细胞的相差显微镜检查。右图图像为采用Ki67和胰岛素原(由箭头指示)的抗体的荧光免疫组织化学。(图像放大倍数x20)。

图7a-e.使用细胞类型特异性标记于第190天进行的与骨髓细胞一起的胰岛β细胞培养物的形态、免疫荧光和功能性分析。图7a为由与骨髓细胞培养190天的胰岛产生的组织的图像，条棒代表1cm。所述组织为约1.8cm长，具有清晰的3维结构。图7b和c为与图7a中所示相仿的冷冻组织的5μm横断切片。图7b显示了采用苏木精和曙红的组织化学染色，以揭示组织结构。箭头指示在切片中出现的被多孔支架样组织环绕的胰岛样结构。图7c，采用抗人胰岛素原抗体的免疫荧光染色(由b箭头指示)、采用抗人胰高血糖素抗体的细胞(由箭头a指示)和核染色DAPI。图7d为柱形图，其显示了没有(I)或有(B+I)骨髓细胞的培养胰岛β细胞于第190天的基线胰岛素释放。图7e显示没有(I)或有(B+I)骨髓细胞的培养胰岛β细胞于第190天响应于葡萄糖刺激的胰岛素释放的柱形图。(p<0.05，相对于只有胰岛的培养物。图像放大倍数20x)。

图8.在共培养的前48小时过程中使用活细胞膜染料进行的胰岛β细胞和骨髓细胞的免疫荧光分析。将用PKI-26GL标记的人骨髓细胞与用PK-2GL染色的胰岛共培养，并用对核染色特异性的抗胰岛素原抗体和DAPI进行免疫组织化学染色，以研究培养中骨髓细胞和胰岛β细胞之间的相互作用。图8a显示了7小时后的细胞。图8b显示了24小时后的细胞。图8c显示了48小时后的细胞。图8d显示了96小时后的细胞。(图像放大倍数x20，箭头指示骨髓和与β细胞一起的骨髓共定位)。

图9a-j.在将骨髓细胞和胰岛β细胞引入共培养后以20分钟间隔记录时间间隔显微镜检查的图像。分别用PKH26和PKH2单独地标记骨髓细胞和胰岛细胞，然后一起培养。图像a-j为96小时培养当中的一幕。粗箭头指示骨髓，细箭头指示胰岛中的骨髓释放物质。(图像放大倍数x20)。

图10a-f.记录在栅格上彼此迁移(图10a-d)并最终融合(图10e)的3个胰岛细胞的时间间隔显微镜检查的图像。图10f得自其中标记骨髓细胞的单独实验，该实验显示了骨髓细胞迁移入一体化的胰岛中。

图11.使用细胞类型特异性标记于不同时间点进行的胰岛β细胞与骨髓细胞共培养物的培养基中的IL-1β水平。图11a图示了培养物中的IL-1β释放。图11b图示了在高葡萄糖(20mM)刺激后在培养物中的IL-13释放。(n=6，*=p<0.001)。

图12.使用细胞类型特异性标记于特定时间点进行的与骨髓细胞一起的胰岛β细胞共培养物的凋亡的免疫荧光分析。图12a显示了依据(TUNEL)测定评价在没有(I)或有(B+I)骨髓细胞的培养物中的胰岛β细胞凋亡的免疫荧光分析。用胰岛素原抗体于7小时(7H)、48小时(48H)和3周(3W)培养期进行荧光免疫组织化学染色指示胰岛β细胞。图11b为在所示时间以百分率定量凋亡细胞对总β细胞的图示。(n=24，*=p<0.01)。

图13.支持培养中的胰岛β细胞功能的非骨髓细胞类型的分析。图13为单独地或与脐血细胞、外周血细胞或外周血CD34+细胞共培养的胰岛β细胞在31天时间段内的胰岛素释放图。

图14.在糖尿病小鼠模型体内评价共培养的胰岛β细胞和骨髓细胞。图14为在用单独培养的胰岛β细胞或与骨髓细胞共培养的胰岛β细胞移植的小鼠的血糖水平图。

图15a-f.骨髓促进胰岛β细胞迁移的体外证实。胰岛聚集形成的时间间隔显微镜检查图像。图15a-e，放大倍数5x。在图15f中的胰岛表面上的暗色指示骨髓细胞迁移入胰岛中。(放大倍数20x)。

图16a-c.图16a为在没有或有骨髓细胞一起培养的胰岛β细胞中的GCG和INS表达水平变化倍数图。图16b为在没有或有骨髓细胞一起培养的胰岛β细胞中的SST和NGN3表达水平变化倍数图。图16c在没有或有骨髓细胞一起生长的胰岛β细胞中的IPF1、ISL1、PAX6、MIST1和MAFA表达水平变化倍数图。

定义

“持续期”或“持续时间段”被理解为这样的时间段：其足以保存胰岛β细胞，使得胰岛β细胞的胰岛素释放功能保留，优选伴有胰岛组织生长。在某些实施方案中，所述持续期为至少约30天，优选至少约60天，更优选至少约90天，再更优选至少约120天。

“胰岛β细胞功能”可通过众多测定中的任一种定义，所述测定包括但不限于形态测定、免疫组织化学测定和功能测定。在优选的实施方案中，胰岛β细胞功能通过静息细胞中或响应于葡萄糖的胰岛素释放测定的活性定义。在更优选的实施方案中，胰岛β细胞被定义为具有在约20-100个胰岛中在30分钟内(响应于采用20μM葡萄糖的处理)释放至少约150单位的胰岛素(IEQ)的功能。确切测定胰岛细胞功能的方法不是本发明的限制因素。

“增加的胰岛β细胞存活力”被理解为在单个时间点或随时间变化观察到的较低的细胞死亡率，优选与其中胰岛β细胞在没有骨髓细胞的情况下培养的对照培养物相比。依据本领域技术人员已知的方法(例如锥虫蓝染色排除)测定活细胞数，以鉴定活细胞，并使用血细胞计数器进行细胞计数，以确定在特定面积或容量中的活细胞数。也可以使用众多市售可得的凋亡测定或通过本领域技术人员已知的方法测定细胞存活力。与对照样品相比样品中的凋亡细胞百分率较低表明胰岛β细胞存活力增加。凋亡测定可与免疫组织化学染色组合，以证实胰岛β细胞的一致性。测定胰岛β细胞存活力的具体方法不是本发明的限制因素。

本文所理解的“胰岛”为在胰腺中存在的细胞聚簇，其分泌胰岛素和其它激素，并形成器官的内分泌部分，有时被称为郎格罕氏岛。胰岛占胰腺质量的约1-2％。在健康成人胰腺中有约100万个胰岛，其在整个器官中均匀分布，它们的合并重量为1-1.5克。每个胰岛均含有约1000个细胞，直径为50-500μm。产胰岛素的β细胞占胰岛细胞的约65-80％，释放胰高血糖素的α细胞占胰岛细胞的约15-20％。胰岛细胞还包括产促生长素抑制素的δ细胞(约3-10％)和含胰腺多肽的PP细胞(1％)。

“获得细胞”在本文被理解为制备、购买或以其它方式获得细胞。

在“胰岛β细胞扩增”中的术语“扩增”被理解为随着时间推移增加培养物的存活的和／或功能性的胰岛β细胞的数量。扩增可通过促进既有的胰岛β细胞中的细胞分裂或骨髓细胞转变为胰岛细胞或这二者而发生。

术语“(在)培养物中”或“培养”或“(在)培养中”可被理解为包括在适宜的温度、CO₂和营养物条件下细胞在例如有盖培养皿中的生长。细胞例如可在诸如来自动物、植物或海藻的天然或人工蛋白基质存在下培养。在适宜的上下文中，培养例如可被理解为细胞在非天然条件下的生长。例如，细胞可在植入诸如小鼠的动物中的培养生长，包括在动物的特定器官中的培养生长，或在转移入动物之前在离体器官培养中培养生长。

在“保留／保持胰岛β细胞功能”中的术语“保留”或“保持”被理解为包括与没有骨髓细胞时培养的胰岛β细胞相比胰岛β细胞存活力增加，和／或胰岛β细胞功能改善，和／或胰岛β细胞形态改善。

术语“患者”是指活体生物。在某些实施方案中，活体生物为动物。在某些优选的实施方案中，患者为哺乳动物。在某些实施方案中，患者为驯养的哺乳动物。在某些实施方案中，患者为人。患者包括人、猴、狗、猫、小鼠、大鼠、牛、马、山羊和绵羊。所述患者可被诊断为患有糖尿病。在其它实施方案中，所述患者已被诊断为具有一些其它胰腺疾病。

术语“选择患者”，或“鉴定患者”被理解为基于具体特征选择混合的个体群体中的一个或多个成员，所述具体特征包括但不限于体症、依据诊断方法确定的临床特征。

术语“监测患者”被理解为在植入胰岛细胞之后，优选在植入胰岛细胞之前和之后观察患者的改变的胰岛细胞功能，优选改善的胰岛细胞功能。

本文提供的范围被理解为所述范围内所有值的简略表达。例如，1-50秒的时间被理解为包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50秒。

除非另有说明或由上下文显而易见，否则本文使用的术语“或”被理解为是包括端点的。

除非另有说明或由上下文显而易见，否则本文使用的术语“一个”、“一种”、“所述”和“该”被理解为是单数或复数。

发明详述和优选的实施方案

在本研究中，研究同种异体骨髓在体外支持供体人胰岛的内分泌功能的能力。已表明人胰岛β细胞和同种异体骨髓的共培养增加胰岛存活和功能，最后形成的新胰腺内分泌组织能够维持微环境，以保持胰岛结构和β细胞功能。

已表明骨髓细胞能够在降低胰岛细胞的炎性细胞因子如IL-1β释放的同时刺激胰腺内分泌组织生长。与骨髓细胞共培养还减少胰岛细胞凋亡。最终表明骨髓细胞在长期培养(超过13个月)下将人胰岛细胞重建成功能性胰腺内分泌胰岛组织。这些作用被发现是骨髓特异性的。脐血细胞和／或分离的外周血CD34⁺细胞对于在体外维持胰岛功能或存活无益。这表明，骨髓在支持人内分泌胰腺组织方面提供了独特的优势，该优势可显著改善实现胰岛素非依赖性的成功率。

本发明包括胰岛β细胞与骨髓细胞的共培养物。然而，在优选的实施方案中，比率为约25-100个胰岛对约1-5×10⁶个骨髓细胞。要理解的是，胰岛对骨髓细胞的其它比率是可能的，培养物可以包括其它的细胞类型，例如骨髓基质细胞、间充质细胞和胰腺α细胞。

尽管不希望受到作用机制的束缚，但数据提示，骨髓细胞通过降低胰岛细胞的细胞因子释放(包括IL-1β)增加胰岛细胞的形态、存活力和／或功能。这已被提出导致炎性因子释放下降和凋亡或细胞死亡下降。还表明共培养增加胰腺特异性基因和与再生相关的生长因子的表达。本文公开的数据提示，尽管某些骨髓细胞呈现β细胞的表型，但可能是已证实的存活和生长作用的较小组分。更有可能的是本发明的共培养方法的已证实的抗凋亡作用基于旁分泌作用，其中一种旁分泌作用可为抑制炎性细胞因子白介素-1β[25，28-30]。由骨髓旁分泌生长因子刺激的胰岛细胞增殖和生长有可能是促成重构胰岛组织的主要因素[20，31-33]。

本发明不限于胰岛β细胞与完整骨髓的共培养。通过梯度、细胞表面标记和其它方法进行细胞分拣的方法是本领域技术人员众所周知的。预期一个或多个亚群骨髓细胞可在一定持续培养期内有效提升培养胰岛β细胞存活力、形态和功能。所述方法同样不受细胞源限制。要理解的是，同种异体胰岛β细胞和骨髓细胞的共培养方法可用于任何哺乳动物胰岛β细胞和骨髓细胞的培养。术语“哺乳动物”在本文用于指温血动物，例如啮齿动物、兔或灵长类动物患者，尤其是人类患者。特定的目标啮齿动物和灵长类动物包括代表公认的人类疾病模型的那些动物，包括猪、黑猩猩、绵羊、山羊、马、小鼠、大鼠、兔和猴。特定的目标人患者包括患有、怀疑患有或有风险患有胰腺细胞功能下降或丧失的那些患者。而且，包括在得自裸小鼠或没有免疫系统的其它哺乳动物的骨髓中培养人胰岛细胞的方法在本发明的范围内。

本文公开的数据表明，同种异体人骨髓与β-细胞胰岛的共培养允许随着胰岛组织生长在体外保持胰岛数和胰岛素释放功能达某一持续期(包括13个月以上)。在先前的研究中，培养的人胰岛一般在3-4周后失去功能和存活力[27]。在这些研究中，胰岛中的细胞包括α和β细胞，其保持了基线胰岛素生产和对葡萄糖挑战的响应。这些观察结果提示使周与同种异体骨髓细胞的共培养物进行胰岛细胞移植的直接策略。然而，本发明的方法不限于在胰岛细胞培养生长后使用所述胰岛细胞。

本发明由以下的实施例进一步阐述。提供这些实施例是为了帮助理解本发明，不能被视为限制本发明。在整个申请中提及的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容以及图都整体在此引入作为参考。

实施例

实施例1-细胞染色方法

使用荧光和化学染料进行细胞染色和免疫荧光的方法是本领域技术人员众所周知的。众多的实例包括这样的染色方法。提供示例性的细胞染色方法。用3％多聚甲醛固定在腔室载玻片上生长的细胞，接着使细胞接触10％正常山羊血清。在不洗涤的情况下印迹载玻片，施加原初抗体混合物，然后在湿润的腔室中于4℃温育载玻片过夜。洗涤载玻片3次，之后于室温接触第二抗体45分钟。在洗涤后，施加稀释的第二抗体，温育载玻片15分钟。随后用PBS彻底洗涤载玻片，以上过程任选地用第二种荧光颜色(例如DAPI)和／或第三抗原检测抗体重复。在结束该过程时，用荧光封片介质和盖玻片覆盖载玻片。然后使用共聚焦荧光显微镜观测样品并拍照[22]。

实施例2-人骨髓和人胰岛β细胞的共培养

来自正常供体的人胰岛组织得自宾夕法尼亚大学人类胰岛实验室ICR基础科学胰岛分配计划(ICR Basic Science Islet DistributionProgram，Human Islet Laboratory，University of Pennsylvania(Philadelphia，PA))的胰岛资源中心(Islet Resource Centers(ICR))、Joslin糖尿病中心(Joslin Diabetes Center(Boston，MA))和希望之城国家医疗中心(City of Hope National Medical Center (Duarte，CA))。这些细胞的使用得到Roger Williams医院(Roger Williams Hospital)的IRB和ICR委员会的批准。

来自正常供体的人骨髓在签署已被Roger Williams医院机构审查委员会(Roger Williams Hospital Institutional Review Committee(IRB))批准的适宜知情同意书后获得。按照生产商的指引通过Ficoll-Paque^TMPlus(Amersham Biosciences；Amersham，UK)分离骨髓单核细胞。然后用5％FCS／PBS洗涤细胞2次，重悬浮在培养基(参见下文)中。使用锥虫蓝染色评价细胞存活力。

在志愿供体死亡后48小时内由胰岛细胞资源中心(ICR)得到人胰岛(纯度>90％，存活力>95％)。于湿润的37℃温育箱、5％CO₂中在补加10％热失活胎牛血清(HiFBS)、5.5mM葡萄糖、10mM HEPES和1％P／S的RPMI1640(生产商)中培养50胰岛当量(IEQ)／ml和1×10⁶个／ml同种异体全BM细胞。

图1a-d显示了在没有(a和c)或有(b和d)骨髓细胞的情况下培养6天(a和b)或156天(c和d)的胰岛β细胞。在仅6天后就看到形态差异。在没有骨髓细胞的情况下培养的细胞开始形成单层(图1a)，而在骨髓细胞存在的情况下培养的细胞没有显示出相似的形态损失。骨髓细胞环绕在胰岛细胞周围，以保护胰岛细胞膜，并防止胰岛细胞扩散(图1b)。形态差异在第156天甚至更显著。在没有骨髓细胞的情况下培养的细胞形成单层(图1c)，而在存在骨髓细胞的情况下培养的细胞形成圆形胰岛(图1d)。

图2a-b显示了在没有(左图)或有(右图)骨髓细胞的情况下培养至第28天的胰岛β细胞。用0.05％胰蛋白酶(Promega，Madison，WI)消化胰岛5分钟。在用PBS洗涤1次后，制作细胞的cytospin切片。在图2a的上图中的细胞用DAPI染色，以显现核。在下图中的细胞用靶向胰岛素原和骨髓细胞标记CD45的抗体染色，并用在成像时表现为不同颜色的第二抗体显现。

与骨髓共培养物(右图)相比，在单独的胰岛细胞培养物(左图)中的细胞数显著较少。而且，在仅胰岛细胞的培养物中，没有显示出许多细胞表达胰岛素原(即，被DAPI染色，但没有被抗CD45抗体染色)。

在右图中，由向下粗箭头指示的相对大的细胞聚簇对胰岛素原染色，并带有某些混杂的CD45染色，提示在聚簇中存在一些骨髓细胞。向上细箭头指示用CD45抗体染色的细胞。在针对CD45染色的共培养物中的大部分细胞不对胰岛素原染色，表明它们是骨髓细胞。

为证实免疫荧光分析的观察结果，使用免疫组织化学方法染色细胞。用不同的发色团染色表达胰岛素原的细胞和表达CD45的细胞。此外，在单独的骨髓培养物中的大量胰岛细胞不表达胰岛素原，而在共培养物中的非骨髓细胞几乎全部都表达胰岛素。胰岛素原染色在左图中由箭头指示，右图中更向右的箭头指示。CD45染色在左图中由图中更向左的箭头指示。此外，在共培养物中观察到细胞更有活力和胰岛素原染色更强。

胰岛素原阳性胰岛的百分率的定量分析示于图1c。发现相比于单独的胰岛细胞培养物，共培养物中显著更大量(2.7倍高)的胰岛细胞表达胰岛素原(p<0.01，n=6)。

图3显示了培养153天形成的胰岛。左图是胰岛的相差图像。中图和左图分别是胰岛顶部和中心的共聚焦图像。α细胞用胰高血糖素的抗体染色，并由向着细胞质中心的箭头指示，β细胞用靶向胰岛素原的抗体染色，并由向着细胞质外周的箭头指示。α细胞响应于低血糖释放胰高血糖素。由共聚焦图像清楚可见，β细胞围绕着α细胞。该分析证实，β细胞占细胞群的大部分，α细胞定位在胰岛的中心部分，提示在这些培养物中发生重建[23,24]。

这些结果清楚地证实，骨髓细胞可用于在一定持续时间体外维持胰岛的形态和维持胰岛细胞特异性标记的表达。

实施例3-在胰岛素释放测定中评价胰岛功能

通过在有或没有葡萄糖挑战的情况下检测胰岛素释放从而评价胰岛细胞功能。每周收集2次培养基，并储存于-80℃，直至通过ELISA测定基础胰岛素释放。

如下每周1次进行高葡萄糖挑战测定：收集培养基，用RPMI培养基洗涤1次培养的细胞。然后用高葡萄糖(20mM)RPMI1640置换培养基达15和30分钟。最后收集培养基，并储存于-80℃，直至通过ELISA进行胰岛素测定。

使用人胰岛素ELISA试剂盒(Linco Research，St.Charles，MO)按照生产商的说明检测标本(细胞培养基或组织提取物)中的胰岛素浓度。简而言之，将胰岛素标准品和适宜稀释(1：50-1：500)的样品加至包被胰岛素抗体的96孔微量滴定板，并于4℃温育2小时。在洗涤后，将抗人胰岛素酶缀合物加至每个孔，于室温温育30分钟。在洗涤后，加入酶底物溶液，然后于室温在黑暗中温育45分钟。通过加入1N硫酸终止反应。用μQuant^TM微量读板器(Bio-Tek Instruments，Inc.，Winooski，VT)读取450nm的吸光度，并通过微量读板器软件(Bio-Tek Instruments，Inc.)计算浓度[20]。

使用基础胰岛素释放测定和响应于高葡萄糖挑战的胰岛素分泌测定来测定细胞的功能完整性。这些测定证实，与骨髓细胞共培养的胰岛在培养中以稳定方式释放胰岛素达204天(图4a)。胰岛素释放水平由开始时的约8000μU／ml至培养195天时的约10,000μU几乎是稳定的。随时间推移而增加的人胰岛素释放提示，胰岛细胞随着时间推移而再生和／或扩增。

单独培养的胰岛显示出不稳定的胰岛素释放(图4a)，开始时为平均约9,500μU／ml，由高约17,500μU／ml显著变化，至培养28天时快速下降约4,900μU／ml，并至第5周丧失功能。结合形态学研究，峰值处于第15和28天的这些发现可能归因于单独培养的胰岛中的垂死β细胞泄漏胰岛素。以类似的方式，在共培养的前21天观察到的相对低的基础胰岛素释放可能归因于在达到功能稳定之前垂死的β细胞极少。

对葡萄糖挑战(20mM)下的胰岛素分泌进行评价揭示，与骨髓细胞一起培养的胰岛细胞能够在培养中响应于葡萄糖达204天，相比之下，单独的胰岛细胞培养物至第42天基本上丧失其响应于高葡萄糖挑战的能力，至第70天完全丧失(图4b)。就胰岛素释放和响应于葡萄糖挑战的胰岛素而言，仅胰岛的培养物和胰岛加BM之间的差异是统计学显著的(p<0.01，n=6)。

实施例4-胰岛β细胞与骨髓细胞的共培养促进细胞生长和胰岛团形成

通过在没有或有骨髓细胞的情况下在栅格上培养胰岛β细胞监测细胞生长和胰岛细胞形成。在栅格上的胰岛细胞示意图如在图5a中所示。使用栅格可监测单个胰岛随着时间推移的生长。跟踪胰岛细胞，并以显微照片记录形态变化。使用NIH图像分析软件定量胰岛表面积(像素值)。3个胰岛表面值的平均值被视为1个样品，每组收集6个样品。

在培养的前3周，尽管存在显著的功能差异，但在有和没有骨髓细胞一起培养的胰岛之间几乎没有观察到形态差异(未显示)。然而，在3周后，在骨髓细胞存在下培养的胰岛继续扩增，而在没有骨髓细胞的情况下培养的胰岛收缩，并且它们最终消失(图5c)。使用图像分析软件定量胰岛和细胞大小的变化。结果证实，与胰岛一起的骨髓共培养导致在17天的时间段内(由第54天至第71天)它们的表面扩增达1.8倍。这与其中细胞显示出尺寸基本没有增加和没有胰岛形成的仅胰岛的培养物相比是显著差异(图5c，p<0.05，n=6)。

图5d显示了在栅格载玻片上在新生早期(左图)和共培养13个月(右图)中的胰岛细胞生长。在栅格载玻片上容易观察到随着时间推移共培养物中的胰岛大小显著增加。胰岛大小增加可为以骨髓细胞刺激胰岛增殖的结果，所述骨髓细胞通过其显著的Ki67表达来鉴定(图6)。

图5e和f证实，胰岛细胞在培养13个月后保持功能性。如上进行功能测定。观测胰岛素释放的观察期为406天(图5e)。在如所示的第360天、第369天和第399天观测响应于高葡萄糖的胰岛素分泌(图5f)。这些数据证实，在骨髓存在下生长的胰岛β细胞的功能维持达至少13个月。

实施例5-胰岛β细胞与骨髓细胞的共培养促进增殖

图6显示了在培养153天后有(上图)或没有(下图)骨髓细胞一起培养的胰岛β细胞培养物。左图为相差图像。在右图中，细胞用胰岛素原和细胞增殖标记Ki67染色。核用DAPI显色。上图表明，依据大的胰岛素原染色细胞聚簇，细胞已发展出胰岛形态，并通过显著的胰岛素原染色证实正在增殖。还观察到许多的Ki67染色斑点，包括由箭头指示的细胞。下图显示出相对均一的单层，几乎没有胰岛素原或Ki67染色。在胰岛培养物中，基本上仅通过DAPI染色显现出细胞。这些图像证实，在骨髓细胞存在下培养的胰岛β细胞在培养中表达胰岛素原、形成胰岛并增殖持续一定时间。相反，在单独的胰岛β细胞培养物中没有观察到特定的胰岛形态。同样，在单独的胰岛β细胞培养物中几乎没有观察到胰岛素原或Ki67染色。

实施例6-胰岛β细胞与骨髓细胞的共培养促进宏观胰岛形成

在长期培养胰岛β细胞和骨髓细胞后，形成宏观组织。图7a显示了由与骨髓细胞培养190天的胰岛细胞产生的组织。条棒代表1cm。该组织为约1.8cm长，具有清晰的3维结构。由相仿的组织样品制备5μm的冷冻切片，并用苏木精和曙红染色，以揭示组织的形态(图7b)。组织染色表明，组织具有在切片中出现的、由多孔支架样组织围绕的胰岛样结构(箭头指示)。发现所述组织的胰岛素含量为56307μU／mg蛋白(ELISA测定)。通过荧光免疫组织化学表明，该胰岛样组织主要含β细胞和少量α细胞(图7c)。胰岛β细胞用胰岛素原抗体染色(由箭头a指示)，α细胞用胰高血糖素抗体染色(由箭头b指示)，核用DAPI染色。

使用上述方法分析所述组织的基础胰岛素释放和诱导的响应于高葡萄糖的胰岛素分泌。正如所料，在胰岛β细胞-骨髓共培养物中形成的组织表现出基础胰岛素释放(图7d)和诱导的响应于高葡萄糖的胰岛素分泌(图7e)。由相同年龄的仅胰岛β细胞的培养物中的细胞基本上未观察到胰岛素分泌。这些数据表明，胰岛β细胞与骨髓细胞的共培养允许形成更高级的三维结构，其具有胰岛样结构和功能。

实施例7-骨髓细胞与胰岛细胞共培养物的相互作用

使用组织化学和免疫荧光分析进一步证实骨髓细胞保存培养中的胰岛β细胞的能力。PKH细胞标记试剂盒(Sigma，St.Louis.MO)用于标记骨髓和胰岛β细胞，以监测细胞类型之间的相互作用。PKH染料可用于活细胞标记，而不影响细胞的形态或功能。染料为连接至长亲脂性尾的荧光标记，该长亲脂性尾整合入膜中，留下发荧光的部分暴露在细胞表面附近。所述染料允许跟踪群体中的两类活细胞。按照生产商的说明，将4μM PKH26(PKH26GL)和PKH2(PKH2GL)分别与1×10⁶个骨髓细胞和50个胰岛温育3分钟。用PBS单独洗涤细胞。通过加入1ml冷的1％BSA的PBS溶液终止染色。温和沉淀细胞，并在PBS中重悬浮5次。以除去任何未结合的染料。在完成标记后，在上述条件下共培养骨髓细胞和胰岛。

在培养7、24、48和96小时后收集细胞。用靶向胰岛素原的抗体染色细胞。观察到在7小时时(图8a)骨髓细胞(粗箭头)紧密靠近胰岛，并在24小时时主动迁移入胰岛中(图8b)。在48小时后，骨髓细胞出现粘附至胰岛中的β细胞(图8c，插图高放大倍数)。高放大倍数的图像表明骨髓细胞与胰岛β细胞相互作用。而且，如在左上角高放大倍数图像中所示，在培养96小时时，骨髓细胞出现将β细胞培育汇合在一起，形成如在显微照片中所见的完整胰岛(图8d，插图高放大倍数)。人们可在任一侧观察到与胰岛β细胞缔合的骨髓。

还利用实时时间间隔显微镜检查和活体染料分析骨髓细胞与胰岛β细胞的相互作用，以监测64小时内培养物中的骨髓细胞和人胰岛，图像每20分钟记录1次(图9)。骨髓细胞(粗箭头)逐渐靠近胰岛移动，如在图9a、b和c中所见。这之后为骨髓细胞进入胰岛聚簇中，如在d、e和f中所见。骨髓细胞逐渐由胰岛向外移动，如在g、h、i和j中所见(细箭头)。所述图像清楚表明，BM细胞与胰岛细胞接触，并将物质释放到胰岛细胞附近。

还观察到与胰岛β细胞共培养的骨髓细胞在更长时间段内迁移，让人们了解到骨髓是如何参与胰岛再生的。在图10中，在3小时的共培养物(图10a)中与人胰岛(大聚簇)分离的、用活体染料PKH-26标记的人骨髓细胞(用箭头指示)在30天培养后迁移入胰岛中(图10b)，并在60天培养物中形成围绕着胰岛的囊样组织(图10c)。仅胰岛的培养物在3小时时没有显示出任何红色(图10d)，在30天时培养物中的胰岛变成单层(图10e)，并在60天时保持如此(图10f)。(放大倍数x20)。实施例9-胰岛β细胞与骨髓细胞的共培养抑制细胞因子释放

已知由人胰岛产生并释放的IL-1β在胰岛存活和功能中起关键作用[25,26]。为评价IL-1β在胰岛培养物存活中的作用，在有和没有骨髓细胞的情况下检测胰岛β细胞培养物中的IL-1β水平。使用对人IL-1β特异性的ELISA试剂盒，在单独培养胰岛时，证实胰岛的IL-1β释放逐渐增加。细胞因子生产水平由在接种培养物时的检测不到的水平增加至培养63天后的25倍增加。这与其中IL-1β水平非常低的、和骨髓细胞一起培养的胰岛相反(图11a)。进一步评价在高葡萄糖挑战存在时的IL-1β释放表明，IL-1β释放水平在单独培养的胰岛中增加1500倍，而在胰岛与骨髓一起培养时，IL-1β水平保持得非常低(图11b)。

实施例10-胰岛β细胞与骨髓细胞的共培养促进细胞存活

胰岛β细胞凋亡被视为在体内和体外的β细胞损失的主要原因，分析人胰岛存活和功能的骨髓调节是否与培养的胰岛的凋亡过程相关。使用末端脱氧核糖核苷酸转移酶(TDT)介导的dUTp-地高辛缺口末端标记(TUNEL)法(Clone ApoAlert^TM DNA片段化测定试剂盒BDClontech)按照生产商的说明检测凋亡的细胞核。简而言之，以3％多聚甲醛固定人胰岛制备物，并在0.3％H₂O₂的甲醇溶液中温育5分钟，以封闭内源过氧化物酶。将载玻片与TdT温育缓冲液于37℃温育2小时，并用2x SSC终止。还用抗人胰岛素原抗体染色细胞。在没有先前治疗方案的信息的情况下，通过计算凋亡细胞总数除以胰岛素阳性细胞总数来分析凋亡细胞。结果由自每个载玻片随机拣选的10个以上胰岛的检测计算，每个样品检测总共4个载玻片[21]。

检验凋亡由培养开始起随时间的变化揭示，早在7小时时，骨髓细胞就保护胰岛免于凋亡，并且该作用在与没有骨髓的情况下培养的胰岛相比时是显著的(图12a和b)。图12a显示了在仅胰岛(I)的培养物中于7小时时开始的显著TUNEL染色(上行)。骨髓细胞保护胰岛细胞免于凋亡随着培养时程增加变得更明显，例如与48小时和3周时的细胞相比。尽管可在8小、时时观察到一些非凋亡细胞，但在3周时于仅胰岛的培养物图像中几乎没有鉴定出一个非凋亡细胞。这与其中细胞在所有观测时间点都似乎是基本上非凋亡的胰岛+骨髓(I+B)培养物明显不同(下行)。定量实验结果，培养物中的凋亡细胞百分率示于图12b，反映出图像中所显示的证实骨髓对胰岛细胞几乎即时的保护作用。

实施例11-在脐血细胞或CD34+外周血细胞存在下共培养胰岛β细胞

为评价除BM之外的细胞对胰岛功能的作用，将全脐带血细胞、流动的外周血细胞和流动的外周CD34+细胞与胰岛在和上述BM培养相同的条件下培养，以确定它们是否可支持胰岛β细胞生长并促进胰岛形成。在所示培养天数后，分析胰岛素释放(图13)。胰岛胰岛素释放检测的数据表明这些细胞和仅胰岛的培养物之间没有显著差异，这表明BM细胞可在胰岛细胞存活方面提供独特的优势。

实施例12-使用与骨髓细胞共培养的胰岛细胞在糖尿病小鼠模型中重建胰腺功能

为评价与骨髓细胞共培养的胰岛细胞可在糖尿病小鼠模型中用于胰岛细胞移植方法，使用在单独地或者与骨髓共培养3周的培养物中保持的胰岛细胞进行胰岛细胞移植。以STZ200mg／kg体重(腹膜内)注射小鼠(8周龄，雄性Balb／c SCID小鼠)，水诱发糖尿病，所述糖尿病定义为所具有的血糖水平在3天内始终超过400mg/dL。将没有(13W=1500个胰岛(IEQ))或有骨髓(I3W=1500个胰岛(IEQ)和1×10⁶个骨髓细胞)培养的人胰岛细胞植入左肾包膜下。监测血糖水平(图14)。

在4个月后，移植骨髓共培养的胰岛细胞的动物具有正常的血糖水平，血液具有可检测的人胰岛素水平(157μU／ml)。移植在单独的培养物中生长的胰岛细胞的动物保持低血糖。这些数据强烈提示，胰岛素响应被在骨髓共培养物中生长的移植胰岛替代，但没有被在仅胰岛的培养物中生长的胰岛替代。

为确保血糖控制被移植的细胞诱导，取出含有移植的细胞的肾脏。作为响应，动物变成高血糖的。这些数据证实了与骨髓细胞共培养的胰岛细胞用于胰岛细胞移植以及治疗和／或改善糖尿病的用途。

实施例13-胰岛β细胞与骨髓细胞的共培养有利于胰岛聚集

骨髓有利于胰岛聚集。先前的数据已表明，在共培养物中形成显著的胰腺组织，该组织可由胰岛聚集物的骨髓刺激产生。得自时间间隔显微镜检查图像(图15)的数据表明，骨髓刺激胰岛聚集的过程和一体化胰腺组织的形成。在培养物下使用栅格能够以每周1次获取的活体显微镜图像鉴定和监测单个胰岛迁移。

在图15a中，3个胰岛在栅格的中心区域是可见的。在图15b、c和d中，3个较大胰岛中的2个彼此相对迁移，并在图15e中最终合成一体，形成更大的胰岛(放大倍数=x5)。在用活体染料PKH-26(在单独的实验中)标记骨髓后，发现骨髓迁移入一体化的胰岛中，并形成囊化的重建胰岛(图15f)（放大倍数=x20)。

实施例14-在没有和有骨髓的情况下培养的胰岛细胞中的基因表达的分析

分析在单独的胰岛(胰岛)或者胰岛和骨髓共培养(胰岛+B)中培养的人胰岛β细胞中的基因表达。使用采用基因特异性引物的RT-PCR分析内分泌细胞特异性基因表达和再生转录因子基因的表达水平。培养细胞209天，分离总RNA并逆转录，使用常规方法通过PCR对产生的cDNA进行扩增。

内分泌特异性基因GCG、INS和SST的表达显著增加，共培养物的细胞中的再生相关基因NGN3的表达也显著增加，但在仅胰岛的培养物中没有增加(图16a和b)。这些结果提示，骨髓细胞在体外刺激人胰岛细胞再生。同样，在共培养物中还观察到胰腺特异性转录因子PDX1或IPF1、PAX6、ISL1和MAFa的表达增加，但在单独的胰岛培养物中没有观察到(图16c)。这些转录因子调节培养物中的迁移、分化和增殖，这可导致在共培养物中观察到的长期存活和功能增强。

Mistl是在内分泌细胞中特异性表达的碱性螺旋-环-螺旋转录因子，是胰腺腺泡细胞的组织化和功能所必需的。研究提示，Mist-1表达提供了支持胰岛发育和功能的微环境。Mistl的表达可允许胰岛细胞组织化为更高级的结构。

统计学评价：

所有的数据都以平均值±SEM表示，并通过方差分析(ANOVA)继之以student-t检验来分析，除非另有说明。Sigma Plot(SPSS Inc.Chicago，IL)用于画图。所有的数据都代表3个的结果。

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引入作为参考

本文列出的或在它处提到的所有参考文献、专利、专利申请、肽和核酸登录号都引入到本说明书中作为参考。

等价方案

仅仅使用常规实验，本领域技术人员就会认识到或能够确定本文描述的本发明的具体实施方案的许多等价方案。这样的等价方案包括在下列权利要求范围之内。

Claims

1. 一种培养胰岛β细胞的方法，所述方法包括在体外将胰岛β细胞和骨髓细胞一起培养。

2. 权利要求1的方法，其中持续培养所述胰岛β细胞一定时间。

3. 权利要求2的方法，其中所述持续期为至少约30天。

4. 权利要求2的方法，其中所述持续期为至少约60天。

5. 权利要求2的方法，其中所述持续期为至少约90天。

6. 权利要求2的方法，其中所述持续期为至少约120天。

7. 权利要求1-6中任一项的方法，其中与没有骨髓细胞的情况下培养的胰岛β细胞相比，将胰岛β细胞与骨髓细胞一起培养提高胰岛β细胞存活力，改善胰岛β细胞功能，和/或改善胰岛β细胞形态。

8. 权利要求7的方法，其中所述细胞功能通过基础胰岛素分泌测定来测定。

9. 权利要求7的方法，其中所述细胞功能通过葡萄糖诱导的胰岛素分泌测定来测定。

10. 权利要求7的方法，其中在一定时间内持续增加胰岛β细胞存活力、改善胰岛β细胞功能和/或改善胰岛β细胞形态。