CN103989691A - 马里苷在防治丙酮醛引起的认知功能障碍中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及马里苷在保护PC12细胞免于丙酮醛损伤，尤其是在丙酮醛引起的认知功能障碍防治中的应用，实验研究证明，本发明提供的马里苷防治神经认知功能障碍如糖尿病脑病、阿尔茨海默病等，药效好，作用强，毒性小，预示着其良好的应用前景。
Description
技术领域：
本发明涉及马里苷在保护PC12细胞免于丙酮醛损伤，尤其是在丙酮醛引起的认知功能障碍防治中的应用。
背景技术：
丙酮醛是一种羰基醛，在机体中丙酮醛是一些代谢途径的副产物。它的形成可能来自于苏氨酸分解代谢的中间体3-氨基丙酮或者脂质过氧化。而最重要的来源是糖酵解。丙酮醛来自糖酵解中间产物3-磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮的去磷酸化，而这种去磷酸化是非磷酸酶依赖性的。由于丙酮醛具有高反应性,其糖基化活性比葡萄糖高10000-50000倍,可定向修饰蛋白质的精氨酸残基并与蛋白质不可逆地结合,形成糖化蛋白(glycationprotein)而产生细胞毒性，因此体内发展了多种解毒机制，其中一种就是乙二醛酶系统。丙酮醛(MG)大都会被机体内普遍存在的乙二醛酶系统所分解代谢,而这种乙二醛酶系统主要是由特定的乙二醛酶Ⅰ和乙二醛酶Ⅱ这两种酶构成,通过使用一定量具有催化作用的还原型谷胱甘肽(GSH)进一步转化成D-乳酸来达到上述分解代谢的作用。Glo-1可及时清除MG等α-羰基醛,,降低活性氧和二羰基糖化蛋白质组标志物的生成,以及降低氧化应激的标志物。
丙酮醛会在糖尿病人体内大量积累，进而诱发糖尿病并发症，在脑中即表现为糖尿病脑病。糖尿病脑病(diabetic encephalopathy,DE)是指糖尿病(diabetesmellitus,DM)久病患者渐进发生的以智能减退和大脑神经生理及结构改变为主要特征的精神功能紊乱性疾病。2006年,专门术语糖尿病认知功能障碍(diabetes-associated cognitive decline,DACD)的提出，进一步增强了人们对这种功能紊乱的认识,并成为糖尿病脑病研究的焦点。广泛的流行病学调查及其前瞻性研究表明，糖尿病是与年龄相关的认知功能下降和痴呆的一个危险因素,相对于非糖尿病患者,认知功能下降的速度在糖尿病患者中增加了1.5-2.0倍。而且研究显示，在阿尔茨海默病(AIzheimers disease,AD)脑脊髓中含有高浓度的丙酮醛(Vander Jagt&Hunsaker,2003)，表明丙酮醛可能是AD的诱发因子之一。因此丙酮醛诱导的细胞凋亡在各种神经认知功能障碍疾病中起着至关重要的作用[Beisswenger PJ,Drummond KS,Nelson RG,Howell SK,Szwergold BS,Mauer M(2005),Susceptibility to diabetic nephropathy is related to dicarbonyl and oxidativestress.Diabetes54:3274–3281]；[Berlanga J,Cibrian D,Guillen I,Freyre F,Alba JS,Lopez-Saura P,Merino N,Aldama A,Quintela AM,Triana ME,Montequin JF,Ajamieh H,Urquiza D,Ahmed N,Thornalley PJ(2005),Methylglyoxaladministration induces diabetes-like microvascular changes and perturbs the healingprocess of cutaneous wounds.Clin Sci(Lond)109:83–95]。丙酮醛通常用于PC12细胞,作为糖尿病引起的认知能力下降的细胞模型。
马里苷(marein)是一种查尔酮4’位的O-糖苷，也是一种多酚类化合物,分子式为C21H22O11,相对分子量为450.392780g/mol。马里苷存在于菊科植物两色金鸡菊(Coreopsis tinctoria Nutt.)的头状花序中(是两色金鸡菊的主要活性成分之一)。现代药理学研究显示，两色金鸡菊具有抗氧化、降血糖、降血压、降血脂等作用。马里苷的药理活性国内外鲜有报道。迄今为止，现有技术中尚未见有马里苷保护PC12细胞免受丙酮醛损伤作用的相关报道。
发明内容：
本发明的目的在于研究提供马里苷新的药理作用,即马里苷对神经认知功能障碍如糖尿病脑病、阿尔茨海默病等的防治作用及其可能的作用机制。
本发明的主要技术方案包括：
1、四噻唑蓝(MTT)法测定丙酮醛对PC12细胞存活率的影响；
2、MTT法测定马里苷对丙酮醛刺激PC12细胞的保护作用；
3、Hochest33342染色检测马里苷对丙酮醛诱导增殖细胞凋亡的影响；
4、利用葡萄糖氧化酶法测定细胞糖消耗；
5、细胞中ATP含量的测定；
6、细胞中乳酸含量的测定；
7、细胞中ROS含量测定；
8、细胞中钙离子浓度的测定；
9、细胞中还原型GSH的检测；
10、Western Blot检测马里苷对丙酮醛刺激PC12细胞相关蛋白表达的影响。
研究结果表明：
经四噻唑蓝(MTT)法检测，马里苷对大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞(PC12细胞)无毒副作用,且能抑制丙酮醛导致的神经细胞损伤，具有神经细胞保护作用；
在Hochess33342染色中发现，马里苷能够有效地预防丙酮醛引起的PC12细胞的凋亡；
丙酮醛能刺激PC12细胞对葡萄糖的消耗及ATP的产生，因细胞在丙酮醛损伤下处于凋亡或者濒死状态需要消耗更多的能量，而马里苷能通过抑制细胞的凋亡或死亡从而避免细胞葡萄糖的过度消耗；
马里苷能够通过抑制TRPA1的活性，减少丙酮醛引起的细胞外钙离子的内流，降低丙酮醛引起的细胞毒性；
马里苷能抑制丙酮醛引起的ROS升高，进而增加还原型谷胱甘肽(GSH)的量,增强乙二醛酶Ⅰ(GLo-1)的功能，显示马里苷增强机体抗氧化系统的功能；
马里苷能影响琥珀酸脱氢酶(SDHA)、丙酮酸脱氢酶(PDHA1)、TRPA1(The transient receptor potential ankyrin1，瞬时受体电位锚蛋白1)的表达，显示其能通过影响机体三羧酸循环达到预防糖尿病脑病的作用；
综上所述，本发明提供的马里苷防治神经认知功能障碍如糖尿病脑病、阿尔茨海默病等药理效果好，作用强，毒性小，预示着其良好的应用前景。
附图说明：
图1--四噻唑蓝(MTT)法测定丙酮醛对PC12细胞的损伤作用
其中：圆点线-.6h，方框线-.12h，三角线-.24h
图2--四噻唑蓝(MTT)法测定马里苷对丙酮醛损伤的PC12细胞的保护作用
其中：##-.与对照组相比P〈0.01，**-.与模型组相比P〈0.01。
图3--Hochess33343法测定马里苷对丙酮醛损伤的PC12细胞的保护作用
其中：A-.control白光；B-.control荧光；C-.model白光；D-.model荧光；E-.10μmol/L马里苷白光；F.-10μmol/L马里苷荧光；
图4--马里苷对丙酮醛损伤的PC12细胞对葡萄糖消耗的影响
其中：##-.与对照组相比P〈0.01，**-.与模型组相比P〈0.01。
图5--马里苷对丙酮醛损伤的PC12细胞中ATP水平的影响
其中：##-.与对照组相比P〈0.01，**-.与模型组相比P〈0.01。
图6--马里苷对丙酮醛损伤的PC12细胞中乳酸水平的影响
其中：##-.与对照组相比P〈0.01，*-.与模型组相比P〈0.05。
图7--马里苷对丙酮醛损伤的PC12细胞中ROS水平的影响
其中：##-.与对照组相比P〈0.01，*-.与模型组相比P〈0.05。
图8--马里苷对丙酮醛损伤的PC12细胞内钙离子的影响
其中：B-E图，浅灰色线(圆点线)-.对照，黑色线(方形线)-.模型(丙酮醛1mmol/L),深灰色线(三角形线)-.马里苷(20,10或5μmol/L)；F图，圆点线线-.马里苷20μmol/L，方形线-.马里苷10μmol/L，三角形线5μmol/L。图9--马里苷对丙酮醛损伤的PC12细胞中GSH水平的影响
其中：##-.与对照组相比P〈0.01，**-.与模型组相比P〈0.01。
图10--WesternBlot检测马里苷对丙酮醛刺激的PC12细胞相关蛋白表达的影响"
其中：PDHA1-.丙酮酸脱氢酶；SDHA-.琥珀酸脱氢酶；TRPA1-.瞬时受体电位锚蛋白1；GLO1-.乙二醛酶Ⅰ；β-actin-.内参。
具体实施方式：
以下实施例仅为本领域进一步说明本发明，但不以此限制本发明。
本发明实施例所用试剂、仪器为：
PC12细胞：大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞，购于上海细胞库。
药品及主要试剂：马里苷(购自美国ChromaDex,Inc.)；丙酮醛、葡萄糖(美国SIGMA公司)；MTT(南京建成生物工程研究所)；葡萄糖检测试剂盒普利来公司)；乳酸试剂盒(南京建成生物工程研究所)；Hochess33342、ROS试剂盒、Fura-2AM钙离子探针、GSH试剂盒(碧云天生物技术研究所)；鼠抗β-actin(康为世纪)；兔抗GLO1、SDHA、PDHA1(美国加利福尼亚EPITOMICS公司)；TRPA1(英国Abcam)。
《实施例1》四噻唑蓝(MTT)法测定PC12细胞的存活率
实验方法：PC12细胞培养：PC12细胞用含10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的高糖DMEM培养基,于37℃5％C02和95％湿度下进行贴壁培养。每2-3天更换培养液一次，细胞达约70％一80％融合时,传代或用于实验。
实验处理：用0.25％的胰酶将贴壁的PC12细胞消化,1000rpm离心5min，除去胰酶。将细胞均匀排在96孔板中，种密度为1×104Cell/孔，在含有10％胎牛血清100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的高糖DMEM培养基，于37℃5％C02和95％湿度下进行贴壁培养。细胞培养过夜，换新鲜DMEM培养液，对照组不加丙酮醛，实验组分别为0.25、0.5、1.0、2.0、4.0mM浓度的丙酮醛，分别刺激6h、12h、24h，各组设5个复孔。
结果测定：取出待测的96孔细胞培养板，每孔加MTT溶液(5mg/ml)10pl，继续孵育4小时后，小心去掉上清，每孔加入150μl二甲基亚矾，小心混匀，用酶标仪在波长570nm处测定吸光度值。
实验结果：从图1中可见，随着时间的延长和浓度的增加，细胞存活率逐渐下降，说明丙酮醛对PC12细胞的损伤具有浓度和时间的依赖性。从图(1)中可以看出，加入0.5mmol/L丙酮醛12h后，细胞状态明显变差,细胞体积缩小，连接消失，与周围的细胞脱离等。
《实施例2》MTT法测定马里苷对丙酮醛刺激PC12细胞的保护作用.
PC12细胞培养同实施例1.
实验处理：初步细胞处理同实施例1，实验分组,马里苷浓度分别为40μmol/L、20μmol/L、10μmol/L、5μmol/L，处理细胞24h后，用丙酮醛1mmol/L损伤细胞24h，对照组不加损伤。
结果测定：同实施例1.
实验结果：从图(2)中可以看出，马里苷浓度40μmol/L、20μmol/L、10μmol/L、5μmol/L预处理细胞后，再加入丙酮醛损伤，细胞存活率与模型相比显著升高，且具有明显的剂量依赖性。表明马里苷能显著减轻丙酮醛对PC12细胞的损伤，利用SPSS17.0软件进行方差分析(ANOVA)，显示差异具有统计学意义(P<0.01)。
《实施例3》Hochest33342染色检测马里苷对丙酮醛诱导增殖的细胞凋亡的影响
细胞培养：同实施例1。
实验处理及结果测定：细胞消化制备为混悬液接种至24孔细胞培养板，每孔500μl，孵箱中常规培养24h细胞贴壁后弃培养液，加入马里苷10μmol/L24h后，丙酮醛1mmol/L刺激24h，常温固定30min，PBS清洗3次，加入Hoechst33342染液，终浓度为10μg/ml，室温染20min。用PBS液漂洗3次，荧光显微镜下观察并拍照。
实验结果：丙酮醛刺激PC12细胞引起胞内凋亡小体增加，细胞内容物外溢，细胞状态明显变差。而用10μmol/L的马里苷预处理细胞后，发现丙酮醛对PC12细胞的损伤明显减轻(图3)。
《实施例4》利用葡萄糖氧化酶法测定细胞糖消耗
细胞培养：同实施例1.
实验处理：初步细胞处理同实施例1.实验分组马里苷浓度分别为20μmol/L、10μmol/L处理细胞24h后，用丙酮醛1mmol/L损伤细胞24h，对照组不加损伤。
结果测定：每孔取5μl，利用葡萄糖试剂盒检测培养液上清液中的葡萄糖含量。
混匀，37℃孵育15min。用酶标仪在波长550nm处测定吸光度值。
葡萄糖浓度(m mo l/L)＝(样本管吸光度/校准管吸光度)×校准液浓度(mmol/L)。
实验结果：当培养液中加入丙酮醛后,模型组细胞的葡萄糖摄入量明显高于对照组，差异有显著性(P<0.01)，而用20μmol/L、10μmol/L马里苷预处理PC12，与模型组相比，加入马里苷后细胞摄糖量趋于正常水平，在各种浓度的胰岛素刺激下均低于对照细胞(图4)。
《实施例5》细胞中ATP含量的测定
细胞培养：同实施例1.
实验处理：细胞消化制备为混悬液接种至6孔细胞培养板，每孔2ml，孵箱中常规培养24h细胞贴壁后弃培养液，加入马里苷20μmol/L和10μmol/L24h后，丙酮醛1mmol/L刺激24h。
结果测定：吸除培养液，每孔加入200微升裂解液，裂解细胞。裂解细胞时为了裂解充分，使用移液器进行反复吹打使裂解液充分接触并裂解细胞。裂解后4℃12000g离心5-10分钟，取上清，用于后续的测定。加100微升ATP检测工作液到检测孔或检测管内；室温放置3-5分钟，以使本底性的ATP全部被消耗掉，从而降低本底；在检测孔或检测管内加上10微升样品或标准品，迅速用枪(微量移液器)混匀，至少间隔2秒后，立即用luminomete测定RLU值；根据标准曲线计算出样品中ATP的浓度。
实验结果：从图(5)中可见与对照组相比，加入丙酮醛后细胞中ATP含量明显增加(P<0.01)。而预处理20μmol/L和10μmol/L马里苷组与模型组相比，细胞中ATP含量下降至趋于正常对照组的水平。
《实施例6》细胞中乳酸含量的测定
细胞培养：同实施例1。
实验处理：同实施例5。
细胞收集：用细胞刮将细胞刮下来，制成细胞悬液，1000r/min,离心10min,弃上清留细胞沉淀；在细胞沉淀中加入等渗缓冲液，混匀，1000r/min,离心10min，弃上清。重复洗涤2-3次；超声破碎，将细胞悬液置于冰水浴下，超声破碎，破碎好的匀浆进行测定。
结果测定：参考南京建成的乳酸测试说明书进行。在波长530nm处测定各管的吸光度值。细胞中乳酸含量(mmol/L)＝[(测定OD值-空白OD值)/(标准OD值-空白OD值)]×标准品浓度。
实验结果：从图(6)中可以看出与对照组相比，加入丙酮醛后细胞中乳酸含量明显降低(P<0.01)。而预处理20μmol/L马里苷后，细胞中乳酸的含量与模型组相比并没有明显的变化。10μmol/L马里苷组与模型组相比，细胞中乳酸含量则明显升高(P<0.01)。
《实施例7》细胞中ROS含量测定
细胞培养：同实施例1.
实验处理：细胞消化制备为混悬液接种至96孔细胞培养板，每孔100μL，孵箱中常规培养24h细胞贴壁后弃培养液，加入马里苷20μmol/L、10μmol/L、5μmol/L24h后，丙酮醛1mmol/L刺激。装载探针，按照1：1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，终浓度为10微摩尔/升。去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的DCFH-DA。加入的体积以能充分盖住细胞为宜，37℃细胞培养箱内孵育30分钟。中间每隔5分钟摇晃一次，以使探针充分接触细胞。然后用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。
结果测定：荧光酶标仪激发波长488nm，发射波长520nm处检测OD值。
实验结果：从图(7)中可见，加入丙酮醛后，细胞中ROS含量与对照组相比明显升高(P<0.01)。与模型组相比，预处理20μmol/L、10μmol/L、5μmol/L马里苷组，细胞中ROS含量均出现了一定程度的下降，其中20μmol/L和5μmol/L马里苷组ROS水平下降的比较明显(P<0.05)。说明马里苷具有减少氧自由基损伤的作用。
《实施例8》细胞中钙离子浓度的测定
细胞培养：同实施例1.
实验处理：细胞消化制备为混悬液接种至96孔细胞培养板，每孔100μL，孵箱中常规培养24h细胞贴壁后弃培养液，加入马里苷20μmol/L、10μmol/L24h后，装载探针，用培养基将Fura-2AM稀释至浓度为5μM，和细胞一起在37℃孵育50min，即可完成荧光探针的装载。随后，用丙酮醛1mmol/L刺激20min。
结果测定：Fura-2和钙离子结合后，在荧光酶标仪激发波长为340nm，发射波长为510nm检测荧光强度，每隔5min检测一次，共六次。
实验结果：从图(8)中可见，加入丙酮醛后细胞内钙离子浓度均高于对照组(30min除外)，而预处理20μmol/L、10μmol/L马里苷组，细胞内钙离子浓度均低于模型组，5μmol/L马里苷组与模型组无太大差异。说明，丙酮醛能引起细胞内钙离子的内流，使细胞内钙离子超载，从而引起细胞凋亡。而预处理马里苷后，能不同程度地抑制丙酮醛引起的胞内钙离子超载。
《实施例9》细胞中还原型GSH的检测
细胞培养：同实施例1。
实验处理：细胞消化制备为混悬液接种至6孔细胞培养板，每孔2ml，孵箱中常规培养24h，细胞贴壁后弃培养液，加入马里苷10μmol/L和20μmol/L24h后，丙酮醛1mmol/L刺激12h。细胞收集PBS洗涤细胞一次，离心收集细胞，弃去上清。加入细胞沉淀体积3倍量的蛋白去除试剂M溶液，充分涡旋。然后利用液氮和37℃水浴对样品进行两次快速的冻融。冰浴放置5min。4℃，10000g离心10min。取上清液稀释20倍后，准备测定。
结果测定：按照试剂盒说明书进行测定。样品中GSSG含量的准备，取上述稀释好的样品20微升加入1微升稀释的GSH，清除辅助液，立即涡旋混匀。然后加入0.2微升GSH，清除试剂工作液，立即涡旋混匀，25℃反应60min，以清除样品中的GSH；样品的测定参考说明书，使用96孔板依次加入样品或标准品，每个浓度设置5个复孔，加入150微升总谷胱甘肽检测工作液后，混匀，25℃孵育5min。加入25微升的0.16mg/ml NADPH，混匀。反应25min后，在酶标仪405nm处测定吸光度。
实验结果：从图(9)中可见，丙酮醛刺激细胞后，细胞中还原型GSH的量与对照组相比显著下降(P<0.01)，而预处理10μmol/L和20μmol/L马里苷组与模型组相比，细胞中还原型GSH的量明显升高，且趋于正常水平。说明马里苷能够保护PC12免于丙酮醛诱导细胞内GSH含量的下降。
《实施例10》Western Blot检测马里苷对丙酮醛刺激的PC12细胞相关蛋白表达的影响。
细胞培养：同实施例1。
实验处理：细胞消化制备为混悬液，接种至100mm细胞培养皿，每孔2ml，补加8ml含10％FBS的DMEM培养基，至总体积为10ml。孵箱中常规培养至细胞贴壁80％后弃培养液，加入马里苷10μmol/L和5μmol/L24h后，丙酮醛1mmol/L刺激12h，收集细胞。
蛋白含量测定：用BCA试剂盒测定，将10微升标准品或待测样本与200微升WR工作溶液混合，37℃孵育30min，将反应管温度冷却至室温。测定562nm光密度值，绘制标准曲线，并计算蛋白浓度。
蛋白免疫印迹(WesternBlot)总蛋白加样量为10μg，与4×SDS凝胶加样缓冲液混合后，95-100℃热变性10min，用8％-15％的SDS-PAGE胶电泳分离后,将蛋白条带用电转移到硝酸纤维素膜(NC)上,用5％脱脂牛奶4℃封闭过夜室温1小时，取出NC膜，用0.1％Tween-20的TBST冲洗后，加入一抗anti-β-actin(1：1000)，anti-FH(1：1500)，anti-SDHA(1：5000)，anti-TRPA1(1：500)，anti-GLO-1(1：1000)，anti-PDHA(1：1000)(购自Santa Cruz Biotechnology)，4℃孵育过夜，用0.1％Tween-20的TBST冲洗，加入1000倍稀释的二抗(1：10,000)室温孵育1h。用含0.1％Tween的TBST冲洗，将NC膜浸入发光底物溶液中反应lmin,用化学发光仪(GE Healthcare,Little Chalfont,UK)成像。
实验结果：从图(10)中可见，与模型组相比丙酮醛能下调PDHA1、SDHA、TRPA1、GLO-1的表达，而预处理10μmol/L和5μmol/L马里苷组与模型组相比，均能不同程度的上调相关蛋白的表达。
Claims (3)
1.马里苷在制备防治丙酮醛引起的认知功能障碍药物中的应用。
2.权利要求1所述的应用，包含以马里苷为活性成分与药学上可接受的一种或多种载体组成的药物组合物的应用。
3.权利要求1或2所述的应用，包含用常规方法制备的各种药物制剂的应用，如口服给药制剂、注射给药制剂或局部给药制剂，其中：口服给药制剂有片剂、颗粒剂、胶囊剂、糖浆剂、溶液剂、乳剂；注射给药制剂有无菌注射水溶液、无菌注射水包油微乳液、注射用无菌粉末等；局部给药制剂有贴剂、栓剂、霜剂、膏剂、凝胶剂、溶液、混悬液或靶向制剂。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20140820 |