CN103980311A - 一种碳-13同位素标记的溴化膦化合物及制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种结构式(I)的碳-13同位素标记的溴化膦化合物及其制备方法和应用。本发明所述的碳-13同位素标记的溴化膦化合物(C13-TMPP-Ac-OSu)与C12-TMPP-Ac-OSu配合使用,通过质谱分析在从头测序鉴定多肽的同时,利用含有两种不同标记物的同一多肽在质谱中出现的2个信号峰强度进行定量分析,从而实现多肽的从头测序与蛋白质定量分析的同步进行,其分析方法简单,稳定性好,精确度高。
Description
技术领域
本发明涉及一种碳-13同位素标记的溴化膦化合物及制备方法和蛋白质定量应用,属于蛋白质结构分析领域。
背景技术
基于现代生物质谱的蛋白质定量分析技术已经成为目前蛋白质组学研究必不可少的重要工具,可高效测定细胞内蛋白质组的动态变化、研究蛋白质功能、揭示细胞生物机理、寻找疾病蛋白标记物和药物靶标。近年来各种基于质谱的蛋白质定量策略和方法层出不穷,如双向凝胶电泳定量方法(two dimensional electrophoresis,2-DE)、体内同位素代谢标记法(stable isotope labeling with aminoacids in cell culture,SILAC)、同位素化学标记法(isobaric tags forrelative and absolute quantification,iTRAQ)、同位素标签标记定量法(isotope coded affinity tag,ICAT)等。基于质谱的同位素标记定量方法是目前蛋白质质谱定量分析的重要方法,其核心是轻同位素试剂(如C12和N14)和重同位素试剂(如C13和N15)分别化学性标记从不同疾病及其对照组蛋白质酶切消化的肽段N末端,轻重标记的2种样品同比例混合后,使用LC-MS/MS分析,同时定量并鉴定所有的肽段.
但是,这些基于质谱的蛋白质稳定同位素标记定量分析方法都是针对现有的蛋白质序列数据库进行后续的蛋白质鉴定和定量,对于很多基因组未测序的物种的蛋白质鉴定及定量分析无能为力。
多肽从头测序方法(peptide de novo sequencing)能解决现有基于质谱的多肽序列分析方法主要依赖已有的蛋白质序列数据库,对于数据库中不存在的蛋白序列鉴定无能为力的问题,在近年来逐渐受到人们重视。目前已有文献报道《High-confidence de novo peptidesequencing using positive charge derivatization and tandem MS spectramerging.》(An M,Zou X,Wang Q,Zhao X,Wu J,Xu LM,Shen HY,Xiao X,He D,Ji J.Anal Chem.2013May7;85(9):4530-7.),《Efficientand clean charge derivatization of peptides for analysis by massspectrometry.》(An M,Dai J,Wang Q,Tong Y,Ji J.Rapid CommunMass Spectrom.2010Jul15;24(13):1869-74.)使用(N-琥珀酰亚胺基氧代羰基甲基)三(2,4,6-三甲氧苯基)溴化膦((N-Succinimidyloxycarbonylmethyl)tris(2,4,6-trimethoxyphenyl)phosphonium bromide,TMPP-Ac-OSu)专一地对蛋白质N端进行化学标记,结合质谱检测分析实现多肽序列的从头测序,达到精确和高可信度鉴定蛋白的目的。而且,TMPP-Ac-OSu对多肽N端的特异标记能简化质谱MS/MS串联谱图,在基因组未测序种属中蛋白质的从头测序方面具有重要应用。
但是,目前商品化的TMPP-Ac-OSu试剂为C12标记(C12-TMPP-Ac-OSu),基于此标记试剂的质谱分析仅能获得高可信度的从头测序鉴定,不能同时进行蛋白质定量比较分析。
因此,开发一种在多肽从头测序的同时实现蛋白质定量的方法能很好填补这一缺陷,在蛋白质序列鉴定和定量分析领域具有十分重要的意义。
发明内容
为了克服上述技术缺陷,本发明提供了一种碳-13同位素标记的溴化膦化合物(C13-TMPP-Ac-OSu),将其标记的多肽与商品化C12-TMPP-Ac-OSu标记的多肽按照同比例混合后,通过质谱分析可在从头测序鉴定该多肽的同时,对多肽蛋白质进行定量分析,从而同时实现多肽的从头测序和其蛋白质定量。
为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
一种碳-13同位素标记的溴化膦化合物,结构式(I)如下:
本发明第二个目的是提供具有结构式(I)的溴化膦化合物的制备方法,合成路线如下:
所述的结构式(I)的溴化膦化合物的制备方法,包括如下步骤:
1)在无水丙酮中,间苯三酚与13C标记的硫酸二甲酯在催化剂无水碳酸钾作用下回流反应,生成(1′,1″,1″′-13C3)-1,3,5-三甲氧苯(化合物2);
其中,所述13C标记的硫酸二甲酯需每隔10-15分钟加入其总质量的1/4。
2)无水无氧条件下,(1′,1″,1″′-13C3)-1,3,5-三甲氧苯与重蒸过的三氯化磷在无水氯化锌作用下回流反应,生成三[(1′,1″,1″′-13C3)-2,4,6-三甲氧苯基]膦(化合物3);
3)在无水二氯甲烷冰浴中,溴乙酰溴与N-羟基琥珀酰亚胺在吡啶作用下,生成溴乙酸-N-琥珀酰亚胺酯(化合物6);
4)溴乙酸-N-琥珀酰亚胺酯(化合物6)与三[(1′,1″,1″′-13C3)-2,4,6-三甲氧苯基]膦(化合物3)反应,得到式(I)结构的目标产物(13C3-TMPP-Ac-Osu)。
本发明还提供了所述碳-13同位素标记的溴化膦化合物在基于质谱的多肽中蛋白质定量分析中的应用。具体应用为一种含有上述结构式(I)溴化膦化合物的基于质谱的蛋白质定量分析试剂。
所述蛋白质定量分析试剂(C13-TMPP-Ac-OSu试剂)与现有C12-TMPP-Ac-OSu试剂配合使用,可同时实现多肽的从头测序和其蛋白质定量分析。具体步骤如下:
1)蛋白酶解;
将100μg标准蛋白牛血清白蛋白BSA(Sigma公司)用含有5mM二硫苏糖醇(Sigma公司)的20mM碳酸氢钠缓冲液200μL溶解并孵育45分钟,再使用15mM的碘乙酰胺(Sigma公司)在常温黑暗中反应45分钟,加入2μg胰蛋白酶(Promega公司)于37度反应12小时,最后加入0.1%三氟乙酸(Sigma公司)终止反应。
2)TMPP正电荷衍生:
取两份标准蛋白BSA酶解肽段产物分别加入C12-TMPP-Ac-OSu试剂和C13-TMPP-Ac-OSu试剂,再各加入碳酸氢钠缓冲液,反应15-30分钟,加入1%三氟乙酸终止反应,反应产物分别命名为C12-TMPP标记和C13-TMPP标记;
3)将C12-TMPP标记与C13-TMPP标记分别按照1:1比例混合;
4)质谱分析:
取1pmol混合后的正电荷衍生后肽段样品进行质谱分析,对含有两种不同标记物的同一多肽在质谱中出现的两个信号峰强度(C12-TMPP标记与C13-TMPP标记)进行定量分析。
定量分析的步骤如下:通过Xcalibur质谱峰分析软件(ThermoFisher Scientific公司)寻找质量数相差4.5Da的2个匹配离子峰(同一个肽段的离子峰:C12-TMPP标记离子峰+4.5=C13-TMPP标记离子峰),使用Xcalibur计算出2个匹配离子峰的峰强度,从而最终得到多肽蛋白质的定量信息。
公式如下:
蛋白/肽定量信息=C13-TMPP标记离子峰强度/C12-TMPP标记离子峰强度。
其中,肽段样品梯度洗脱条件:B溶液经过6分钟的线性梯度从5%升到17%,再经过75分钟线性梯度从17%升到25%,流量为500纳升每分钟。
质谱仪为LTQ-Orbitrap-ETD XL(ThermoFisher Scientific公司),毛细管的温度为200度,喷雾电压为2千伏,离子透镜值为250。
质谱按照数据依赖模式进行采集,每张一级谱图中选择5个最强的峰做接下来的二级MS/MS谱图,肽段使用CID方式碎裂。
本发明所述的碳-13同位素标记的溴化膦化合物(C13-TMPP-Ac-OSu),能够与商品化C12-TMPP-Ac-OSu配合使用,通过质谱分析在从头测序鉴定多肽的同时,利用同时含有两种不同标记物的同一多肽在质谱中出现的2个信号峰强度进行蛋白质定量分析,从而实现多肽的从头测序与蛋白质定量分析的同步进行,其分析方法简单,稳定性好,精确度高。
附图说明
图1为C13-TMPP-Ac-OSu和C12-TMPP-Ac-OSu联用进行质谱定量的分析结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
实施例113C3-TMPP-Ac-Osu的合成
1、(1′,1″,1″′-13C3)-1,3,5-三甲氧苯(化合物2)的合成
在反应瓶中加入间苯三酚1.92克、无水碳酸钾10.2克、无水丙酮50毫升,在加热回流状态下,用注射器分4批(15分钟间隔)缓慢加入13C标记的硫酸二甲酯6.5克。继续回流反应5小时后,冷却反应液。加入水18毫升,氨水2毫升,室温搅拌1小时。而后用200毫升乙醚萃取反应液,有机相分别用稀盐酸、稀氢氧化钠溶液、饱和食盐水依次洗涤,硫酸镁干燥。除去溶剂后,残余物硅胶柱层析纯化,石油醚-乙酸乙酯混合液洗脱得产物1.2克,产率46%。1H NMR(400MHz,CDCl3):6.08(s,3H),3.77(d,J=143.80Hz,9H).
2、三[(1′,1″,1″′-13C3)-2,4,6-三甲氧苯基]膦(化合物3)的合成
无水无氧条件下,在反应瓶中加入化合物20.785克、无水氯化锌0.25克、重蒸过的三氯化磷0.80毫升,加热回流反应11小时。后处理如下,用甲苯稀释反应混合物,并洗涤反应不溶物几次后用吸管尽量除去甲苯溶液;残余物冰浴下加入氨水10毫升,用50毫升甲苯萃取反应液,有机相用饱和食盐水洗涤,硫酸镁干燥。除去溶剂后,残余物用乙醇-乙醚重结晶得固体0.577克,产率70%。1HNMR(400MHz,CD3CN):6.08(d,J=2.44Hz,6H),3.77(d,J=143.92Hz,9H),3.47(d,J=143.52Hz,18H).
3、溴乙酸-N-琥珀酰亚胺酯(化合物6)
在反应瓶中加入吡啶0.71毫升、无水二氯甲烷10毫升,冰浴下滴加溴乙酰溴(0.76毫升)的二氯甲烷(10毫升)溶液。而后加入N-羟基琥珀酰亚胺0.6克,搅拌反应1小时。反应结束后反应液用饱和食盐水洗涤,硫酸镁干燥。除去溶剂后,残余物用二氯甲烷-石油醚重结晶得固体产物1.12克,产率91%。1H NMR(400MHz,CDCl3):4.10(s,2H),2.87(s,4H).
4、13C3-TMPP-Ac-Osu的合成。
将溴乙酸-N-琥珀酰亚胺酯(化合物6)0.228克溶于7毫升甲苯,三[(1′,1″,1″′-13C3)-2,4,6-三甲氧苯基]膦(化合物3)0.523克溶于10毫升甲苯;随后将两种甲苯溶液混合,马上有固体产物析出。反应液搅拌1小时后,加入石油醚30毫升,过滤,并用石油醚洗涤产物,真空干燥后得目标产物0.756克,产率100%。
经检测,1H NMR(400MHz,CD3CN):6.23(d,J=5.08Hz,6H),4.60(d,J=14.76Hz,2H),3.86(d,J=145.36Hz,9H),3.61(d,J=146.04Hz,18H),2.73(s,4H)。
实施例2:C13-TMPP-Ac-Osu试剂与C12-TMPP-Ac-Osu试剂联用进行多肽从头测序和蛋白质定量分析的可行性评价
使用C12-TMPP-Ac-OSu与C13-TMPP-Ac-OSu分别标记BSA酶解多肽的N末端,通过不同比例混合(1:1,1:2,2:1,1:3,3:1),使用LC-MS/MS进行质谱分析及定量分析,评价本发明所述碳-13同位素标记的溴化膦化合物作为标记试剂与C12-TMPP-Ac-Osu试剂联用进行多肽从头测序和蛋白质定量分析的可行性。
具体步骤如下:
1)蛋白酶解:将100μg标准蛋白牛血清白蛋白BSA用含有5mM二硫苏糖醇的20mM碳酸氢钠缓冲液孵育45分钟,再使用15mM的碘乙酰胺在常温黑暗中反应45分钟,加入2μg胰蛋白酶于37度反应12小时,最后加入0.1%三氟乙酸终止反应。
2)TMPP正电荷衍生:取100μL标准蛋白BSA酶解肽段产物(共1μmol),加入10微升10mM的正常C12-TMPP-Ac-OSu试剂和8μL的20mM碳酸氢钠缓冲液,反应20分钟,反应产物命名为C12-TMPP标记,反应完成后,加入1%三氟乙酸终止反应;另取100μL标准蛋白BSA酶解肽段产物(共1μmol),加入10微升10mM C13标记的C13-TMPP-Ac-OSu试剂和加入8μL的20mM碳酸氢钠缓冲液,反应20分钟,反应产物命名为C13-TMPP标记,反应完成后,加入1%三氟乙酸终止反应。
3)将C12-TMPP标记与C13-TMPP标记分别按照1:1,1:2,2:1,1:3,3:1的比例混合。
4)质谱分析:取1pmol不同比例混合的正电荷衍生后肽段样品分别使用高精度LC-MS/MS质谱仪进行分析。
样品梯度洗脱条件:B溶液经过6分钟的线性梯度从5%升到17%,再经过75分钟线性梯度从17%升到25%,流量为500纳升每分钟。
质谱仪为LTQ-Orbitrap-ETD XL(ThermoFisher Scientific公司),毛细管的温度为200度,喷雾电压为2千伏,离子透镜值为250。
质谱按照数据依赖模式进行采集,每张一级谱图中选择5个最强的峰做接下来的二级MS/MS谱图,肽段使用CID方式碎裂。
5)实验结果
上述按照不同比例混合的C12-TMPP标记与C13-TMPP标记酶解肽段,在质谱中使用质谱定量分析肽段信号强度从而得到定量信息。
实验结果如图1所示:
(A)为C12-TMPP与C13-TMPP标记肽段按1:1比例混合的结果;
(B)为C12-TMPP与C13-TMPP标记肽段按1:2比例混合的结果;
(C)为C12-TMPP与C13-TMPP标记肽段按2:1比例混合的结果;
(D)为C12-TMPP与C13-TMPP标记肽段按1:3比例混合的结果;
(E)为C12-TMPP与C13-TMPP标记肽段按3:1比例混合的结果。
由图1可知,C13-TMPP与C12-TMPP标记多肽的蛋白质的定量结果与其混配比例基本一致,符合本实验预期结果,说明其精确度高。同时,重复上述方法3次,其结果基本一致,说明该分析方法稳定性好。
在实际分析过程中,可按照上述步骤1-4对多肽进行从头测序和蛋白质定量分析,其中,步骤3)中C12-TMPP标记与C13-TMPP标记只需按照1:1比例混合即可。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
Claims (8)
1.一种碳-13同位素标记的溴化膦化合物,其特征在于,结构式(I)如下:
2.一种溴化膦化合物的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
1)在无水丙酮中,间苯三酚与13C标记的硫酸二甲酯在催化剂无水碳酸钾作用下回流反应,生成(1′,1″,1″′-13C3)-1,3,5-三甲氧苯;
2)无水无氧条件下,(1′,1″,1″′-13C3)-1,3,5-三甲氧苯与重蒸过的三氯化磷在无水氯化锌作用下回流反应,生成三[(1′,1″,1″′-13C3)-2,4,6-三甲氧苯基]膦;
3)在无水二氯甲烷冰浴中,溴乙酰溴与N-羟基琥珀酰亚胺在吡啶作用下,生成溴乙酸-N-琥珀酰亚胺酯;
4)溴乙酸-N-琥珀酰亚胺酯与三[(1′,1″,1″′-13C3)-2,4,6-三甲氧苯基]膦反应得到式(I)结构的目标产物。
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,在步骤1)中,所述13C标记的硫酸二甲酯需每隔10-15分钟加入其总用量的1/4。
4.一种蛋白质定量分析试剂,其特征在于,由权利要求1所述的结构式(I)溴化膦化合物制得。
5.权利要求4所述蛋白质定量分析试剂在多肽从头测序及蛋白质定量分析中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述多肽从头测序及蛋白质定量分析方法包括如下步骤:
1)蛋白酶解;
2)TMPP正电荷衍生:
取两份标准蛋白BSA酶解肽段产物分别加入C12-TMPP-Ac-OSu试剂和C13-TMPP-Ac-OSu试剂,再各加入碳酸氢钠缓冲液,反应15-30分钟,加入三氟乙酸终止反应,反应产物分别命名为C12-TMPP标记和C13-TMPP标记;
3)将C12-TMPP标记与C13-TMPP标记分别按照1:1比例混合;
4)质谱分析:
取1pmol混合后的正电荷衍生后肽段样品进行质谱分析,对含有两种不同标记物的同一多肽在质谱中出现的两个信号峰强度进行定量分析。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述肽段样品的梯度洗脱条件:B溶液经过6分钟的线性梯度从5%升到17%,再经过75分钟线性梯度从17%升到25%,流量为500纳升每分钟。
8.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述质谱分析条件:毛细管的温度为200度,喷雾电压为2千伏,离子透镜值为250。
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