CN103980148B - 硬脂酰氨基酸盐及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种硬脂酰氨基酸盐，所述硬脂酰氨基酸具有下述通式（I）所示的结构式，其中，R₁表示H或可以被一个或多个取代基取代的芳香基或C_1‑4的直链或带有支链的烷基，所述取代基为醇羟基或酚羟基；R₂表示C_11‑25的饱和或不饱和脂肪烃基。本发明还公开了硬脂酰氨基酸盐的制备方法和应用。本发明的硬脂酰氨基酸盐，较原型药物硬脂酰氨基酸理化性质优、稳定性好、相对生物利用度高、药效强、安全系数高，有望成为临床治疗神经退行性疾病和急性脑损伤的候选药物，应用前景非常广阔。

Description

硬脂酰氨基酸盐及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种硬脂酰氨基酸盐及其制备方法和应用。

背景技术

脑血管疾病是常见病、多发病；因其高致死高致残性、治疗花费高昂、发病趋于年轻化等特点，严重威胁人类健康。缺血性脑损伤是由于血液循环障碍而导致的常见脑部疾病。脑缺血后，可引起局部脑组织的能量代谢障碍、兴奋性氨基酸细胞毒、钙内流过度、炎症细胞因子释放、自由基损伤等恶性级联反应，最终导致神经元死亡。目前，治疗缺血性脑损伤的神经保护药物种类多，包括谷氨酸受体拮抗剂、谷氨酸释放抑制剂、抗氧化剂、钙离子螯合剂等。由于缺血性脑损伤的病理过程为多因素、多途径的级联过程，而使用上述单一作用机制的药物很难有效阻断缺血性脑损伤的多途径病理过程，因此其临床治疗效果不理想。临床上急需治疗缺血性脑损伤的有效药物。

内源性大麻素系统（endocannabinoid system,ECS）通过参与调控氧化应激、创伤、缺血等病理过程而发挥保护作用。ECS是神经保护药物作用新靶点。ECS在缺血损伤后被激活，突触后神经元按需合成、释放大量内源性大麻素anandamide（AEA）作用于突触前神经元的大麻素受体，负反馈调节受损神经元的多种失常功能，保护受损神经细胞。

本实验室研发的N-硬脂酰氨基酸（如N-硬脂酰酪氨酸，NsTyr）是AEA的新型类似物。它通过干预ECS的代谢环节发挥神经保护作用。前期研究证实NsTyr能明显干预离体脑片、神经元及PC12细胞的多种损伤，显著提高急性缺血损伤沙土鼠模型海马CA1区锥体细胞存活率、并能减轻缺血损伤神经元的凋亡。但是，N-硬脂酰氨基酸水中溶解度小，其用作神经保护药物时，生物利用度不高。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种硬脂酰氨基酸盐，该硬脂酰氨基酸盐与原型药物硬脂酰氨基酸相比较，理化性质优、稳定性好、相对生物利用度显著提高。

此外，还需要提供一种硬脂酰氨基酸盐的制备方法和应用。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:

在本发明的一个方面，提供了一种硬脂酰氨基酸盐，所述硬脂酰氨基酸具有下述通式（I）所示的结构式：

其中，R₁表示H或可以被一个或多个取代基取代的芳香基或C_1-4的直链或带有支链的烷基，所述取代基为醇羟基或酚羟基；R₂表示C_11-25的饱和或不饱和脂肪烃基。

上述C_1-4的烷基是指具有1～4个碳原子的直链或支链烷基，例如：甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基。优选具有1～2个碳原子的烷基。

上述C_11-25的脂肪烃基是指具有11～25个碳原子的饱和或不饱和脂肪烃基，其中，饱和脂肪烃基是指直链或带有支链的烷基、环烷基，如十二烷基、十八烷基、环十二烷基、环十八烷基等，而不饱和脂肪烃基是指链烯基、炔基或链二烯基，链烯基如1-十二烯基、2-十二烯基，炔基如1-十八炔基、2-十八炔基，链二烯基如1，3-十八烯基、7，9-十八烯基等。优选具有17～25个碳原子的直链或支链烷基，特别优选具有17个碳原子的直链烷基。

优选的，所述硬脂酰氨基酸盐具有下述式（Ⅱ）或式（Ⅲ）的结构式：

或

其中，式（Ⅱ）中的M为一价金属阳离子或NH₄ ⁺，式（Ⅲ）中的M为二价金属阳离子。

优选的，所述式（Ⅱ）中的M选自K⁺、Na⁺、或NH₄ ⁺。

优选的，所述式（Ⅲ）中的M选自Ba²⁺、Ca²⁺、或Mg²⁺。

在本发明的另一方面，提供了一种硬脂酰氨基酸盐的制备方法，该方法包括：将下述式（Ⅶ）的N-硬脂酰氨基酸甲酯经碱性水解制得硬脂酰氨基酸盐

优选的，所述式(VII)的N-硬脂酰氨基酸甲酯是通过将下式(VI)化合物

在碱性条件下与下式(V)化合物反应制得

优选的，所述式(VI)化合物是通过下式(IV)化合物与偶合剂1-羟基苯并三唑反应制备

优选的，所述式(IV)化合物是将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、硬脂酸、三乙胺，在催化剂4-二甲氨基吡啶的作用下反应制备而成。

在本发明的另一方面，还提供了一种药物组合物，该组合物包含安全有效量的上述硬脂酰氨基酸盐和药学上可接受的载体。

上述可接受的载体是无毒的、能辅助施用并且对硬脂酰氨基酸盐的治疗效果没有不利影响。此类载体可以是本领域的技术人员通常能得到的任何固体赋形剂、液体赋形剂、半固体赋形剂或者在气雾剂组合物中可以是气体赋形剂。固体药物赋形剂包括淀粉、纤维素、滑石、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸镁、硬脂酸钠、甘油硬脂酰酯、氯化钠、无水脱脂乳等。液体和半固体赋形剂可以选自甘油、丙二醇、水、乙醇和各种油，包括那些源于石油、动物、植物或人工合成的油，例如，花生油、豆油、矿物油、芝麻油等、优选的液体载体，特别是用于可注射溶液的，包括水、盐水、葡萄糖水溶液和甘醇。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。

本发明的硬脂酰氨基酸盐以治疗上的有效量施用，其施用方式可以是口服、全身施用（例如，透过皮肤的、鼻吸入的或者用栓剂）或肠胃外施用（例如，肌肉内、静脉内或皮下）。优选的施用方式是口服，它可根据疾病程度调节。

本发明的硬脂酰氨基酸盐的实际施用量（即活性组分）依赖于许多因素，如待治疗疾病的严重性、治疗对象的年龄和相对健康程度、所使用的化合物的效能、施用途径和形式，以及其他因素。

本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规方法制备。例如使该硬脂酰氨基酸盐（活性成分）与一种或者多种载体混合，然后将其制成所需的剂型，如片剂、药丸、胶囊、半固体、粉末、缓释剂型、溶液、混悬液、配剂、气雾剂等等。

在本发明的另一方面，还提供了上述硬脂酰氨基酸盐在制备神经保护药物中的应用，所述神经保护药物包括治疗脑缺血、脑中风、阿尔茨海默病、或帕金森病的药物。

本发明的硬脂酰氨基酸盐，较原型药物硬脂酰氨基酸理化性质优、稳定性好、易储存、相对生物利用度高、药效强，治疗窗口大、安全系数高。在缺血再灌注模型上，硬脂酰氨基酸盐能显著减小脑梗塞面积，减轻缺血引起的脑水肿及神经损伤；显著改善实验动物神经缺陷功能评分，并可提高动物对空间的学习和记忆能力。由阿尔茨海默病小鼠疾病模型的实验结果可知，硬脂酰氨基酸盐能明显改善阿尔茨海默病的症状。因此，本发明的硬脂酰氨基酸盐有望成为临床治疗神经退行性疾病和急性脑损伤的候选药物，应用前景非常广阔。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明实施例4的平衡溶解度曲线及表观脂水分配系数曲线图；

图2是本发明实施例4的大鼠经口服灌胃NsTyr-2K、NsTyr后的血药浓度-时间曲线图；

图3是本发明实施例5的NsTyr-2K对神经行为学评分结果图；

图4是本发明实施例5的NsTyr-2K对脑缺血动物在避暗试验中潜伏期（图4A）和5min内错误次数（图4B）的结果图；

图5是本发明实施例5的NsTyr-2K对脑缺血沙鼠在Morris水迷宫试验中上台潜伏期（图5A）和第Ⅰ象限游泳时间百分比（图5B）的结果图；

图6是本发明实施例6的开场实验结果图；

图7是本发明实施例6的高架十字迷宫实验结果图；

图8是本发明实施例6的疲劳转棒仪实验结果图；

图9是本发明实施例6的NsTyr-2Na对转基因小鼠在Morris水迷宫实验中学习和记忆障碍的改善结果图；

图10是本发明实施例6的NsTyr-2Na对转基因小鼠在Morris水迷宫实验中行为改善结果图；

图11是本发明实施例6的NsTyr-2Na对转基因小鼠在Morris水迷宫空间探索实验游泳轨迹的影响图；

图12是本发明实施例7小鼠口服NsTyr-2K后的体重变化趋势图；

图13是本发明实施例7小鼠口服NsTyr-2K后的脏器系数图。

具体实施方式

实施例1活性酯法制备N-硬脂酰氨基酸

本实施例采用活性酯法制备N-硬脂酰氨基酸，活性酯法可批量制备硬脂酰氨基酸，适用于工业生产。下面以N-硬脂酰酪氨酸（NsTyr）的活性酯法制备为例详细描述活性酯法的反应步骤。

1.活性酯法制备N-硬脂酰酪氨酸的整个反应步骤

如下述反应步骤所示，活性酯法应用N,N-二环己基碳酰亚胺DCC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS，NHS在脱水剂DCC作用下与硬脂酸生成活性酯后直接与L-酪氨酸反应，生成N-硬脂酰酪氨酸。其中，THF为四氢呋喃。

2.中间体N-羟基琥珀酰亚胺硬脂酸酯的制备

1000ml圆底烧瓶中加入硬脂酸100g（352mmol）、N-羟基琥珀酰亚胺60g（521mmol）及无水THF800ml，溶解，冰浴搅拌加入90gDCC（436mmol），搅拌2h，室温下继续反应12h。滤除白色固体副产物N，N-二环己基脲DCU，滤液蒸干，所得粗产物室温下以甲醇重结晶，得中间体银白色片状结晶76.2g，产率83.6%，m.p.76-79℃。

3.N-硬脂酰酪氨酸的制备

5000ml圆底烧瓶中加入L-酪氨酸100g（550mmol）、碳酸氢钠265g（2500mmol）、2000ml蒸馏水，加热溶解，室温下搅拌加入1000ml含100g（262mmol）中间体的THF溶液，搅拌过夜。TLC确认反应完毕后，滤除白色不溶物，滤液减压蒸去THF。浓缩物加入1000ml蒸馏水后用1mol/L盐酸溶液调节pH至1，析出白色固体。热乙酸乙酯（每次500ml）加入该混悬液中，待固体溶解后，分液乙酸乙酯相，重复上述操作一次，合并有机相，饱和食盐水（1000ml）洗涤一次，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液蒸干得白色粗产品。粗产品以甲醇/丙酮于室温下重结晶，得白色固体74.3g，产率62.1%，m.p.100-103.4℃。

实施例2一锅法制备N-硬脂酰氨基酸

本实施例采用一锅法制备N-硬脂酰氨基酸，一锅法反应条件温和，不受氨基酸溶解度与体系pH限制，产率和纯度较理想。下面以N-硬脂酰酪氨酸（NsTyr）的一锅法制备为例详细描述一锅法的反应步骤。

1.一锅法制备N-硬脂酰酪氨酸甲酯的整个反应步骤

室温下，以1-羟基苯并三唑HOBT为偶合剂，4-二甲氨基吡啶DMAP为催化剂，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐在碱性条件下与预先合成的L-酪氨酸甲酯用一锅法合成N-硬脂酰酪氨酸甲酯。

2.酪氨酸甲酯的制备

25ml两颈瓶一侧颈接干燥管，另一颈接滴液漏斗，加入5ml无水甲醇，冰盐浴条件下滴加0.8ml乙酰氯，搅拌30min，得盐酸甲醇。另一100ml圆底烧瓶内加入0.905gL-酪氨酸，5ml甲醇。搅拌加入盐酸甲醇，溶液澄清后，回流24h。反应液无水硫酸钠干燥、过滤，滤液挥干溶剂，得L-酪氨酸甲酯盐酸盐，黄色片状结晶。向该固体加入饱和碳酸氢钠溶液（20ml）至不再产生气泡，二氯甲烷（30ml）萃取2次，干燥有机相，蒸干，得L-酪氨酸甲酯黄色固体1.07g，产率为95.6%。

3.N-硬脂酰酪氨酸甲酯（一锅法）

250ml圆底烧瓶中加入硬脂酸1.704g（6mmol)，三乙胺1.22ml（9.8mmol），1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐0.920g（4.8mmol），4-二甲氨基吡啶(DMAP)0.029g（0.24mmol），1-羟基苯并三唑（HOBT）0.648g（4.8mmol），L-酪氨酸甲酯1.11g（4.8mmol）及80ml二氯甲烷，室温搅拌24h，TLC监控。粗产品中加入1mol/L盐酸溶液洗涤至不再出现白色絮状物，二氯甲烷萃取3次，合并有机相；在上述收集的有机相中加入饱和碳酸氢钠溶液洗涤至不再产生气泡，经二氯甲烷萃取3次，合并有机相；饱和食盐水溶液洗涤以上收集的二氯甲烷相，无水硫酸钠干燥，浓缩，得粗制品1.4g。硅胶柱层析，展开剂二氯甲烷/甲醇（4/1）得L-硬脂酰酪氨酸甲酯，白色粉末588.6mg，产率82.7%，m.p.100-104℃。

产物加入10ml1mol/L氢氧化钾甲醇溶液后70℃回流3h，澄清液4℃冷藏24h。过滤，得粗产品，丙酮淋洗2-3次，干燥，得白色固体NsTyr-2K608.1mg，产率95.6%。

实施例3制备N-硬脂酰氨基酸盐

1.N-硬脂酰酪氨酸钾盐、钠盐、铵盐制备

250ml圆底烧瓶中加入1mol/L氨水40ml，60ml水溶解，边搅拌边加入NsTyr16g（36mmol），加热60℃至溶液澄清，4℃冷藏24h。过滤，得淡黄色固体，丙酮淋洗2-3次，干燥，得NsTyr-2NH₄白色粉末状固体10.7g，产率为62.3%。

采用以上方法，以5g（125mmol）氢氧化钠代替1mol/L氨水40ml，得NsTyr-2Na白色粉末状固体15.7g，产率89.4%。

采用以上方法，以5g（89mmol）氢氧化钾代替1mol/L氨水40ml，得NsTyr-2K白色粉末状固体17.9g，产率95.6%。

2.N-硬脂酰酪氨酸钡盐、镁盐、钙盐制备

250ml圆底烧瓶中加入60ml含16g（92mmol）氢氧化钡水溶液，边搅拌边加入NsTyr16g（36mmol），80℃至溶液澄清，4℃冷藏72h。过滤，得深黄色固体，丙酮淋洗2-3次，干燥，得(NsTyr)₂Ba白色颗粒状固体15.4g，产率为83.6%。

采用以上方法，以10g（119mmol）碳酸镁代替16g（92mmlol）氢氧化钡，得(NsTyr)₂Mg白色颗粒状固体11.9g，产率72.6%。

采用以上方法，以10g（100mmol）碳酸钙代替16g（92mmlol）氢氧化钡，得(NsTyr)₂Ca白色颗粒状固体12.8g，产率76.7%。

实施例4N-硬脂酰氨基酸盐理化常数与药动学参数的测试实验

1.平衡溶解度与表观脂水分配系数

采用摇瓶法测定37℃时NsTyr、NsTyr-2K、NsTyr-2Na水中平衡溶解度。NsTyr溶解度低于100μg/100ml水，NsTyr-2K、NsTyr-2Na溶解度分别为513.704μg/100ml水，926.551μg/100ml水；NsTyr-2K、NsTyr-2Na的表观脂水分配系数logp分别为1.512、1.477。不同pH下NsTyr-2K、NsTyr-2Na的平衡溶解度测试数据见表1、表观脂水分配系数见表2。平衡溶解度曲线及表观脂水分配系数曲线如图1所示。

表1NsTyr-2K、NsTyr-2Na在不同pH的缓冲液中的平衡溶解度

pH值NsTyr-2K（mg/L）	NsTyr-2Na（mg/L）
		2.049.290	66.938
3.058.504	66.334
		4.0188.155	195.371
5.0220.693	232.102
		6.0243.482	274.629
7.0251.430	318.016
		7.4270.414	374.484
8.0285.935	463.902
		9.0369.807	512.644

表2NsTyr-2K、NsTyr-2Na在不同pH缓冲液中的表观脂水分配系数

pH值	NsTyr-2KKo/w	LogP	NsTyr-2NaKo/w	LogP
					2.0	76.020	1.881	49.913	1.698
3.0	30.571	1.485	28.980	1.462
					4.0	16.020	1.205	15.224	1.183
5.0	21.934	1.341	18.710	1.272

6.0	28.935	1.461	19.963	1.300
					7.0	37.855	1.578	31.436	1.497
7.4	16.674	1.222	29.286	1.467
					8.0	13.797	1.140	28.704	1.458
9.0	13.140	1.119	21.872	1.340

由以上表1、表2的平衡溶解度与表观脂水分配系数的数据，以及图1可知，胃内低pH使大量NsTyr-2K、NsTyr-2Na被还原成原型药存在，透过生物膜吸收发挥药效；进入肠段后，其平衡溶解度急剧增大，表观脂水分配系数骤降，药物主要以离子形式存在，难以透过生物膜吸收入血。较原型药，NsTyr-2K，NsTyr-2Na溶解度均有显著提高。

2.稳定性评估

原型药硬脂酰氨基酸长期储存时易出现吸潮结块发黄等问题，现将其改造成活性盐类形式后按中华人民共和国2010年药典记载的原料药稳定性测定方法测试NsTyr-2K、NsTyr-2Na的稳定性。经相关影响因素（高温、高湿、强光）试验、加速试验、长期试验后，NsTyr-2K、NsTyr-2Na性质稳定，相关检测项目（外观、增重、熔点、纯度）差异均小于5%，符合药典标准。因而NsTyr-2K较其原型药稳定性更好。

3.吸收动力学数据

10只150-180g的SD大鼠随机分为2组，每组5只，雌雄兼用。灌胃给予200mg/kg的NsTyr与NsTyr-2K生理盐水溶液后，平均血药浓度-时间曲线分别见图2。SD大鼠口服200mg/kg的NsTyr与NsTyr-2K后的代谢动力学参数见表3。

表3大鼠口服200mg/kgNsTyr与NsTyr-2K后的代谢动力学参数

通过比较两者代谢动力学参数，NsTyr-2K相比NsTyr曲线下面积AUC增大了30倍，相对生物利用度显著提高，半衰期明显延长（近两倍）；峰浓度Cmax的大幅提升（约20倍）和达峰时间Tmax的锐减，提示NsTyr-2K在体内吸收速率大，可适当减少给药剂量，有利于降低毒副反应发生几率，增大治疗窗口和安全系数。制备剂型上，受溶解度限制NsTyr呈混悬液形式；溶解度高的盐类NsTyr-2K可制备成均质溶液。

实施例5 N-硬脂酰氨基酸盐对脑缺血再灌注损伤所致神经行为学障碍的保护作用

以N-硬脂酰氨基酸钾盐NsTyr-2K为例，采用全脑缺血再灌注损伤沙鼠动物模型，通过被动避暗实验、Morris水迷宫空间学习记忆功能等行为学指标的变化评估整体动物层面上NsTyr-2K对脑缺血再灌注损伤所致神经行为学障碍的保护作用。

1.急性脑缺血再灌注模型神经行为学评分

如图3所示，神经行为学评分结果表明：假手术组(正常组)无1例脑缺血症状，故记为0分。与假手术组(正常组)比较，缺血模型组出现明显的神经功能障碍，神经系统功能评分明显高于假手术组，为3.1±0.32(P＜0.01)。与缺血模型组相比，NsTyr-2K 15、30、60mg/kg三个剂量组缺血导致的神经损伤症状依次减小，分别为1.76±0.48、1.25±0.31和1.21±0.33，有剂量效应关系；尼膜同(阳性对照组)对照组为1.12±0.31。

2.避暗试验

采用避暗试验评估NsTyr-2K对正常动物学习记忆能力的影响。结果如图4所示，与假手术组(正常组)比较，缺血组沙鼠5min内错误次数明显增加，潜伏期明显缩短。NsTyr-2K15、30、60mg/kg三个剂量组和尼膜同对照组(阳性)较缺血组5min内错误次数明显减少(图4B)，潜伏期显著延长(图4A)。

3.Morris水迷宫试验

结果如图5所示，训练第1天正常沙鼠上台潜伏期为56.3±7.42s，游泳距离为6030.1±711.73cm，随着训练次数的增加，动物通过学习和记忆水下平台位置，上台潜伏期和游泳距离不断缩短，至第4天正常动物潜伏期降至29.8±12.55s，游泳距离降至3216.5±1026.46cm。训练第1-2天，缺血组沙鼠的平均上台潜伏期以及上台前游泳距离与其它各组相比并无明显差别；随着训练次数的增加，各组动物到达平台的潜伏期及游泳距离不断缩短，缺血组与其它各组的差别逐渐显现并在第4天最显著。与缺血组相比，NsTyr-2K 30、60mg/kg两组和尼膜同(阳性)对照组在训练第3、4天动物找到水下平台的时间和游泳距离均明显缩短，具有统计学意义，而15mg/kg NsTyr-2K治疗组与模型组相比无明显差别(图5A)。实验第5天撤除平台的探索试验中，缺血组动物在平台所在象限(第Ⅰ象限)中游泳的时间百分比和距离百分比明显低于假手术组(正常组)和30，60mg/kg NsTyr-2K治疗组以及尼膜同对照组(图5B)，具有统计学差异(P＜0.05)。

实施例6 N-硬脂酰氨基酸盐对老年痴呆和帕金森症所致神经行为学障碍的治疗作用

1.实验材料

开场实验材料：自发活动观察箱(80X80X30)，箱子顶部装有日光灯作为照明系统，箱顶正中固定一个与计算机相连的CCD摄像头。摄像头与计算机相连，动物行为学计算机图像分析系统(上海移数科技信息有限公司)。

高架十字迷宫材料：由两个相对的开放臂和两个相对的封闭臂，一个连接四只臂的中央平台和围绕在开放臂边缘的1cm高的矮挡板组成(目的是防止动物在探究过程中不慎滑下迷宫)。除四个臂的底板及中央平台为黑色。迷宫底板调节到距实验室地面50cm处。动物行为学计算机图像分析系统(上海移数科技信息有限公司)。

疲劳转棒仪实验：转棒式疲劳仪YLS-4C(上海移数科技信息有限公司)。

水迷宫实验：恒温游泳池，小鼠站台，动物行为学计算机图像分析系统(上海移数公司)。

实验动物：C57BL/6J(来自jackson lab实验室)(APP/PS1/TAU转基因鼠)C57BL/6J(TAU转基因鼠)。APP/PS1/TAU转基因鼠和TAU转基因鼠均为阿尔茨海默病小鼠疾病模型。

NsTyr-2Na(本教研室自行合成)。

2.实验方法参考下面三篇文献：

[1]Priscila Cagni,Mrilia Barros.Cannabinoid type 1receptor ligandsWIN 55,212-2and AM251alter anxiety-like behaviors of marmoset monkeys in anopen-field test.Behavioural Brain Research 2013；240:91-94.

[2]Filali M,Lalonde R,Theriault P,Julien C,Calon F,Planel E.Cognitivean non-cognitive behaviors in the triple transgenic mouse model of Alzheimer’s disease expressing mutated APP,PS1,and Mapt(3xTg-AD).Behavioural BrainResearch 2012；234:334-342.

[3]John CS,Currie PJ.N-Arachidonoyl-serotonin in the basolateralamygdale increases anxiolytic behavior in the elevated plus maze.BehaviouralBrain Research 2012；233:382-388.

3.实验结果

3.1 开场实验

原理：开场实验主要用于评价小鼠焦虑性及对外界的探索行为，小鼠天然具有探索未知领域及保护自我免受外界潜在伤害的双重能力，因此，开场实验通过记录小鼠在开场环境的边缘区停留时间及在中央区(产生焦虑区)停留时间来检测小鼠的该特性。同时也可以衡量小鼠的运动速度等运动相关能力。

实验结果如图6所示：图6A，B表明，APP/PS1/TAU转基因小鼠分别在开场实验活动区域中间与活动路程中有显著性差异。给不同剂量的NsTyr-2Na(低剂量：15mg/kg；中剂量：30mg/kg；高剂量45mg/kg)，不能改变其在中间区域的时间，高剂量组能增加其活动路程。说明NsTyr-2Na能提高转基因鼠的活动能力，但是不能改变其低焦虑状态。其中，图6A是APP/PS1/TAU转基因鼠对不同剂量药物所产生的时间差异性，图6A中，Control：正常组；Apptl model：APP/PS1/TAU转基因小鼠；low：低剂量组(15mg/kg)；medium：中剂量组(30mg/kg)；high：高剂量组(45mg/kg)；Y：阳性组，石杉碱甲；下面图6B-D同。从图6A中看出模型与正常组之间有差异性，加药组有趋势但无差异性。图6B是APP/PS1/TAU转基因鼠运动路程的变化图，从图6B中看出，模型与正常组有差异性，同时高剂量组能提高其运动能力。

图6C、D表明，TAU转基因鼠同样与正常组相比在开场实验中活动能力与在中间活动区域有显著性差异。中剂量组和高剂量组，同时能提高转基因鼠的活动能力，也能减低其在中间活动区域的时间，能改变其低焦虑状态。图6C是TAU转基因鼠中间区域运动时间的变化图，从图6C中看出，转基因动物模型在中间区域运动时间变长，说明其处于低焦虑状态，并且高剂量药物能降低其低焦虑状态。图6D是TAU转基因鼠运动路程的变化图，从图6D中看出，转基因动物模型组活动能力明显降低，中高剂量组都能引起自主活动增强。

图6中，“#”指与正常组相比，P<0.05；“*”指与模型动物相比，P<0.05，“**”指与模型动物相比，P<0.01。

3.2 高架十字迷宫实验

原理：高架十字迷宫(High plus maze)是利用动物对新异环境的探究特性和对高悬敞开臂的恐惧形成矛盾冲突行为来考察动物的焦虑状态。高架十字迷宫具有一对开臂和一对闭臂，啮齿类动物由于嗜暗性会倾向于在闭臂中活动，但出于好奇心和探究性又会在开臂中活动，在面对新奇刺激时，动物同时产生探究的冲动与恐惧，这就造成了探究与回避的冲突行为，从而产生焦虑心理。

实验结果如图7所示：图7A表明，APP/PS1/TAU转基因小鼠产生低焦虑状态，不同剂量的NsTyr-2Na不能改变这种现象，但是中剂量组有此趋势。图7B表明，TAU转基因小鼠相对正常组产生低焦虑状态，并且有显著性差异。同时加入不同剂量的NsTyr-2Na后，能改变低焦虑状态。高剂量有显著性差异。图7中，“#”指与正常组相比，P<0.05；“*”指与模型动物相比，P<0.05。

3.3 疲劳转棒仪实验

原理：疲劳转棒仪是研究药物对动作协调能力和抗疲劳性实验的研究。

实验结果如图8所示，APP/PS1/TAU转基因小鼠运动协调能力明显降低。不同剂量NsTyr-2Na，高剂量组能明显改善此现象。图8中，“#”指与正常组相比，P<0.05；“*”指与模型动物相比，P<0.05。

3.4水迷宫实验

原理：Morris水迷宫，测试程序主要包括定位航行试验和空间探索试验两个部分。其中定位航行试验(place navigation)历时数天，每天将小鼠面向池壁分别从4个入水点放入水中若干次，记录其寻找到隐藏在水面下平台的时间(逃避潜伏期，escape latency)。空间探索试验(spatial probe)是在定位航行试验后去除平台，然后任选一个入水点将小鼠放入水池中，记录其在一定时间内的游泳轨迹，考察小鼠对原平台的记忆。

实验结果如图9、10、11所示：

图9表明在定位航行实验中随着训练次数的增加，动物通过学习和记忆水下平台位置，上台潜伏期和游泳距离不断缩短，其中图9A表明APP/PS1/TAU三转基因老鼠中，模型组在第四天与正常组比较有显著性差异^#P<0.05,但第四天加药组与模型组无显著性差异；至第五天，中剂量组和高剂量组有显著性差异^*P<0.05，提示Nstyr-2Na能一定程度上提高老年痴呆老鼠学习记忆能力，并呈现一定剂量依赖性。图9B表明在TAU单转基因老鼠中，模型组在第四天与正常组比较有显著性差异P<0.05,并且第四天高剂量组与模型组有显著性差异，至第五天，中剂量组和高剂量组都有显著性差异^*P<0.05，提示NsTyr-2Na能一定程度上提高老年痴呆老鼠学习记忆能力，并且呈现一定剂量依赖性。同时，由于三转基因老鼠，同时存在三种基因型，相对单转基因老鼠，痴呆程度加重，猜测对单转基因老鼠，NsTyr-2Na能比较快的提高其学习记忆能力。

图10表明实验第五天撤除平台的探索试验中，APP/PS1/TAU三转基因老鼠在（第三象限）中游泳的时间百分比明显低于正常组，高剂量组具有统计学意义。在TAU单转基因老鼠在（第三象限）中游泳的时间百分比明显低于正常组，中剂量组和高剂量组都具有统计学意义。说明NsTyr-2Na能一定程度上提高其空间探索能力。同时单转基因模型恢复程度相对三转基因老鼠较好，与定位航行实验数据相吻合。

图11表明，转基因鼠在空间探索实验中，由运动轨迹图显示正常组相对模型组穿越平台次数明显较多，且在第三象限提留时间较长，同时运动路程较长，在APP/PS1/TAU三转基因老鼠中，仅高剂量组能提高其空建探索能力。而在单转基因老鼠中，中、高剂量都可提高其空间探索能力，与图9，图10数据吻合。

结论：

阿尔茨海默病模型小鼠表现为认知、判断、思维、记忆等神经系统功能异常。从以上实验可以看出，NsTyr-2Na能明显改善阿尔茨海默病小鼠神经系统异常症状。而且，在开场实验和疲劳转棒实验中，NsTyr-2Na能明显提高模型小鼠的运动能力，提示其作用还与多巴胺通路有关。因此，本发明的N-硬脂酰氨基酸盐不仅对阿尔茨海默病（即老年痴呆）有一定的 治疗意义，同时对帕金森症也有潜在的治疗前景。

实施例7急性毒性试验

1.体重变化趋势

小鼠口服NsTyr-2K后，称重。结果如图12所示，对照组小鼠体重在0-15天内平稳增长，给药高、低剂量的两组小鼠出现明显体重下降的现象，并在给药后8天，与正常组之间差值达到最大。但随着采食量的恢复，体重亦随之快速增长，在实验期末，三组小鼠的体重间没有显著差异。

2.脏器系数变化情况

给药NsTyr-2K15天后，研究小鼠脏器（脑、心、肺、肝和肾）变化情况。

急性毒性实验结果显示，NsTyr-2K具有很高的安全性，LD₅₀>2000mg/kg。对于给药组的昆明小鼠，除在给药一周内出现食欲减退、体重减轻外无其他行为学异常现象，且给药组小鼠体重在实验末期恢复到与对照组相近水平。脏器系数研究提示，高剂量NsTyr-2K对昆明小鼠的脑、心脏和肝脏系数产生一定影响（见图13），可能是由于NsTyr-2K对以上组织的亲和力相对较高，但在急性毒性的极高剂量给药条件下受试动物行为学上并未出现如惊厥、反射异常或运动障碍等中枢神经受损的常见表现，说明在该剂量下小鼠脑组织并没有受到严重损伤，安全性仍是较高的。因而在日后成药性研究时需要针对这肝脏和心脏可能的副作用做进一步长期安全性评估以及精准给药剂量的确定工作。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (6)

1.一种硬脂酰氨基酸盐，其特征在于，该硬脂酰氨基酸盐为硬脂酰酪氨酸盐，其具有下述式(Ⅱ)或式(Ⅲ)的结构式：

其中，式(Ⅱ)中的M选自K⁺、Na⁺或NH₄ ⁺，式(Ⅲ)中的M选自Ba²⁺、Ca²⁺或Mg²⁺。

2.一种权利要求1所述硬脂酰氨基酸盐的制备方法，其特征在于，该方法包括：将下述式(Ⅺ)的N-硬脂酰酪氨酸甲酯经碱性水解制得硬脂酰酪氨酸盐

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述式(Ⅺ)的N-硬脂酰酪氨酸甲酯是通过将下述式(Ⅸ)和式(Ⅹ)两化合物在碱性条件下反应制得

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述式(Ⅹ)化合物是通过下式(Ⅷ)化合物与偶合剂1-羟基苯并三唑反应制备

该式(Ⅷ)化合物是将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、硬脂酸、三乙胺，在催化剂4-二甲氨基吡啶的作用下反应制备而成。

5.一种药物组合物，其特征在于，该组合物包含安全有效量的权利要求1所述硬脂酰氨基酸盐和药学上可接受的载体。

6.权利要求1所述的硬脂酰氨基酸盐在制备神经保护药物中的应用，所述神经保护药物包括治疗脑缺血、脑中风、阿尔茨海默病、或帕金森病的药物。