CN103977426A - 一种nir sers探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种NIR SERS探针，包括金纳米棒GNRs以及包裹在金纳米棒GNRs表面上的导电聚合物CP。还可以在所述导电聚合物CP表面上分布有稳定剂聚乙烯吡咯烷酮PVP，该探针成本低廉、制备简单、低毒、结构稳定、兼具成像和治疗作用；本发明还公开了上述NIR SERS探针的制备方法，该制备方法工艺简洁，成本低廉，成功率高。本发明还进一步公开了上述NIR SERS探针在SERS成像以及在制备具有光热治疗作用的药物中的应用。
Description
技术领域
本发明属于NIR SERS技术领域，具体涉及一种NIR SERS探针及其制备方法和应用。
背景技术
拉曼散射(Raman scattering)：一种光子的非弹性散射现象。当光线从一个原子或分子散射出来时，绝大多数的光子，都是弹性散射的，这称为瑞利散射。在瑞利散射下，散射出来的光子，跟射入时的光子，它的能量、频率与波长是相同的。然而，有一小部份散射的光子(大约是一千万个光子中会出现一个)，散射后的频率会产生变化，通常是低于射入时的光子频率，原因是入射光子和介质分子之间发生能量交换。这即是拉曼散射。根据拉曼散射效应可以得到物质拉曼光谱，每一种物质都具有自己独特的拉曼光谱，即分子指纹图谱。
表面增强拉曼散射(surface-enhanced Raman scattering,SERS)：当一些分子吸附在某些粗糙的金属(如金、银和铜等)表面时，其拉曼信号会得到极大的增强，这一现象就叫SERS效应。SERS的增强因子可高达1014～1015。
表面增强拉曼散射(surface-enhanced Raman scattering,SERS)技术已经发展为一种极有价值的光学诊断及成像技术，它能够提供强烈的吸附在贵金属纳米结构表面物质的分子振动信息，可为疾病的诊断和成像提供丰富的分子指纹光谱信息。与传统的荧光技术相比，SERS不易受到样品自发荧光的干扰且无光致褪色的现象出现，适合于样品的长期观测；另外，与超宽的荧光光谱相比，SERS光谱带宽很窄，特别适合于肿瘤的多组分标记与成像。鉴于这些优点，SERS成像技术已经逐渐发展为一种荧光替代技术用于肿瘤的标记与成像。肿瘤的SERS成像方式可分为两种：第一种是利用肿瘤组织本身的分子指纹特征进行成像。另一种成像方式是在金属粒子表面连接一些拉曼标记(此类分子具有谱峰归属明确且SERS信号强的特点)，利用标记分子的SERS信号实现肿瘤细胞的快速、高灵敏成像。目前常用的SERS标记包括结晶紫、亚甲基蓝和巯基苯甲酸等有机染料。但是这类标记毒性强，且往往受限于可见激发光源(组织穿透能力弱)，不适合深层组织的检测与成像。
近红外(near-infrared,NIR)光是指780-2526nm区域的电磁辐射。构建灵敏度高、近红外(NIR)光可激发的SERS标记是拉曼研究领域中的一大趋势，因为NIR光可以穿透 很厚的生物组织，实现深层组织区域的SERS成像。一些在NIR区有强烈吸收的有机染料可以被设计为NIR SERS探针，如Cy5、Rh6G、DTTC、Cy7和Cy7.5等。另外，若将SERS活性基底的表面等离子体共振(SPR)吸收峰调节至与激发光的波长匹配时，将会得到更强的SERS信号。在NIR区有吸收的活性基底主要有纳米棒、空心纳米结构、纳米星和纳米花等。其中，金纳米棒(gold nanorods,GNRs)是一种呈棒状的金纳米结构。金纳米棒(GNRs)由于具有制备简单、且NIR吸收强且波长可调，已经成为制备NIR SERS探针的首选(von Maltzahn G,Centrone A,Park JH,Ramanathan R,Sailor MJ,Hatton TA,et al.SERS-Coded Gold Nanorods as a Multifunctional Platform for Densely Multiplexed Near-Infrared Imaging and Photothermal Heating.Adv Mater.2009；21:3175-80,Jiang L,Qian J,Cai F,He S.Raman reporter-coated gold nanorods and their applications in multimodal optical imaging of cancer cells.Anal Bioanal Chem.2011；400:2793-800.Zhang Y,Qian J,Wang D,Wang Y,He S.Multifunctional gold nanorods with ultrahigh stability and tunability for in vivo fluorescence imaging,SERS detection,and photodynamic therapy.Angew Chem Int Ed Engl.2013；52:1148-51等)。值得注意的是，现有的NIR拉曼标记绝大多数是有机染料，面临着较大的生物安全性问题。另一方面，将有机染料牢固地附着在金属粒子表面也不是一件容易的事情。
肿瘤NIR光热治疗是近年来快速发展起来的一种新型肿瘤治疗手段，具有疗效好、副作用低的特点。由于生物组织对NIR光吸收很少，因此造成的热损伤很小。NIR光热治疗利用一些产热试剂(如纳米材料、有机染料等)在肿瘤部位富集的特性，将这些试剂吸收的电磁能转化成热能达到杀死肿瘤细胞而对周围组织无损伤的目的。GNRs是目前在肿瘤NIR光热治疗中应用得最为广泛且成功的纳米粒子。因此，以GNRs为基件构建成的NIR SERS探针不仅可以作为有效的肿瘤成像试剂，还可以用于高效的肿瘤NIR光热治疗。然而，新鲜制备出的GNRs表面往往附着有残余的CTAB分子，具有较强的细胞毒性；而且，GNRs的结构不够稳定，其棒状结构在大功率、长时间的NIR激光照射下容易发生熔解。
现有NIR SERS探针的制备技术主要是通过逐步组装的方法将拉曼探针(Raman report)和高聚物稳定剂分步结合到SERS活性基底上，首先将GNRs与NIR拉曼探针水溶液混合数分钟，然后加入巯基化的聚乙二醇(PEG-SH)，搅拌数小时使得PEG-SH充分附着在GNRs，最后残余的拉曼探针分子通过透析(24h-48h)的方法去除，基于GNRs的NIR SERS探针制备过程如图1中所示。但该技术还存在以下缺点：(1)成本高，现 有的NIR有机染料大多是通过化学合成的，生产工艺较复杂，因而NIR拉曼探针大多比较昂贵；PEG-SH的价格也不菲，往往mg级别的PEG-SH就需要上千元，另外，因为巯基的存在，PEG-SH不易保存，极易被氧化；(2)细胞毒性较大，有机染料的使用往往都具有很大的细胞毒性，即便修饰了PEG后，其细胞毒性仍然不可忽视；(3)结构稳定性差，该技术中NIR染料仅仅是靠非共价的作用力吸附在GNRs表面，在复杂的生理环境中难免会发生脱落的现象；另一方面，GNRs本身的结构亦不够稳定，其棒状结构在大功率、长时间的NIR激光照射下容易发生熔解。
现有技术中还有以GNRs为核的NIR光热纳米材料制备技术，具体为：由于GNRs本身的结构不够稳定，在运用于NIR光热治疗时往往需选用一些封装材料将GNRs包裹住，以保证GNRs的棒状结构在大功率、长时间的激光照射下的完整性。介孔二氧化硅(SiO2)是目前应用得最为广泛的封装材料。首先用氨水将GNRs调节至pH10，然后将正硅酸乙酯(TEOS)乙醇溶液缓慢逐滴地加入，混合液保持在40℃缓慢搅拌24h。合成的产物采用离心的方法回收，残余的CTAB分子用离子交换法去除。为保证合成产物(GNRs-SiO2)在生理环境下的稳定性，可以先对包被层SiO2进行功能化修饰，然后选用对应功能化的PEG进行共价连接(如：APTES修饰的GNRs-SiO2可用NHS-PEG-MAL连接；用OTMS的话，采用DSPE-PEG连接；亦可直接用PEG-SH连接)。
NIR有机染料也可以与TEOS同时加入至GNRs溶液中，这样可以在封装的过程中也包裹进了NIR拉曼探针，制备得到的NIR SERS标记结构更稳定，采用SiO2作为GNRs的封装材料的NIR SERS探针制备过程如图2中所示。但该技术也存在以下缺点：(1)合成工艺较难掌控，该方法对实验者的技术要求较高，实验条件较难控制，经常会出现封装不均一，甚至空囊SiO2的情况。(2)制备成本也比较高，以SiO2为封装材料制备NIRSERS标记依旧是避免不了使用NIR有机染料和功能化的PEG稳定试剂，制备成本很难降下来。
因此，需要开发出一种成本低廉、制备简单、低毒、结构稳定、兼具成像和治疗的NIR SERS探针。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种NIR SERS探针，该探针成本低廉、制备简单、低毒、结构稳定。
本发明的第二个目的在于提供上述NIR SERS探针的制备方法，该制备方法工艺简 洁，成本低廉，成功率高。
本发明的第三个目的在于提供上述NIR SERS探针在SERS成像以及在制备具有光热治疗作用的药物中的应用。
本发明的第一个目的是通过如下技术方案来实现的：一种NIR SERS探针，包括金纳米棒GNRs以及包裹在金纳米棒GNRs表面上的导电聚合物CP。
导电聚合物(conducting polymer,CP)是一种具导电性的高分子聚合物，又称导电塑胶与导电塑料，最简单的例子是聚乙炔。当高分子结构拥有延长共轭双键，离域π键电子不受原子束缚，能在聚合链上自由移动，经过掺杂后，可移走电子生成空穴，或添加电子，使电子或空穴在分子链上自由移动，从而形成导电分子。常见的导电聚合物有、聚苯胺、聚吡咯、聚噻吩、聚对苯乙烯撑以及它们的衍生物等。
由于CP层具有丰富的共轭结构，为保证GNRs-CP核壳粒子在生理环境中的稳定性，选用生物相容性好且廉价的高分子——聚乙烯吡咯烷酮(PVP)作为稳定剂。PVP只需与GNRs-CP混合搅拌数小时即可与纳米粒子稳定连接，多余的PVP可通过离心去除。
即作为本发明的一种改进，为了进一步增强NIR SERS探针的稳定性，本发明在所述导电聚合物CP表面上还可以分布有稳定剂聚乙烯吡咯烷酮PVP。
本发明所述导电聚合物CP的厚度优选为5～10nm，所述导电聚合物CP优选为聚吡咯、聚苯胺或聚噻吩。
本发明的第二个技术目的是通过以下技术方案来实现的：上述NIR SERS探针的制备方法，含以下步骤：
(1)在水溶液中将金纳米棒GNRs与CP单体材料混合，得混合液；
(2)在混合液中加入厚度调节剂，搅拌0.5～1h后，加入氧化剂，继续常温搅拌24～48h后，离心收集沉淀，即得到主要由金纳米棒GNRs以及包裹在金纳米棒GNRs表面上的导电聚合物CP组成的NIR SERS探针。
作为本发明的一种改进，为了增强NIR SERS探针的稳定性，本发明步骤(2)中还能在沉淀中加入稳定剂聚乙烯吡咯烷酮PVP，搅拌混匀后，即得到主要由金纳米棒GNRs、包裹在金纳米棒GNRs表面上的导电聚合物CP以及分布在所述导电聚合物CP表面上的稳定剂聚乙烯吡咯烷酮PVP组成的NIR SERS探针。
在上述制备方法中：
本发明步骤(1)中所述的金纳米棒GNRs优选为金纳米棒GNRs的2倍浓缩液，所述CP单体材料优选为吡咯、苯胺或噻吩，所述CP单体材料与金纳米棒GNRs的2倍浓缩液 的体积比优选为1:2000～2500，所述单体材料在混合液中的体积百分含量优选为0.02～0.03％。
本发明步骤(2)中所述的厚度调节剂优选为十二烷基硫酸钠SDS，其终浓度优选为7～18mM。
本发明加入厚度调节剂十二烷基硫酸钠SDS调节导电聚合物CP的厚度，得到分散性、均一性较好的GNRs-CP核壳纳米材料；不加入厚度调节剂SDS的话，制备得到的产品形态则是大片大片的无规则CP聚合材料，真正以核壳结构存在的粒子很少，因此在制备NIR SERS探针的过程中，需要加入厚度调节剂十二烷基硫酸钠SDS。
本发明步骤(2)中所述的氧化剂优选为氯化铁FeCl3或过硫酸铵APS水溶液，其中氯化铁FeCl3终浓度优选为0.5～0.7mM，过硫酸铵APS水溶液的终浓度优选为3～5mM。
本发明中PVP仅起到稳定剂的作用，因此对用量没有太多的要求，只要保证其稍微过量就行，过量的PVP可通过离心去除。
作为本发明的一种优选的实施方式，本发明所述的稳定剂聚乙烯吡咯烷酮PVP的终浓度优选为1.5～2.5mg/mL。
本发明中的终浓度是指在加入该物质后的最终混合液中该物质的最终浓度。
本发明的第三个技术目的是通过以下技术方案来实现的：上述NIR SERS探针在SERS成像以及在制备具有光热治疗作用的药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明选用的高分子导电聚合物既可作为保证SERS活性基底结构稳定性的封装材料，其本身又具有极好的拉曼特征可作为新颖的NIR SERS标记，CP材料的这种双重性质大大简化了SERS探针的设计；
(2)本发明NIR SERS探针成本低廉、制备容易，制备CP封装层的原材料如苯胺和吡咯、反应中使用的氧化剂、厚度调节剂十二烷基硫酸钠SDS以及最后选用的稳定试剂PVP等的价格都非常低廉，同时实验条件仅需在室温下搅拌即可完成反应，操作非常简单、成功率极高；
(3)本发明制备的NIR SERS探针功能多样，GNRs-CP是一个新颖的高性能兼具成像与治疗的纳米试剂，GNRs-CP不仅可以作为新颖的NIR SERS探针用于生物成像，它还具有相较于GNRs更为高效的光热转换效率以及更为稳定的空间结构，极为适合用于肿瘤NIR光热治疗；
(4)本发明制备的NIR SERS探针具有低毒性，相比于GNRs，GNRs-CP的细胞毒 性很小，具有良好的生物相容性。
附图说明
图1是本发明背景技术中提供的基于GNRs的NIR SERS探针制备过程示意图；
图2是本发明背景技术中提供的采用SiO2作为GNRs的封装材料的NIR SERS探针制备过程示意图；
图3是本发明实施例3和4中提供的NIR SERS探针(GNRs-CP)的制备过程示意图；
图4是本发明实施例3和4中制备获得的NIR SERS探针(GNRs-CP)的TEM图像，其中a.GNRs，b.聚吡咯包裹的GNRs(GNRs-PPy)，c.聚苯胺包裹的GNRs(GNRs-PANI)；
图5是本发明实施例3和实施例4中制备获得的NIR SERS探针(GNRs-CP)的拉曼表征图谱，其中左图为聚吡咯包裹的GNRs(GNRs-PPy)的拉曼表征图谱，右图为聚苯胺包裹的GNRs(GNRs-PANI)的拉曼表征图谱；
图6是实施例5中GNRs-CP对人肺腺癌A549细胞的毒性；
图7是实施例6中GNRs-CP作为NIR SERS探针应用于A549细胞体外成像，其中a-c:GNRs-PANI探针(a:A549显微图像；b:SERS图像(选取1170cm-1峰作图)；c:a和b重叠图)；e-g:GNRs-PPy探针(e:A549显微图像；f:SERS图像(选取945cm-1峰作图)；g:e和f重叠图)；d:从所标识的细胞区域获取的SERS谱线；h-k:A549细胞的双色SERS成像(i:GNRs-PANI；j:GNRs-PPy；k:h,i和j的重叠图像)；
图8是实施例6中GNRs-CP作为NIR SERS探针应用于Balb/c小鼠肿瘤成像，其中a:在体拉曼扫描示意图；b:分别从肿瘤区域和正常背部(control)区域获取的拉曼谱线；c1,c2:以GNRs-PANI为探针的SERS成像(上：肿瘤区域；下：正常背部区域)；c3,c4:以GNRs-PPy为探针的SERS成像(上：肿瘤区域；下：正常背部区域)；
图9是实施例7中NIR激光照射下纳米粒子溶液的温度变化曲线；
图10A是实施例7中GNRs-CP作为NIR光热治疗试剂应用于体外的肿瘤剥离实验结果图；
图10B是实施例7中GNRs-CP作为NIR光热治疗试剂应用于体内的肿瘤剥离实验结果图。
具体实施方式
实施例1
本实施例采用成本低廉的导电聚合物(Conducting polymer,CP)对GNRs进行封装，导电聚合物不仅可以作为GNRs的保护材料，其本身还可以作为一种新型的NIR拉曼标记。本实施例提供的NIR SERS探针，包括金纳米棒GNRs以及包裹在金纳米棒GNRs表面上的导电聚合物CP，其中导电聚合物CP选用聚吡咯。
NIR SERS探针具体的制备过程如下：
(1)制备金纳米棒GNRs，具体制备方法参阅文献Ali MR,Snyder B,El-Sayed MA.Synthesis and optical properties of small Au nanorods using a seedless growth technique.Langmuir.2012；28:9807-15，将制备得到的金纳米棒GNRs反应液采用离心(10000rpm,30min)的方法进行纯化，最后往沉淀中加入相当于0.5倍反应液体积(该反应液体积指未离心前金纳米棒GNRs反应液体积)的超纯水，可获得金纳米棒GNRs的2倍浓缩液；
(2)在水溶液中将金纳米棒GNRs的2倍浓缩液与CP单体材料吡咯混合，金纳米棒GNRs的2倍浓缩液与CP单体材料吡咯二者的体积比为2500:1，同时加入十二烷基硫酸钠(SDS)至其终浓度为18mM用以调节CP包被层的厚度，聚吡咯PPy层的厚度约为9nm，搅拌1h后加入摩尔浓度为0.1M的氧化剂氯化铁至氧化铁的终浓度约为0.6mM，继续常温缓慢搅拌48h，以保证吡咯在氧化剂氯化铁的作用下在金纳米棒表面聚合形成聚吡咯，最后离心(10000rpm,20min)收集沉淀，即制备获得主要由金纳米棒GNRs以及包裹在金纳米棒GNRs表面上的导电聚合物CP(聚吡咯)组成的NIR SERS探针。
实施例2
本实施例采用成本低廉的导电聚合物(Conducting polymer,CP)对GNRs进行封装，导电聚合物不仅可以作为GNRs的保护材料，其本身还可以作为一种新型的NIR拉曼标记。本实施例提供的NIR SERS探针，包括金纳米棒GNRs以及包裹在金纳米棒GNRs表面上的导电聚合物CP，其中导电聚合物CP选用聚苯胺。
该NIR SERS探针的具体制备过程过程如下：
(1)制备金纳米棒GNRs，具体制备方法参阅文献Ali MR,Snyder B,El-Sayed MA.Synthesis and optical properties of small Au nanorods using a seedless growth technique.Langmuir.2012；28:9807-15，将制备得到的金纳米棒GNRs反应液采用离心(10000rpm,30min)的方法进行纯化，最后往沉淀中加入相当于0.5倍反应液体积(该反应液体积指未离心前金纳米棒反应液体积)的超纯水，可获得金纳米棒GNRs的2倍浓缩液；
(2)在水溶液中将金纳米棒GNRs的2倍浓缩液与CP单体材料苯胺混合，金纳米棒GNRs的2倍浓缩液与CP单体材料苯胺二者的体积比为2500:1，同时加入十二烷基硫酸钠SDS至其终浓度为7mM，用以调节CP包被层的厚度，聚苯胺PANI层的厚度约为8nm，搅拌1h后加入摩尔浓度为1M的氧化剂过硫酸铵至其终浓度约为4mM，继续常温缓慢搅拌48h，以保证苯胺在氧化剂的作用下在金纳米棒表面聚合形成聚苯胺，最后离心(10000rpm,20min)收集沉淀，即制备获得主要由金纳米棒GNRs以及包裹在金纳米棒GNRs表面上的导电聚合物CP(聚苯胺)组成的NIR SERS探针。
实施例3
本实施例采用成本低廉的导电聚合物(Conducting polymer,CP)对GNRs进行封装，导电聚合物不仅可以作为GNRs的保护材料，其本身还可以作为一种新型的NIR拉曼标记。该NIR SERS探针包括金纳米棒GNRs以及包裹在金纳米棒GNRs表面上的导电聚合物CP，在所述导电聚合物CP表面上还分布有稳定剂聚乙烯吡咯烷酮PVP，其中导电聚合物CP选用聚吡咯。
该NIR SERS探针的具体制备过程如下：
(1)制备金纳米棒GNRs，具体制备方法参阅文献Ali MR,Snyder B,El-Sayed MA.Synthesis and optical properties of small Au nanorods using a seedless growth technique.Langmuir.2012；28:9807-15，将制备得到的金纳米棒GNRs反应液采用离心(10000rpm,30min)的方法进行纯化，最后往沉淀中加入相当于0.5倍反应液体积(该反应液体积指未离心前金纳米棒GNRs反应液体积)的超纯水，可获得金纳米棒GNRs的2倍浓缩液；
(2)在水溶液中将金纳米棒GNRs的2倍浓缩液与CP单体材料吡咯混合，金纳米棒GNRs的2倍浓缩液与CP单体材料吡咯二者的体积比为2000:1，同时加入十二烷基硫酸钠SDS至其终浓度为15mM，用以调节CP包被层的厚度，聚吡咯PPy层的厚度约为8nm，搅拌0.5h后加入摩尔浓度为0.1M的氧化剂氯化铁至其终浓度约为0.6mM，继续常温缓慢搅拌24h，以保证吡咯在氧化剂的作用下在金纳米棒表面聚合，最后离心，10000rpm,20min，收集沉淀；
(3)由于CP层具有丰富的共轭结构，为保证GNRs-CP核壳粒子在生理环境中的稳定性，选用生物相容性好且廉价的高分子—聚乙烯吡咯烷酮(PVP)作为稳定剂，在步骤(2)的沉淀中加入聚乙烯吡咯烷酮PVP至其终浓度为2mg/mL，PVP只需与GNRs-CP混合搅拌数小时即可与纳米粒子稳定连接，多余的PVP可通过离心去除，即可得到主要由金纳米棒GNRs、包裹在金纳米棒GNRs表面上的导电聚合物CP以及分 布在所述导电聚合物CP表面上的稳定剂聚乙烯吡咯烷酮PVP组成的NIR SERS探针。
本实施例制备获得的聚吡咯包裹的GNRs(GNRs-PPy)TEM图以及GNRs的TEM图见图4。
实施例4
本实施例采用成本低廉的导电聚合物(Conducting polymer,CP)对GNRs进行封装，导电聚合物不仅可以作为GNRs的保护材料，其本身还可以作为一种新型的NIR拉曼标记。该NIR SERS探针包括金纳米棒GNRs以及包裹在金纳米棒GNRs表面上的导电聚合物CP，在所述导电聚合物CP表面上还分布有稳定剂聚乙烯吡咯烷酮PVP，其中导电聚合物CP选用聚苯胺。
该NIR SERS探针的具体制备过程如下：
(1)制备金纳米棒GNRs，具体制备方法参阅文献Ali MR,Snyder B,El-Sayed MA.Synthesis and optical properties of small Au nanorods using a seedless growth technique.Langmuir.2012；28:9807-15，将制备得到的金纳米棒GNRs反应液采用离心(10000rpm,30min)的方法进行纯化，最后往沉淀中加入相当于0.5倍反应液体积(该反应液体积指未离心前金纳米棒GNRs反应液体积)的超纯水，可获得金纳米棒GNRs的2倍浓缩液；
(2)在水溶液中将金纳米棒GNRs的2倍浓缩液与CP单体材料苯胺混合，金纳米棒GNRs的2倍浓缩液与CP单体材料苯胺二者的体积比为2000：1，同时加入厚度调节剂十二烷基硫酸钠SDS至其终浓度为10mM，用以调节CP包被层的厚度，至PANI层的厚度约为9nm，搅拌0.5h后加入摩尔浓度为1M的氧化剂过硫酸铵至其终浓度约为3.5mM，继续常温缓慢搅拌24h，以保证苯胺在氧化剂的作用下在金纳米棒表面聚合，最后离心，10000rpm,20min，收集沉淀；
(3)由于CP层具有丰富的共轭结构，为保证GNRs-CP核壳粒子在生理环境中的稳定性，选用生物相容性好且廉价的高分子—聚乙烯吡咯烷酮(PVP)作为稳定剂，在步骤(2)的沉淀中加入聚乙烯吡咯烷酮PVP至其终浓度为1.5mg/mL，PVP只需与GNRs-CP混合搅拌数小时即可与纳米粒子稳定连接，多余的PVP可通过离心去除，即可得到主要由金纳米棒GNRs、包裹在金纳米棒GNRs表面上的导电聚合物CP以及分布在所述导电聚合物CP表面上的稳定剂聚乙烯吡咯烷酮PVP组成的NIR SERS探针。
本实施例制备获得的聚吡咯包裹的聚苯胺包裹的GNRs(GNRs-PANI)TEM图见图4。
图4显示的是GNRs及其修饰产物(GNRs-CP)的透射电镜(TEM)图像，可以很明显的看到棒状结构。图4b和图4c分别显示的是聚吡咯(PPy)和聚苯胺(PANI)修饰后的核壳纳米结构，可以很明显地看到外层的导电聚合物存在。从图5的拉曼表征图谱中可以看到，GNRs-CP对CP本身的拉曼信号有极大的增强。而且这一增强效应是跟激发光波长直接相关的，采用514nm激光激发时，几乎没有SERS信号出现；但是，当激发光换成近红外光(785nm)时，则有极强的SERS信号出现。这一现象表明，CP材料不仅可以用来封装GNRs粒子，还有望作为一种极好的NIR拉曼标记运用在SERS成像领域。这也就免去了外加有毒的NIR有机染料的麻烦。
实施例5GNRs-CP的细胞毒性
选用人肺腺癌(A549)细胞为模型，采用噻唑蓝(MTT)法检测细胞活力。将不同浓度的纳米材料与细胞一同孵育，24h后加入MTT，继续孵育4h后，用酶标仪检测490nm吸收值，图6显示了实施例3和实施例4中两种GNRs-CP核壳纳米粒子对A549细胞的毒性。可以看到，通过MTT细胞活力检测法检测得到，未经过修饰的GNRs表现出了非常明显的细胞毒性，在100μM的浓度(一般Au纳米粒子的应用浓度)下，A549细胞仅有约40％的细胞存活。与之对应的是，GNRs-CP对A549细胞的毒性很小，特别是GNRs-PPy，即便处理浓度达到200μM，A549细胞仍然保持着超高的细胞活力。这表明，GNRs-CP具有很好的生物相容性。
实施例6GNRs-CP的NIR SERS活性
1、体外NIR SERS成像
将GNRs-CP作为NIR SERS探针应用于A549细胞成像，结果如图7中所示，在图7中，a-c:GNRs-PANI探针(a:A549显微图像；b:SERS图像(选取1170cm-1峰作图)；c:a和b重叠图)；e-g:GNRs-PPy探针(e:A549显微图像；f:SERS图像(选取945cm-1峰作图)；g:e和f重叠图)；d:从所标识的细胞区域获取的SERS谱线；h-k:A549细胞的双色SERS成像(i:GNRs-PANI；j:GNRs-PPy；k:h,i和j的重叠图像)。
将GNRs-CP作为超灵敏的NIR SERS探针，可实现A549细胞的快速SERS成像。首先，将细胞接种至拉曼衬底上，培养至70％融合后，加入GNRs-CP(实施例3和4中的)与细胞共孵育4h后，取出拉曼衬底，PBS清洗3遍，中性甲醛固定10min，清洗干净后置于显微拉曼光谱仪下扫描(785nm激发光)。结果如图7，GNRs-PANI和GNRs-PPy均可实现细胞的超快成像(扫描一个50×50像素图像仅需2-3min)。选取SERS谱中信号最明显的峰(GNRs-PANI：1170cm-1；GNRs-PPy：945cm-1)进行图像描绘，得到了清晰的 细胞SERS图像。同时可以发现，纳米粒子主要分布于细胞质内，而不能进入细胞核。由于拉曼的窄谱特性，使得多种拉曼标记可以同时使用，实现细胞的多色成像。将GNRs-PANI和GNRs-PPy以一定的比例同时加入细胞培养液中，实现了A549细胞的双色成像(图7j)。
2、体内NIR SERS成像
将GNRs-CP作为NIR SERS探针应用于Balb/c小鼠肿瘤成像，具体如图8中所示，在图8中，a:在体拉曼扫描示意图；b:分别从肿瘤区域和正常背部(control)区域获取的拉曼谱线；c1,c2:以GNRs-PANI(实施例4)为探针的SERS成像(上：肿瘤区域；下：正常背部区域)；c3,c4:以GNRs-PPy(实施例3)为探针的SERS成像(上：肿瘤区域；下：正常背部区域)。
以乳腺癌荷瘤Balb/c小鼠为体内实验模型，将浓缩的GNRs-CP PBS溶液通过瘤内注射进入肿瘤内，24h后将小鼠麻醉，置于显微拉曼光谱仪下进行NIR拉曼扫描(图8a)。比较分别从肿瘤区域及正常背部区域获取的拉曼谱可以发现，肿瘤的拉曼谱线中出现了明显的可归属于GNRs-CP的拉曼峰，如1170cm-1(GNRs-PANI)和945cm-1(GNRs-PPy)(图8b)。将此特征用于二维拉曼扫描，可实现肿瘤的在体NIR SERS成像(图8c)。
实施例7GNRs-CP的NIR光热治疗活性
在NIR区强烈的光吸收特性使得GNRs-CP在肿瘤的光热治疗领域有着巨大的潜力。将纳米粒子溶液稀释至100μM，置于808nm(2.5W/cm2)激光下，用热电偶温度计监测不同时间点的液体温度。绘制成的温度变化曲线如图9，可以发现在相同浓度下GNRs-CP(实施例3和实施例4)溶液的温度上升趋势明显高于GNRs。激光照射了5min后，GNRs-CP溶液的温度可高达约90℃，比GNRs溶液高出20℃，这表明CP的修饰能够显著增强金纳米结构的NIR光热转换效率，更有利于肿瘤的NIR光热治疗。有报道表明，CP包裹能够显著增强金纳米粒子在激光照射下的结构稳定性。GNRs-CP也表现出了良好的结构稳定性，将纳米粒子置于808nm(2.5W/cm2)激光下照射1h后发现，原本呈棕红色的GNRs溶液颜色明显变淡，并有沉淀发生，说明未修饰的GNRs结构发生了崩解；而GNRs-CP溶液的颜色则未发生变化，也无沉淀产生。
选用A549细胞作为体外光热实验细胞模型。首先将细胞提前接种于96孔板内，生长至80％融合后，加入不同浓度的纳米粒子与细胞共孵育4h，然后进行NIR激光处理(808nm，2.5W/cm2，1min)。照射完换上新鲜培养液，继续孵育24h后用MTT法检测细胞活力。结果可见图10A，在50μM的浓度下，GNRs处理的肿瘤细胞未发现明显的死亡(细 胞活力﹥95％)，而GNRs-CP处理组的细胞活力则发生了显著下降。当剂量增加一倍时，可以发现绝大多数肿瘤细胞都被杀死。体内实验采用乳腺癌荷瘤Balb/c小鼠模型：体外培养的4T1细胞积累到足够量(2×107个/mL)后皮下注射入Balb/c小鼠侧腹，生长1周。然后将纳米粒子通过瘤内注射进入肿瘤，24h后激光照射(808nm，2.5W/cm2，5min)，观察激光照射后肿瘤变化情况。图10B显示了两种GNRs-CP的体内肿瘤剥离效果，可以看到激光照射后小鼠肿瘤部位立刻就变成青紫色，甚至有激光烧灼导致的血痂出现。10天后，肿瘤区域仅留下疤痕并结痂，这表明GNRs-CP具有很好的肿瘤光热剥离效果。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种NIR SERS探针，其特征是：包括金纳米棒GNRs以及包裹在金纳米棒GNRs表面上的导电聚合物CP。
2.根据权利要求1所述的NIR SERS探针，其特征是：在所述导电聚合物CP表面上还分布有稳定剂聚乙烯吡咯烷酮PVP。
3.根据权利要求1或2所述的NIR SERS探针，其特征是：所述导电聚合物CP的厚度为5～10nm，所述导电聚合物CP为聚吡咯、聚苯胺或聚噻吩。
4.权利要求1所述的NIR SERS探针的制备方法，其特征是含以下步骤：
(1)在水溶液中将金纳米棒GNRs与CP单体材料混合，得混合液；
(2)在混合液中加入厚度调节剂，搅拌0.5～1h后，加入氧化剂，继续常温搅拌24～48h后，离心收集沉淀，即得到主要由金纳米棒GNRs以及包裹在金纳米棒GNRs表面上的导电聚合物CP组成的NIR SERS探针。
5.根据权利要求4所述的NIR SERS探针的制备方法，其特征是：步骤(2)中还能在沉淀中加入稳定剂聚乙烯吡咯烷酮PVP，搅拌混匀后，即得到主要由金纳米棒GNRs、包裹在金纳米棒GNRs表面上的导电聚合物CP以及分布在所述导电聚合物CP表面上的稳定剂聚乙烯吡咯烷酮PVP组成的NIR SERS探针。
6.根据权利要求4或5所述的NIR SERS探针的制备方法，其特征是：步骤(1)中所述的金纳米棒GNRs为金纳米棒GNRs的2倍浓缩液，所述CP单体材料为吡咯、苯胺或噻吩，所述CP单体材料与金纳米棒GNRs的2倍浓缩液的体积比为1:2000～2500，所述单体材料在混合液中的体积百分含量为0.02～0.03％。
7.根据权利要求4或5所述的NIR SERS探针的制备方法，其特征是：步骤(2)中所述的厚度调节剂为十二烷基硫酸钠SDS，其终浓度为7～18mM。
8.根据权利要求4或5所述的NIR SERS探针的制备方法，其特征是：步骤(2)中所述的氧化剂为氯化铁FeCl3或过硫酸铵APS水溶液，其中氯化铁FeCl3的终浓度为0.5～0.7mM，过硫酸铵APS水溶液的终浓度为3～5mM。
9.根据权利要求5所述的NIR SERS探针的制备方法，其特征是：所述的稳定剂聚乙烯吡咯烷酮PVP的终浓度为1.5～2.5mg/mL。
10.权利要求1-3任一项所述的NIR SERS探针在SERS成像以及在制备具有光热治疗作用的药物中的应用。
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