CN103965295A - BLyS拮抗肽、含TA-Fc融合蛋白基因的质粒及TA-Fc融合蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明公开了BLyS拮抗肽、含TA-Fc融合蛋白基因的质粒及TA-Fc融合蛋白，BLyS拮抗肽，是用SEQ ID NO.1所示，所述BLyS拮抗肽命名为TA。BLyS拮抗肽TA能够抑制BLyS与TACI的相互作用。TA-Fc融合蛋白可以和BLyS结合，并且抑制BLyS与TACI的相互作用。TA-Fc融合蛋白保障了拮抗肽TA的空间结构和稳定性，同时又不削弱肽的活性。TA-Fc融合蛋白可以作为潜在的BLyS拮抗剂应用于自身免疫疾病和淋巴瘤的研究治疗。

Description

BLyS拮抗肽、含TA-Fc融合蛋白基因的质粒及TA-Fc融合蛋白

技术领域

本发明属于生物医药领域，特别是涉及命名为TA的BLyS拮抗肽、含TA-Fc融合蛋白基因的质粒及TA-Fc融合蛋白。

背景技术

B淋巴细胞刺激因子(B lymphocyte stimulator,BLyS)，又称为B细胞激活因子(B cellactivating factor belonging to the TNF family,BAFF)，是TNF家族中的一员。由单核细胞和巨噬细胞持续合成、分泌。BAFF能够结合B细胞表面的三种受体，B细胞成熟抗原(B cell matureantigen,BCMA)，跨膜激活物和CAML结合物(Transmembrane activator and CAML-interactor,TACI)以及BAFF受体3(BR3)。受体结合BAFF后，偶联TNF受体相关因子(TNF receptorassociated factor,TRAF)，激活NF-ΚB途径。最终，诱导抗细胞凋亡基因：Bcl-2、Bcl-xL的表达，减少成熟B细胞的凋亡。如果敲除BAFF，小鼠体内的成熟B细胞完全缺失。因此，BAFF在B细胞的发育和成熟过程中起至关重要的作用。

由于BLyS在B淋巴细胞活化、增殖中发挥重要作用，而B淋巴细胞产生的抗体所介导的体液免疫在众多已发现的自身免疫性疾病当中处于中心地位。因此，目前认为BLyS在体内的过量表达与某些自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮（SLE）、类风湿性关节炎（RA）、口眼干燥综合征(Siogren)等病程的发生、发展密切相关。过量表达BLyS的转基因小鼠出现系统性红斑狼疮样症状(13)。临床实验也发现，SLE和Siogren综合征病人的血清中，可溶性BLyS明显高于正常人。同时，作为B细胞刺激、存活因子，BLyS及其受体参与骨髓瘤和淋巴瘤的发生和发展。因此，以阻断BLyS生物学功能为策略，探讨BLyS拮抗剂治疗系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎等自身免疫性疾病和B细胞肿瘤疾病的研究正在国外如火如荼的进行中。目前，针对BLyS的抑制剂的研究主要集中在研制具有中和BLyS作用的BLyS诱饵受体（decoy receptor）、抗BLyS抗体和拮抗肽（1，2）。2011年3月美国FDA批准由人类基因科学公司（Human Genome Sciences）和葛兰士-史克（GlaxoSmithKline）公司联合研发的抗BLyS抗体BENLYSTA(Belimumab)治疗系统性红斑狼疮。这是50年来，FDA首次批准治疗该类疾病的药物。因此，BLyS拮抗剂有着广泛的临床应用前景。

众多研究已经详细阐述BLyS与受体相互作用的可能模式及关键氨基酸。所以，针对BLyS与其受体结合核心区域的拮抗肽也成为BLyS抑制剂的策略。我们在前期工作中探讨了BLyS拮抗肽抑制BLyS的功能，初步结果显示：合成的16个氨基酸肽体外能够部分抑制BLyS的作用（3）。进一步通过计算机分子模建、优化设计BLyS拮抗肽，将有望提高其抑制BLyS生物学功能。为开发治疗SLE和RA这类自身免疫性疾病和B细胞肿瘤的新药奠定实验研究基础。

1.Sun J（孙剑）,Lin Z,Feng J,Li Y and Shen B(2008)BAFF-targeting therapy,a promisingstrategy for treating autoimmune diseases.Eur J Pharmacol597:1–5.

2.Sun J（孙剑）,Lin Z,Feng J,Li Y and Shen B(2008)B lymphocyte stimulator,a new target fortreating B cell malignancies.Chinese Medical J121(14):1319-1323.

3.Sun J（孙剑）,Feng J,Li Y and Shen B(2006)A novel BLyS antagonist peptide designed basedon the3-D complex structure of BCMA and BLyS.Biochem Biophys Res Commun346(4):1158-1162.

与抗体和诱饵蛋白等大分子拮抗剂相比，多肽具有分子量小、渗透性强、人工合成简单、免疫原性低，毒性低和副作用少的优点。然而，多肽也存在不稳定、效率低和半衰期短的缺点。

发明内容

本发明的目的是提供一种能抑制BLyS与TACI的相互作用的BLyS拮抗肽。

本发明的第二个目的是提供一种含TA-Fc融合蛋白基因的质粒。

本发明的第三个目的是克服现有技术的不足，提供一种保障拮抗肽的空间结构和稳定性，同时又不削弱肽的活性的TA-Fc融合蛋白。

本发明的技术方案概述如下：

BLyS拮抗肽，是用SEQ ID NO.1所示，所述BLyS拮抗肽命名为TA。

含TA-Fc融合蛋白基因的质粒，是用下述方法构建：

（1）用SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的DNA引物合成SEQ ID NO.5所示TA基因，所述TA基因的5'端含有黏性末端NdeI，3'端含有黏性末端EcoRI；

（2）将经限制性内切酶EcoRI和Hind III酶切的人IgG1Fc片段与TA基因，一起连接在经NdeI和Hind III酶切过的载体pET30a上，得到连接体系，构建策略见图1，将连接体系转化入大肠杆菌JM109感受态细胞中，Kana筛选，菌落PCR鉴定和双酶切鉴定，送公司测序后，，获得命名为TA-Fc-PET30a的含TA-Fc融合蛋白基因的质粒。TA-Fc融合蛋白，是用SEQ ID NO.2所示。

本发明的优点：

BLyS拮抗肽TA能够抑制BLyS与TACI的相互作用。TA-Fc融合蛋白可以和BLyS结合，并且抑制BLyS与TACI的相互作用。TA-Fc融合蛋白保障了拮抗肽TA的空间结构和稳定性，同时又不削弱肽的活性。TA-Fc融合蛋白可以作为潜在的BLyS拮抗剂应用于自身免疫疾病和淋巴瘤的研究治疗。

附图说明

图1为TA-Fc-PET30a重组质粒构建策略图。

图2为拮抗肽TA显著抑制BLyS与TACI的相互作用的Elisa试验。

图3为TA双链DNA梯度电泳,其中，1-5：1.6pmol/L，0.8pmol/L，0.4pmol/L，0.2pmol/L，0.1pmol/L；M：marker。

图4为菌落PCR筛选，其中，M，Marker；1,2，阳性菌落。

图5为重组质粒的双酶切鉴定.其中，M，marker；1，NdeⅠ和HindⅢ酶切；2，EcoRⅠ和HindⅢ酶切。

图6为TA-Fc融合蛋白SDS-PAGE电泳图。

图7为融合蛋白TA-Fc与BLyS结合的Elisa试验。

图8为融合蛋白TA-Fc显著抑制BLyS与TACI相互作用的Elisa试验。

具体实施方式

下面的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但并不对本发明作任何限制。

将BLyS拮抗肽命名为TA仅是为了方便描述，但并不对此进行限定。

BLyS蛋白：孙剑,黎燕,冯建男,孙瑛勋,胡美茹,沈倍奋,.人可溶性B淋巴细胞刺激因子基因的克隆及在大肠杆菌中的表达[J].细胞与分子免疫学杂志,2006,(2)SEQ ID NO.8所示。

TACI-Fc蛋白：冀丽军,白乌仁图雅,柴琳,孙剑,.TACI-Fc融合蛋白的基因构建、原核表达及生物活性鉴定[J].生物技术,2013,(3).SEQ ID NO.9所示

Fc蛋白：吴真.BCMA-Fc作为潜在药物的研究[D].天津大学,2012SEQ ID NO.10所示

无关肽NP：我们委托生物公司制备，其氨基酸序列为SEQ ID NO.7。

包被液：称量出33.6g碳酸氢钠和63.6g无水碳酸钠,将其放如烧杯中，向内加入600ml蒸馏水，搅拌至溶质全部溶解，再加入蒸馏水中定容到1了L。将其放在4℃下保存。

PBST的配制：在取250μl吐温-20加入500ml的1×PBS中，混合均匀至完全融合。在室温下保存

5%脱脂奶粉的配制：称取脱脂奶粉1g，搅拌下溶解于10ml0.01M PBS中，加PBS定容至20ml，于4℃保存

TMB显色液：取4.95ml底物缓冲液，0.05ml1%TMB储液，临用前加入5μl30%过氧化氢。

1%TMB储液：称取1g TMB，搅拌下充分溶解于80ml DMSO中，加DMSO定容至100ml，保存于4℃。

底物缓冲液（pH5.0）：取24.3ml0.1M柠檬酸，25.7ml0.2M磷酸氢二钠，加入约40ml水，调pH至5.0，再加水定容至100ml，保存于室温。TMB工作液（现配现用）

本发明基于BLyS和其受体TACI的晶体结构，通过计算机模建，模拟BLyS与TACI的相互作用模式和条件优化，辅助设计理论上拮抗BLyS与TACI相互作用的拮抗肽。进一步通过生物实验验证拮抗肽的功能活性。之后，为了保障拮抗肽的空间结构和稳定性，通过基因工程的方法，将有抑制活性的拮抗肽基因与人IgG1Fc序列连接，最终得到性质稳定的BLyS拮抗肽-Fc融合蛋白，进一步通过生物实验验证BLyS拮抗肽-Fc融合蛋白的功能活性。为开发有临床应用前景的新药先导药物奠定了实验研究基础。

实施例1

BLyS与其受体相互作用的结构信息和新型靶向BLyS拮抗肽的设计

利用计算机辅助分子对接及动力学模拟探讨了BLyS与其受体TACI相互作用模式，借助计算机图形学、距离几何学分析了BLyS与其受体相互识别的关键氨基酸残基。

通过计算机辅助分子设计以及高通量虚拟筛选技术从头设计能够模拟受体关键氨基酸构象的短肽，进而借助从头搭建、分子对接、动力学模拟从理论上评价BLyS与拮抗肽的作用；利用计算机图形学技术、距离几何学以及分子间氢键作用评价拮抗肽潜在的生物学效应。经过理论筛选得到BLyS拮抗肽，命名为TA，序列为：DTSKLASTGYSSDPY（SEQ ID NO.1）。

实施例2

BLyS拮抗肽的化学合成

根据计算机辅助设计的结果。我们委托生物公司制备BLyS拮抗肽（TA），其纯度达95%以上。

Sample Id:TA，Sequence:DTSKLASTGYSSDPY（SEQ ID NO.1），Molecular Weight:1591.66，HPLC Analysis:Peptide Purity>95%。

实施例3

ELISA实验验证拮抗肽TA的抑制活性

用包被液稀释BLyS蛋白至终浓度为10μg/ml,取50μL于酶标板中，4℃，18h。用PBST洗涤酶标板3次，每次5min。每孔加150μl5%脱脂奶粉，37℃，温育2h。用PBST洗涤酶标板3次，每次5min。将固定浓度的TACI-Fc蛋白（终浓度为10μg/ml）与不同浓度梯度的拮抗肽TA（终浓度分别为0、10、50和100μg/ml）混合，每个浓度3个平行，每孔加50μL，37℃，温育1h。无关肽NP作为对照。用PBST洗涤酶标板3次，每次5min。每孔加1：5000倍稀释的HRP标记羊抗人抗体50μL，37℃，1h。用PBST洗涤3次，每次5min。每孔加入50μL TMB显色液，37℃避光显色10min。每孔加50μL1mol/L H2S04终止反应，酶标仪检测OD450值。拮抗肽TA对BLyS与TACI的相互作用的抑制效果用下述公式计算：抑制率%=（对照组OD450—实验组OD450）／对照组OD450。

竞争ELISA实验结果表明：TA浓度在10μg/ml时能够抑制18.3%BLyS与TACI的结合；在50μg/ml时能够抑制22.83%BLyS与TACI的结合；在100μg/ml时能够抑制28.64%BLyS与TACI的结合。抑制作用与拮抗肽的浓度呈正相关（见图2）。

无关肽对BLyS与TACI的相互作用没有明显抑制作用、且没有剂量依赖关系。证明TA的抑制作用是特异和有效的。

实施例4

构建含TA-Fc融合蛋白基因的质粒TA-Fc-PET30a

依据TA序列，我们设计了两条编码短肽的DNA引物，并委托生物公司制备。TA两序列分别是：

5'-TATGGACACCTCTAAGCTCGCTTCTACCGGCTACTCTTCTGACCCGTACGGTGGAGGTGGATCTG-3'(65bP)（SEQ ID NO.3）和

5'-AATTCAGATCCACCTCCACCGTACGGGTCAGAAGAGTAGCCGGTAGAAGCGAGCTTAGAGGTGTCCA-3'（67bp)，（SEQ ID NO.4）。

合成的DNA引物加入200μl10mM Tris-Hcl（pH8.5）溶解（终浓度为16pmol/μl）。各取TA基因的正链和负链20μl，混合在EP管中，100℃水浴煮沸3min，逐渐冷却至室温。用2%的琼脂糖凝胶电泳，观察退火结果。电泳结果显示65bp处有明显条带，证明TA基因合成成功（见图3），TA基因是SEQ ID NO.5所示。

人IgG1Fc片段由PCR技术获得，Fc片段（已知序列）经过限制性内切酶EcoRI和HindIII酶切之后，与TA基因一起连接在被NdeI和Hind III酶切过的载体pET30a上，得到连接体系(见图1)，同时制备空质粒阴性对照组。

将连接体系转化进入JM109大肠杆菌中。菌落PCR结果显示1号、2号菌种为阳性（见图4）。对1号、2号菌种提取质粒酶切，结果750b处有目的条带（见图5）。菌落PCR和双酶切结果表明了构建的TA-Fc-pET30a重组质粒的正确性。将1号、2号菌种送生物公司测序，测序结果进行序列比对，正确率100%，表明TA-Fc-pET30a重组质粒构建成功。

实施例5

TA-Fc融合蛋白的诱导和表达

将测序正确的重组质粒TA-Fc-pET30a转化表达宿主菌BL21进行高表达菌株筛选，发现在IPTG浓度0.5mM，16℃慢速振摇的条件下诱导，能够诱导出目的蛋白。选取菌株进行大量表达，经蛋白A凝胶亲和层析柱纯化，洗脱组分SDS-PAGE电泳，发现1、3、5、7号泳道有目的条带。说明1至7号EP管中有目的蛋白。将1至7号洗脱液在1×PBS中透析，收集，用紫外分光光度计测量计算蛋白浓度为200ng／μl。取透析后的目的蛋白进行SDS-PAGE电泳，发现，目的蛋白的大小为32KD，和TA-Fc大小一致，并且具有较高纯度（见图6）是用SEQ ID NO.2所示。

实施例6

ELISA实验验证TA-Fc融合蛋白的结合活性

用包被液稀释BLyS蛋白至终浓度为10μg/ml,取50μL于酶标板中，4℃，18h。用PBST洗涤酶标板3次，每次5min。每孔加150μl5%脱脂奶粉，37℃，温育2h。用PBST洗涤酶标板3次，每次5min。加0、12.5、25、50和100μg/ml五个浓度梯度的TA-Fc蛋白溶液，每个浓度3个平行，每孔50μL，37℃，温育1h。Fc蛋白作为对照。用PBST洗涤酶标板3次，每次5min。每孔加1：5000倍稀释的HRP标记羊抗人抗体50μL，37℃，1h。用PBST洗涤3次，每次5min。每孔加入50μL TMB显色液，37℃避光显色10min。每孔加50μL1mol/L H2S04终止反应，酶标仪检测OD450值。TA-Fc融合蛋白结合BLyS蛋白的活性由下述公式计算：结合率%=实验组OD450／对照组OD450。

Elisa实验结果表明，TA-Fc浓度在12.5μg/ml时与BLyS结合率为21.2%；25μg/ml时与BLyS结合率为37.6%；50μg/ml时与BLyS结合率为64.6%；100μg/ml时与BLyS结合率为100%。结合程度与融合蛋白的浓度呈正相关（见图7）。

Fc蛋白与BLyS没有明显的结合作用、且没有剂量依赖关系。证明TA-Fc的结合作用是特异和有效的。

实施例7

ELISA实验验证TA-Fc融合蛋白的抑制活性

用包被液稀释BLyS蛋白至终浓度为10μg/ml,取50μL于酶标板中，4℃，18h。用PBST洗涤酶标板3次，每次5min。每孔加150μl5%脱脂奶粉，37℃，温育2h。用PBST洗涤酶标板3次，每次5min。将固定浓度的TACI-Fc-myc蛋白（终浓度为2μg/ml）（TACI-Fc-myc的序列为SEQ ID NO.6所示）与不同浓度梯度的TA-Fc融合蛋白（终浓度分别为0、10、50和100μg/ml）混合，每个浓度3个平行，每孔加50μL，37℃，温育1h。Fc蛋白作为对照。用PBST洗涤酶标板3次，每次5min。每孔加1：1000倍稀释的小鼠抗myc抗体50μL，37℃，温育1h。用PBST洗涤3次，每次5min。每孔加1：5000倍稀释的山羊抗小鼠抗体50μL，37℃，温育1h。每孔加入50μL TMB显色液，37℃避光显色10min。每孔加50μL1mol/L H2S04终止反应，酶标仪检测OD450值。TA-Fc融合蛋白对BLyS与TACI的相互作用的抑制效果用下述公式计算：抑制率%=（对照组OD450—实验组OD450）／对照组OD450

竞争ELISA实验结果表明：TA-Fc浓度在10μg/ml时能够抑制9.25%BLyS与TACI的结合；在50μg/ml时能够抑制13.6%BLyS与TACI的结合；在100μg/ml时能够抑制26.1%BLyS与TACI的结合。抑制作用与融合蛋白的浓度呈正相关（见图8）。

Fc蛋白对BLyS与TACI的相互作用没有明显抑制作用、且没有剂量依赖关系。证明TA-Fc的抑制作用是特异和有效的。

Claims (3)

1.BLyS拮抗肽，其特征是用SEQ ID NO.1所示，所述BLyS拮抗肽命名为TA。

2.含TA-Fc融合蛋白基因的质粒，其特征是用下述方法构建：

（1）用SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的DNA引物合成SEQ ID NO.5所示TA基因，所述TA基因的5'端含有黏性末端NdeI，3'端含有黏性末端EcoRI；

（2）将经限制性内切酶EcoRI和Hind III酶切的人IgG1Fc片段与TA基因，一起连接在经NdeI和Hind III酶切过的载体pET30a上，得到连接体系，将连接体系转化入大肠杆菌JM109感受态细胞中，经鉴定，获得命名为TA-Fc-PET30a的含TA-Fc融合蛋白基因的质粒。

3.TA-Fc融合蛋白，其特征是用SEQ ID NO.2所示。