CN103954659A - 一种动态实时测量细胞膜电位的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种动态实时测量细胞膜电位的方法，包括如下步骤：1）将从已获得的人体脐带静脉血中分离出来的细胞在体外进行培养；2）将培养后的细胞注入到微流室中继续进行培养；3）利用微注射泵在微流室中进行精确的流量控制；4）利用微流室内的氮化镓（GaN）高电子迁移率晶体管（HEMT）器件测量流体表面的粘滞度，进而计算出细胞膜电位。在使用本发明测量细胞膜电位的过程中，将作为生物传感器的HEMT器件和微流室、微注射泵、储液瓶相连，在微注射泵提供动态流体环境的前提下，通过HEMT器件实时监测流体环境下的活体多细胞膜电位。

Description

一种动态实时测量细胞膜电位的方法

技术领域

本发明涉及一种动态实时测量细胞膜电位的方法。

背景技术

人体体液流动会对细胞会产生剪应力，进而引起细胞电位的变化。剪切力能影响人体内皮细胞生物学特性的许多方面，与多种心血管疾病相关。因此，检测细胞膜电位是否变化具有重要的生理学和病理学研究意义。

目前，测量剪切力下的细胞膜电位的方法主要包括荧光染料法、微电极阵列法和膜片钳方法。

荧光染料法是利用荧光强度在剪切力作用下会发生改变，并且与膜片钳得到的细胞膜电位变化趋势相同的性质，来测量细胞膜电位的一种方法。但这种方法反应时间和精度都有较大差距，且目前无法证明荧光强度能够代替细胞膜电位表征细胞的电生理现象。

微电极阵列法采用集成电路硅工艺，通过微电极阵列能够表征大体积的单个肌细胞或神经细胞的动作电位。但这种方法存在测量准备时间长、测量准确度和灵敏度低的缺点。

膜片钳方法是目前最常用的方法，它是通过玻璃微电极测量单细胞的膜内外的电压或电流差，并通过一定的放大和转换，得到细胞膜电位。但是这种技术具有以下先天性不足：生物组织是由大量细胞紧密排列形成的，而膜片钳只能测量单细胞，并不能表征实际的多细胞膜电位对剪切力的响应情况；测量时会破坏细胞膜，改变细胞的特性，短时间内细胞将死亡，这样就限制了对细胞膜动作电位以及离子通道早期发生现象的研究；在流体环境下测试时，由于剪切力的存在，细胞容易从膜片钳脱落；膜片钳技术每次只能记录一个细胞（或一对细胞），每天只能获得的数据量仅为几到几十个，耗时耗力。

综上所述，荧光染料法、微电极阵列法和膜片钳方法均无法解决活体多细胞膜电位的测量问题，来准确表征剪切力对细胞膜电位的影响。

因此，需要一种具有检测快速、灵敏度高、实时测量、结果准确、生物兼容性高、多细胞活体测量等多重优点的方法，来进行细胞膜电位的测量。

发明内容

因此，为解决现有技术中存在的上述问题而完成了本发明，本发明的目的之一在于提供一种实时的准确测量剪切力影响的活体多细胞膜电位的方法，该方法使用了氮化镓（GaN）高电子迁移率晶体管（HEMT）、微流室技术和微注射泵技术，将从人体脐带静脉血中分离出来的细胞在体外进行培养，然后注入到微流室中继续进行培养，最后利用微注射泵在微流室中进行精确的流量控制，用微流室内的HEMT器件测量流体表面的粘滞度，进而计算出细胞膜电位，实现了一种动态模拟多细胞环境并实时监测流体环境下的活体多细胞膜电位的方法。

在使用本发明测量细胞膜电位的过程中，将作为生物传感器的HEMT器件和微流室、微注射泵、储液瓶相连，在微注射泵提供动态流体环境的前提下，通过HEMT器件实时监测流体环境下的活体多细胞膜电位。

本发明中应用于生物传感器的HEMT器件的结构为：底层为蓝宝石材料，底层向上依次为1.6μm左右的GaN缓冲层，1.2nm AlN插入层，8～15nm左右的AlGaN势垒层和1.5nm GaN帽层，势垒层铝组分在25%～40%之间。帽层以上为Si₃N₄钝化层，钝化层中间被蚀刻出一块长方形槽状的裸栅区域，裸栅区域无电极引出，尺寸在10μm～10mm范围内。

如本领域技术人员所熟知或容易想到的上述HEMT器件的蓝宝石衬底也可采用其他具有相似功能的材料，如碳化硅（SiC）材料。

本发明中HEMT器件的制造工艺为：

（1）台面刻蚀，采用ICP方法刻蚀异质结材料形成器件的台面隔离；

（2）淀积源漏极欧姆金属，采用电子束蒸发的方法获得欧姆金属层，欧姆金属采用Ti/Al/Ni/Au四层结构，并在830℃下退火形成合金，获得良好的源漏极欧姆接触；

（3）采用PECVD方法淀积Si₃N₄材料作为钝化层；

（4）光刻并采用ICP方法刻蚀Si₃N₄，露出裸栅区域。

本发明中微流室的结构为：在HEMT器件上方覆盖了用高分子聚合材料制造的与裸栅相同的槽状图形，槽内安装微流室。微流室材料选用聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）材料，除此以外，还可采用聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA），聚酰亚胺（polyimide）等材料。微流室反应室尺寸设计与器件栅极图形保持一致。微流室两侧有封接口，作为液体流动和细胞注入之用。微流室用于培养细胞，培养完成后连接微注射泵，以提供精确的流量控制。微流室两端有两个直径在0.1mm～0.5mm左右的小孔，能够与外部相连。微流室部件与HEMT器件封接，得到一个密闭的通道，溶液能够在通道中流动，形成流体动力学下的细胞膜电位检测装置。

本发明中微流室的制作工艺为：先采用光刻的方法或反应离子刻蚀（RIE）的方法制造出微流室凸突的阳模，然后在阳模上浇铸PDMS，在约50℃温度下固化后使PDMS从阳模上剥离，即可制得微流室部件。微流室两端的小孔采用钻孔法或其他方法得到。微流室部件与HEMT芯片封接工艺采用热压法或粘合法等方法。

本发明中活体细胞的分离方法为：在无菌条件下，向已获取的新鲜的人体脐带静脉血中加入1g/L胶原酶和2.5g/L胰蛋白酶(1:1)(V/V)的混合液15mL，置于37℃水浴箱中孵育8min，将消化液收集入离心管，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗脐静脉2次，将冲洗液一同收集入离心管，1000r/min离心10min，取上清液，加入完全培养液重悬细胞，取0.1mL细胞悬液用4g/L台盼蓝染色后作活细胞计数。将2×104/L细胞接种到24孔板中，每孔加入完全培养液1mL，置于37℃、950mL/L O₂、50mL/L CO₂培养箱内静置培养，并采用台盼蓝排斥法，将0.1mL混匀的内皮细胞悬液与4g/L台盼蓝0.9mL混匀后，取1滴在显微镜下计数100个细胞。当细胞悬液中细胞存活率大于95%时，可用于进行原代细胞培养。

本发明中活体细胞的培养方法为：用酒精对HEMT器件消毒后，使用纤连蛋白溶液（fibronectin）进行处理30min，以增强细胞的附着度。并使用PBS冲洗，并接种细胞，使细胞密度达到5000～12000cells/mm²，并保证细胞全程置于含5%CO₂的37℃恒温箱中。

本发明中装置的使用方法为：采用微注射泵与细胞膜电位检测装置连接形成血液动力系统，该系统架设在37℃恒温箱中维持温度稳定，实验中使用PBS作为流体，并且实验全程通入含5%CO₂的空气以保持流体环境的酸碱度。

本发明中器件裸栅上培养的细胞受到的剪切力由以下公式推导：

$\mathrm{\τ}=\frac{6\mathrm{Q\η}}{{\mathrm{wh}}^2}$

其中τ为细胞受到的剪切力，单位为dyne/cm²;η为流体即培养液的粘滞度（viscosity），单位为g/(cm·s)；Q为流体每秒的流量，单位为cm³/s；w为器件的栅宽，h为微流室内壁高度。通过调节泵的每秒流量，即可得所需的剪切力。

本发明中装置采用半导体测试分析仪器，如Keithley4200SCS，来测试HEMT器件的源漏电流，并可通过如下公式，转化成对应的细胞膜电位。

$V_J^D=\mathrm{\Δ}{V}_{\mathrm{GS}}=\frac{\mathrm{\Δ}{I}_{\mathrm{DS}}}{{\left(g_m\right)}_{V_{\mathrm{DS}}}}$

其中，为细胞膜电位，为所加漏源电压V_DS下，且栅电压V_GS在-70mV～0V处对应的HEMT器件跨导。由于栅电压的变化较小，可认为为一个常数，由预先测量得到。预先测量方法为：对在同一晶圆上、且采用相同版图的常规三端HEMT器件，加相同漏源电压V_DS，测试其转移曲线（V_G-I_D），得到栅电压在-70mV～0V处对应的器件跨导值。

附图说明

图1为本发明的工作流程图。

图2为本发明的测量原理图

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步说明。本发明的实施方式包括但不限于下属案例。

实施例1

如图1、2所示，一种准确测量剪切力影响的活体多细胞膜电位的装置，包括HEMT器件传感器、微流室、微注射泵和储液瓶。

本实施例中，将活体细胞从人脐带静脉中分离出来，培养繁殖后，注入微流室进行培养和键合。将装置置于37℃恒温箱中，用微注射泵将液体注入微流室。实验中使用PBS作为流体，并且实验全程通入含5%CO₂的空气以保持流体环境的酸碱度。利用HEMT器件测量流体的粘滞度，并利用下述公式进行计算，得到细胞膜电位与时间的关系。

本发明中器件裸栅上培养的细胞受到的剪切力由以下公式推导：

$\mathrm{\τ}=\frac{6\mathrm{Q\η}}{{\mathrm{wh}}^2}$

其中τ为细胞受到的剪切力，单位为dyne/cm²;η为流体即培养液的粘滞度（viscosity），单位为g/(cm·s)；Q为流体每秒的流量，单位为cm³/s；w为器件的栅宽，h为微流室高度。通过调节泵的每秒流量，即可得所需的剪切力。

本发明中装置采用半导体测试分析仪器，如Keithley4200SCS，来测试HEMT器件的源漏电流，并可通过如下公式，转化成对应的细胞膜电位。

$V_J^D=\mathrm{\Δ}{V}_{\mathrm{GS}}=\frac{\mathrm{\Δ}{I}_{\mathrm{DS}}}{{\left(g_m\right)}_{V_{\mathrm{DS}}}}$

其中，为细胞膜电位，为所加漏源电压V_DS下，且栅电压V_GS在-70mV～0V处对应的HEMT器件跨导。由于栅电压的变化较小，可认为为一个常数，由预先测量得到。预先测量方法为：对在同一晶圆上、且采用相同版图的常规三端HEMT器件，加相同漏源电压V_DS，测试其转移曲线（V_G-I_D），得到栅电压在-70mV～0V处对应的器件跨导值。

尽管已经通过描述本发明的典型实施例达到说明的目的，本领域技术人员将会理解的是，在不脱离如从属权利要求中公开的本发明的范围和主旨的情况下，可以进行各种修正、添加和替代。

Claims (7)

1.一种动态实时测量细胞膜电位的方法，所述方法包括如下步骤：

1）将从已获得的人体脐带静脉血中分离出来的细胞在体外进行培养；

2）将所述培养后的细胞注入到微流室中继续进行培养；

3）利用微注射泵在微流室中进行精确的流量控制；

4）利用所述微流室内的氮化镓（GaN）高电子迁移率晶体管（HEMT）器件测量流体表面的粘滞度，进而计算出细胞膜电位。

2.根据权利要求1所述的方法，需要将所述微流室、微注射泵和储液瓶依次连接，构成一个封闭的循环系统；所述微流室作为液体流动和细胞注入之用，所述微流室内的液体通过所述微注射泵传输给所述储液瓶，所述作为生物传感器的HEMT器件与所述微流室耦合，用于检测所述微流室内细胞在动态条件下的实时细胞膜电位。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述的从已获得的人体脐带静脉血中分离细胞的方法为：

1）在无菌条件下，将已获得的新鲜的人体脐带静脉血加入1g/L胶原酶和2.5g/L胰蛋白酶(1:1)(V/V)的混合液15mL，置于37℃水浴箱中孵育8min；

2）将步骤1）得到的液体收集入离心管，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗脐静脉2次，将冲洗后的液体一同收集入离心管，1000r/min离心10min，取上清液，加入完全培养液重悬细胞；

3）取0.1mL细胞悬液用4g/L台盼蓝染色后作活细胞计数；

4）将2×104/L细胞接种到24孔板中，每孔加入完全培养液1mL，置于37℃、950mL/L O2、50mL/L CO₂培养箱内静置培养，并采用台盼蓝排斥法，将0.1mL混匀的内皮细胞悬液与4g/L台盼蓝0.9mL混匀后，取1滴在显微镜下计数100个细胞。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述的将已分离活体细胞注入到微流室内继续培养的方法为：用酒精对HEMT器件消毒后，使用纤连蛋白溶液（fibronectin）进行处理30min，并使用PBS冲洗，然后接种细胞，使细胞密度达到5000～12000cells/mm²，并保证细胞全程置于含5%CO₂的37℃恒温箱中。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述的利用微注射泵在微流室中进行精确的流量控制的方法为：采用微注射泵与细胞膜电位检测装置连接形成血液动力系统，该系统架设在37℃恒温箱中维持温度稳定，实验中使用PBS作为流体，并且实验全程通入含5%CO₂的空气以保持流体环境的酸碱度。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述的用微流室内的HEMT器件测量流体表面的粘滞度，进而计算出细胞膜电位的方法为：

1）器件裸栅上培养的细胞受到的剪切力由以下公式推导：

$\mathrm{\τ}=\frac{6\mathrm{Q\η}}{{\mathrm{wh}}^2}$

其中τ为细胞受到的剪切力，单位为dyne/cm²;η为流体即培养液的粘滞度（viscosity），单位为g/(cm·s)；Q为流体每秒的流量，单位为cm³/s；w为器件的栅宽，h为微流室内壁高度；

2）采用半导体测试分析仪器，来测试HEMT器件的源漏电流，并通过如下公式，转化成对应的细胞膜电位：

$V_J^D=\mathrm{\Δ}{V}_{\mathrm{GS}}=\frac{\mathrm{\Δ}{I}_{\mathrm{DS}}}{{\left(g_m\right)}_{V_{\mathrm{DS}}}}$

为细胞膜电位，为所8加漏源电压VDS下，且栅电压VGS在-70mV～0V处对应的HEMT器件跨导。由于栅电压的变化较小，可认为为一个常数，由预先测量得到。

7.根据权利要求6所述的测量细胞膜电位的方法，所述预先测量为：对在同一晶圆上、且采用相同版图的常规三端HEMT器件，加相同漏源电压VDS，测试其转移曲线（VG-ID），得到栅电压在-70mV～0V处对应的器件跨导值。