CN103954612B - 光催化反应产生超氧自由基的实时动态检测系统 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种光催化反应产生超氧自由基的实时动态检测系统。包括激发光源、光催化剂盛放容器、化学发光探针盛放容器、检测池、光电倍增管和信号分析器主机；光催化剂盛放容器和化学发光探针盛放容器均与检测池相连通；光电倍增管用于将检测池中产生的光信号转化成电信号；光电倍增管与信号分析器主机相连接，信号分析器主机与电脑终端相连接。使用本发明实时动态检测系统检测时，可在线测定，操作简单，不需要对样品进行离线分离，然后上机检测等过程，因此测定速度快，提高了工作效率，适用于对各种光催化材料和光敏分子生成O₂ ^·-能力的快速筛查和评估。本发明能够实现在线实时测定，可以在线追踪O₂ ^·-的动态变化，通过动力学信息，研究其生成和衰减行为。

Description

光催化反应产生超氧自由基的实时动态检测系统

技术领域

本发明涉及一种光催化反应产生超氧自由基的实时动态检测系统。

背景技术

超氧自由基（O₂ ^·-）是一类重要的活性氧物质，广泛存在于生物体和环境介质中。在生物体内，O₂ ^·-是一种重要的小分子物质，参与了一系列的生理生化过程，如免疫反应、信号传导和氧化应激等过程。在环境介质中，目前O₂ ^·-的迁移转化等环境行为尚不十分清楚，但是越来越多的证据表明O₂ ^·-介导了环境介质中许多的氧化还原反应。如最新研究证实，在环境水体中，溶解性有机质（如腐植酸等）在光照下发生光敏化反应还原溶解氧生成O₂ ^·-，O₂ ^·-能够还原水体中的Ag⁺生成纳米Ag。因此测定O₂ ^·-能够更好的理解其在环境中的迁移和转化行为。在工程领域，特别是近年发展的高级氧化技术（AOT）中，O₂ ^·-也是人们关注的一种重要的活性氧。其中，光催化技术由于其绿色、节能、环保等优点引起了人们极大的研究热情。目前，光催化技术在污染物降解、水光解制氢、化合物合成、太阳能电池等方面已有广泛和深入的研究，具有巨大的应用前景。半导体光催化材料的主要工作原理是（以TiO₂半导体为例）：当TiO₂半导体材料受到能量等于或者大于其帯隙宽度的光子激发后，位于基态的价带电子被激发到导带，从而生成了价带的氧化空穴和导带的自由电子（电子-空穴对）。电子-空穴对具有强的还原和氧化能力，并且能够自由迁移，当它们迁移到半导体表面后与表面吸附的小分子（H₂O、OH^-、O₂）发生一系列的反应生成活性氧类物种（主要是·OH、O₂ ^·-、H₂O₂）。其中O₂ ^·-在光催化反应中是一种重要的活性氧，它在污染物降解过程中起了重要的作用，有研究表明O₂ ^·-的数量与污染物的矿化程度有直接关系。此外，O₂ ^·-还可以在光催化反应中生成羟基自由基和过氧化氢，从而间接影响其它活性氧的生成，因此，O₂ ^·-的数量是衡量一种光催化剂性能的重要指标。

目前常用的测量O₂ ^·-的方法主要有电子自旋共振技术（ESR）、分光光度法等，但是这些方法都有其各自的局限性。例如，电子自旋共振法需要捕获探针，但是生成的加合物不稳定，有文献报道，当用DMPO捕获O₂ ^·-时，生成的加合物（DMPO-OOH）容易分解生成羟基自由基的加合物（DMPO-OH）。此外，由于捕获探针的特异性较差，在光催化反应中生成的羟基自由基会干扰测定，因此为了消除羟基自由基的干扰，常常将光催化材料分散在有机溶剂中，如DMSO等，但是这与实际的光催化反应环境相差很大，不能完全准确的反映光催化材料产生O₂ ^·-的过程。最后，ESR作为一种技术手段，它的技术特点是通过对g值分析进行定性，但是在定量方面灵敏度较差。分光光度法在测定O₂ ^·-，特别是生物体内O₂ ^·-时有较多应用，如NBT还原法、XTT还原法以及细胞色素c还原法。它们一般的操作流程是先将探针加入到待测体系中与O₂ ^·-反应，然后再上机测定其生成物质的吸光度，因此操作步骤繁琐。此外该方法的灵敏度和特异性较差，对于光催化反应来说，超氧自由基的浓度较低，而且其它的活性氧可能会对其测定产生干扰，因此也制约了该方法的使用。因此发展一种简单、快速、准确、特异的测定光催化反应生成O₂ ^·-的方法具有重要意义。

流动化学发光法作为一种分析测定手段已在各个领域有了广泛的应用，它具有操作简单、测定速度快、灵敏度高、特异性好、实时在线等优点。光催化反应中产生的O₂ ^·-具有浓度低、寿命较短、与其它类活性氧共存等特点，因此对它的测定是一项难题，而流动化学发光法的特点能够很好的克服以上存在的难题，因此具有很好的应用前景。目前国内外尚没有应用流动化学发光法测定光催化反应产生O₂ ^·-的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种光催化反应产生超氧自由基的实时动态检测系统，本发明将流动化学发光法应用在光化学领域，通过将流动化学发光装置与光催化反应装置相结合，借助化学发光体系实现了对光催化反应中产生的O₂ ^·-简单、快速、实时、在线、灵敏、特异的测定，可被用作各种光催化材料和光敏分子产生O₂ ^·-能力的快速筛查和评估，以及O₂ ^·-的生成和衰减行为的研究。

本发明所提供的光催化反应产生超氧自由基的实时动态检测系统，包括激发光源、光催化剂盛放容器、化学发光探针盛放容器、检测池和光电倍增管和信号分析器主机；

所述光催化剂盛放容器和所述化学发光探针盛放容器均与所述检测池相连通；

所述光电倍增管用于将所述检测池中产生的光信号转化成电信号；

所述光电倍增管与信号分析器主机相连接，所述信号分析器主机与一电脑终端相连接。

上述的实时动态检测系统还包括自由基猝灭剂盛放容器，所述自由基猝灭剂盛放容器与所述光催化剂盛放容器相连通后通过一管路与所述检测池相连通；设置所述自由基猝灭剂盛放容器的目的是根据需要将猝灭剂在管路中与光催化剂进行混合对自由基进行特异性猝灭，证明自由基检测的特异性，因此不需要时可将该管路拆掉。

上述的实时动态检测系统中，所述光催化剂盛放容器与所述检测池之间设有蠕动泵，以定量向所述检测池中泵入光催化剂；

所述化学发光探针盛放容器与所述检测池之间设有蠕动泵，以定量的向所述检测池中泵入化学发光探针。

上述的实时动态检测系统中，所述激发光源为紫外光源（如汞灯）或可见光源（如氙灯）。

本发明实时动态检测系统中设置的信号分析器主机，在测量过程中稳定电压和温度，并将所述光电倍增管产生的光信号转化为电信号，进行放大处理，然后将信号传输到所述电脑终端进行分析。

本发明提供的实时动态检测系统可用于评价光催化材料或光敏分子产生超氧自由基的能力；能够评价的光催化剂如二氧化钛或氧化锌等；能够评价的光敏分子如腐植酸等。

本发明实时动态检测系统进行检测时，可选择3-氨基苯二甲酰肼（鲁米诺）或2-甲基-6-甲氧苯基-3,7-二氢化咪唑-[1,2-α]吡嗪-3-酮（甲壳动物荧光素，MCLA）作为化学发光探针，用于与产生的超氧自由基进行化学反应产生发光信号。

本发明与现有方法相比具有以下优点：

1）本发明实时动态检测系统结构简单，且成本低，易于商业推广。

2）使用本发明实时动态检测系统检测的O₂ ^·-灵敏度高，特异性好，从而克服了光催化反应中O₂ ^·-浓度低，其它活性氧共存干扰等问题。

3）使用本发明实时动态检测系统检测时，可在线测定，操作简单，不需要对样品进行离线分离，然后上机检测等过程，因此测定速度快，提高了工作效率，适用于对各种光催化材料和光敏分子生成O₂ ^·-能力的快速筛查和评估。

4）使用本发明实时动态检测系统检测时，能够实现在线实时测定，可以在线追踪O₂ ^·-的动态变化，通过动力学信息，研究其生成和衰减行为。

附图说明

图1（a）本发明光催化反应产生超氧自由基的实时动态检测系统的示意图。

图1（b）为在图1（a）所示实时动态检测系统上增设六通阀后的示意图。

图1（a）和图1（b）中，各标记如下：

1激发光源、2光催化剂盛放容器、3自由基猝灭剂盛放容器(载液盛放容器）、4化学发光探针盛放容器、5检测池、6光电倍增管、7信号分析器主机、8电脑终端、9，10，11蠕动泵、12六通阀。

图2为化学发光探针与二氧化钛胶体混合后化学发光信号随时间的变化，其中图2（a）为光激发前后鲁米诺发光探针与二氧化钛（P25）胶体连续流动混合后化学发光信号随时间的变化；图2（b）为光激发前后鲁米诺发光探针与二氧化钛（P25）胶体流动注射混合后化学发光信号随时间的变化；鲁米诺（1μM），P25（0.1mg/ml），光强（0.8mW/cm²）；图2（c）为光激发前后MCLA发光探针与腐植酸（HA）溶液连续流动混合后化学发光信号随时间的变化；MCLA（4μM），HA（0.04mg/ml），光强（1.1mW/cm²）。

图3为加入猝灭剂前后鲁米诺发光信号随时间的变化，其中，图3(a)为加入超氧自由基猝灭剂SOD前后鲁米诺发光信号随时间的变化；图3(b)为加入羟基自由基猝灭剂(异丙醇)前后鲁米诺发光信号随时间的变化；图3(c)为加入单线态猝灭剂(NaN₃)前后鲁米诺发光信号随时间的变化；图3(e)为加入超氧自由基猝灭剂SOD前后MCLA发光信号随时间的变化；图3(f)为加入单线态猝灭剂(NaN₃)前后MCLA发光信号随时间的变化；鲁米诺(1μM)，MCLA(1μM)，P25(0.1mg/ml)，SOD(1U/ml)，异丙醇(1μM)，NaN₃(1μM)，光强(0.8mW/cm²)。

图4为不同浓度P25产生O₂ ^·-数量的比较，其中，图4（a）为鲁米诺化学发光强度随时间的变化；图4（b）为XTT还原产物的吸光度随时间的变化；鲁米诺（50μM），XTT（0.01mg/ml），光强（0.8mW/cm²）。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

如图1（a）所示，为本发明提供的光催化反应产生超氧自由基的实时动态检测系统包括激发光源1、光催化剂盛放容器2、化学发光探针盛放容器4、检测池5、光电倍增管6和自由基猝灭剂盛放容器3。激发光源1可选择汞灯或氙灯，用于激发光催化剂或光敏分子。光催化剂盛放容器2用于盛放待检测的光催化剂或者光敏分子，光催化剂盛放容器2与检测池5相连通，且它们之间设有一个蠕动泵9，用于提供动力。化学发光探针盛放容器4用于盛放化学发光探针，与光催化剂或者光敏分子产生的超氧自由基进行化学反应，以便被检测，化学发光探针盛放容器4与检测池5相连通，且它们之间设有一个蠕动泵11，用于提供动力。自由基猝灭剂盛放容器3用于盛放自由基猝灭剂，其与光催化剂盛放容器2相连通后，继续与检测池5相连通，在连通自由基猝灭剂盛放容器3的管路上设有蠕动泵10，用于提供动力。光电倍增管6用于将检测池5中产生的光电信号转化成电信号，然后传输至信号分析器主机7，信号分析器主机7与电脑终端8相连接，将检测结果进行显示。

以二氧化钛半导体光催化材料（P25）为例，说明本实施例实时动态检测系统测定光催化材料产生O₂ ^·-的具体实施过程（以鲁米诺作为发光探针）：

如图1（a）所示，首先将分散均匀的P25胶体转移到光催化剂盛放容器2中，将鲁米诺转移到化学发光探针盛放容器4中，当实验进行时，启动蠕动泵9和11将二氧化钛胶体以及化学发光探针溶液通过管路传送到检测室5混合发生化学发光反应，产生发光信号，同时位于检测室5下面的光电倍增管6将接受到的光信号转换成电信号，经过放大处理后，通过数据线传输到电脑终端8的显示屏上。

当光源未开启时，二氧化钛胶体中没有O₂ ^·-产生，发光探针和二氧化钛胶体混合发生自氧化过程产生低的发光信号，此时显示屏上显示很低的随时间连续的背景信号，如图2（a）所示；反之，当光源开启时，二氧化钛受到激发后会产生一系列的ROS，如·OH、O₂ ^·-、H₂O₂，其中·OH寿命很短（微秒级），因此在检测室与探针混合前已完全湮灭；H₂O₂在光催化过程中生成浓度低（2μM左右），在没有增敏剂时，与探针分子的发光信号非常微弱，因此对测定产生的发光信号贡献微不足道；对于O₂ ^·-，它在催化剂表面生成，寿命较长（半衰期数百秒），在本发明的检测系统中二氧化钛胶体从光反应容器到检测室的时间约为10s，从时间维度上保证了测定的可行性；另外O₂ ^·-反应活性高，跟探针混合后会发生剧烈反应，产生强烈的化学发光信号，从原理上保证了测定的可行性。因此，二氧化钛中产生的O₂ ^·-与化学发光探针混合后产生化学发光信号，从而实现了对O₂ ^·-的测定，而且O₂ ^·-会随着光照时间的延长而不断累积，因此在显示屏中呈现出随时间不断增强的连续的发光信号，并最终达到平台，证明此时溶液中的O₂ ^·-的产生和衰减过程达到平衡状态，如图2(a)所示。

如图1（b）所示，与图1（a）的不同之处在于，在光催化剂盛放容器2和载液盛放容器3与检测池5之间再连接一个六通阀12，当光源未开启时，启动蠕动泵9将二氧化钛胶体通过调节六通阀12传送到检测室5与发光探针混合发生化学发光反应，此时由于没有O₂ ^·-存在，因此显示屏上出现小的背景峰形信号（图2（b））；当光源开启时，二氧化钛胶体通过六通阀12进入检测室5后与发光探针在检测室混合，由于注射的二氧化钛胶体溶液在管路被载液输运过程中发生扩散过程，导致二氧化钛浓度从中心向前后两侧逐渐减少，相应的O₂ ^·-也遵循此规律，因此当其在检测室中与发光探针混合时，显示屏中会产生一个明显的峰形信号，并且峰强度也会随着时间的延长而不断增强，最后达到平台，证明了此时二氧化钛胶体中O₂ ^·-的生成和衰减过程达到平衡，如图2（b）所示。

以腐植酸（HA）为例说明本实施例检测系统测定光敏分子产生O₂ ^·-的具体实施过程（以MCLA作为发光探针）：在图1（a）中（连续流动模式），首先将分散均匀的腐植酸溶液转移到检测池中，当实验进行时，启动流动装置将腐植酸溶液和探针溶液传送到检测室中混合，由于此时光源未开启，腐植酸溶液中没有O₂ ^·-产生，因此显示屏中会出现随着时间连续的低的化学发光背景信号（图2（c））；当光源开启时，腐植酸溶液被激发发生光敏反应不断产生O₂ ^·-，导致溶液中的O₂ ^·-不断累积，因此显示屏中会出现随着时间连续的不断增强的化学发光信号，最后达到平台（图2（c）），证明了此时腐植酸溶液中的O₂ ^·-的生成和衰减过程达到平衡。

为了进一步验证上述检测到光催化剂的发光信号来自O₂ ^·-，将猝灭剂盛放容器3中不同猝灭剂通过另一条管路与二氧化钛胶体在管路中混合将其产生的活性氧猝灭，然后再与发光探针(鲁米诺或MCLA)在检测室中混合，发现只有加入超氧自由基猝灭剂(SOD)时鲁米诺(图3(a))和MCLA(图3(e))发光信号迅速降低到原来基线水平，而加入其它猝灭剂后，如羟基自由基猝灭剂(异丙醇)(图3(b))、单线态氧猝灭剂(NaN₃)(图3(c)和图3(f))，发光信号几乎没有变化，证明了发光信号来自O₂ ^·-。

使用本发明的实时动态检测系统和XTT还原方法，比较不同浓度P25产生的O₂ ^·-的数量，结果如下：

如图4（a）所示，当光源开启后，在任意时刻鲁米诺化学发光强度随着TiO₂浓度增大而增强，说明TiO₂浓度越大，O₂ ^·-的生成速率越快；

XTT还原产物的吸光度随时间的变化如图4（b）所示，由这两个图可以得知，两种方法得到的结果一致。

Claims (2)

1.一种光催化反应产生超氧自由基的实时动态检测系统，其特征在于：所述实时动态检测系统包括激发光源、光催化剂盛放容器、化学发光探针盛放容器、检测池、光电倍增管和信号分析器主机；

所述光催化剂盛放容器和所述化学发光探针盛放容器均与所述检测池相连通；

所述光催化剂盛放容器与所述检测池之间设有蠕动泵；

所述化学发光探针盛放容器与所述检测池之间设有蠕动泵；

所述光电倍增管用于将所述检测池中产生的光信号转化成电信号；

所述光电倍增管与信号分析器主机相连接，所述信号分析器主机与一电脑终端相连接；

所述实时动态检测系统还包括自由基猝灭剂盛放容器，所述自由基猝灭剂盛放容器与所述光催化剂盛放容器相连通后通过一管路与所述检测池相连通；

所述激发光源为紫外灯源或可见光源。

2.权利要求1所述实时动态检测系统在评价光催化剂或光敏分子产生超氧自由基的能力中的应用；

所述光催化剂为二氧化钛或氧化锌；

所述光敏分子为腐植酸；

所述化学发光探针盛放容器中盛放的化学发光探针为3-氨基苯二甲酰肼或2-甲基-6-甲氧苯基-3,7-二氢化咪唑-[1,2-α]吡嗪-3-酮。