CN103954599B - 一种荧光滴定测定单抗活性位点浓度的方法 - Google Patents

Abstract

一种荧光滴定测定单抗活性位点浓度的方法，以340nm附近为激发峰且280nm为激发谷的荧光团为色氨酸FRET接受体，用非荧光半抗原、无色氨酸抗原表位为非荧光探针，非荧光探针与色氨酸FRET接受体加合物、色氨酸FRET接受体类半抗原为荧光探针；探针与纯单抗反应，280nm激发测定340nm荧光或色氨酸FRET接受体荧光得滴定曲线；基于可逆反应、探针静态和动态猝灭、荧光信号加和，建立荧光信号变化数学模型拟合滴定曲线确定单抗位点浓度。分析340nm信号变化时，用不收敛但拟合决定系数高于0.99参数计算信号变化一阶导数最大值为单抗340nm信号响应曲线斜率，再拟合相同滴定曲线得单抗位点浓度。

Description

一种荧光滴定测定单抗活性位点浓度的方法

技术领域

本发明涉及单抗浓度的测量方法，其特征是通过滴定探针与单抗的活性位点结合，测量其荧光猝灭信号或色氨酸荧光共振能量转移接受体信号获得滴定曲线，基于单抗与半抗原及抗原表位可逆结合建立化学计量学关系，并优化拟合滴定曲线，估算出单抗的活性位点浓度。

背景技术

单抗是用于免疫分离分析的关键生物材料。为标准化应用过程，需要准确测定并溯源单抗的含量，尤其需要筛选高亲和力的单抗。目前测定单抗含量常测定其280nm吸收，并用单抗的平均消光系数计算单抗的质量或数量。显然，当某单抗芳香族氨基酸残基丰度与测定单抗平均消光系数所用单抗的平均丰度有偏差时，其消光系数也就会偏离单抗的平均消光系数，使测定结果出现明显的偏差。测定单抗含量的另一种方法是测定其样品溶液与带标记半抗原、抗原表位或全抗原作为探针反应产生可检测复合物的最大稀释度，即滴度。显然，此类探针中标记信号的比活性、单抗亲和力对所测滴度有显著影响；此类探针纯度不足及其标记信号比活性的波动，都会造成测定结果的偏差，使得测定滴度定量单抗的数据很难溯源。因此，需要建立新方法来测定单抗的质量、数量或活性位点量并标定其280nm消光系数。

单抗一般含有色氨酸，其在280nm激发下发射340nm荧光信号，这是单抗荧光信号的主要来源。单抗与其半抗原、抗原表位或者全抗原结合后其荧光易被猝灭；当它们复合物中来自单抗的色氨酸和结合探针之间能发生荧光共振能量转移(FRET)时，单抗荧光被猝灭效率更高。因此，可测定单抗被探针滴定时在280nm激发下340nm的荧光猝灭确定单抗量，满足此滴定方法要求的探针有两类。一类是非荧光探针，包括非荧光半抗原、缺乏色氨酸的连续抗原表位。另一类是荧光探针，定义在280nm为激发谷而在340nm为激发峰的荧光团为色氨酸的FRET接受体；适合作为色氨酸FRET接受体的半抗原，及非荧光探针与色氨酸的适当FRET接受体的加合物就属于此法所需荧光探针。非荧光探针基于静态猝灭降低单抗的荧光；荧光探针还通过FRET效应增强猝灭效应，同时发出探针自身特有荧光。因此，用这两类探针，监测单抗340nm荧光甚至FRET接受体荧光可测定单抗的滴定曲线；分析滴定曲线应能测定单抗含量，即其结合半抗原、抗原表位的活性位点浓度或数量。

发明内容

1.一种荧光滴定测定单抗活性位点浓度的方法，其特征如下：

(一)所适用单抗有较高纯度，能识别非荧光半抗原、缺乏色氨酸的连续抗原表位、激发峰在340nm附近而在280nm附近为激发谷的荧光半抗原，且不含有其它抗体或蛋白；

(二)所用滴定探针包括荧光探针和非荧光探针两类；非荧光探针为单抗所识别的非荧光半抗原、缺乏色氨酸连续抗原表位；激发峰在340nm附近且在280nm附近为激发谷的荧光团称色氨酸FRET接受体，对应荧光探针为色氨酸FRET接受体类荧光半抗原、上述非荧光探针与色氨酸FRET接受体荧光团的加合物；

(三)用滴定探针测定对应单抗的荧光滴定曲线；此滴定曲线测定过程的特征如下：

(1)取一定量中性磷酸盐缓冲液至荧光比色杯中，加入一定量单克隆抗体样品溶液混合均匀：用总容量为4.0ml的荧光比色杯时，混匀后液体总体积在2.0ml以上；用微量荧光比色杯时，混匀后液体总体积达到荧光分光光度计测定所含液体荧光信号的要求；

(2)准确称量所选滴定探针，用相同中性缓冲液直接溶解并稀释至不低于20μM，有强吸收探针用吸收标定浓度；或用二甲亚砜、二甲基甲酰胺等溶剂配制成浓度不低于2.0mM储备液，再用相同中性缓冲液稀释到20μM；滴定使用之前再稀释到2.0μM或所需浓度；

(3)取5～20μL探针溶液加入荧光比色杯内单抗溶液中，温和摇匀后静置反应3～10分钟；用非荧光探针滴定时，280nm激发测定340nm荧光信号；用荧光探针时280nm激发测定340nm荧光信号或荧光探针自身特有发射峰下荧光信号；用丹磺酰胺为色氨酸FRET接受体时，测定在540nm附近荧光信号；荧光信号稳定后记录在所选波长下的荧光信号；

(4)继续取5～20μL探针溶液加入相同荧光比色杯内含待测单抗的溶液中，温和摇匀，静置3～10分钟后测定所选波长下的稳定荧光信号；重复操作到加入探针后所测荧光信号相对变化小于1％或滴定探针累积浓度达到据其蛋白量换算所得抗体活性位点浓度10倍；

(5)按照信号和各种物质的浓度成正比的原则，校正加入的滴定探针溶液对单抗起始浓度C₀的稀释效应、对荧光信号的降低效应；

(四)用Matlab类软件或自编程序，按如下公式拟合滴定曲线测定单抗的位点浓度：

(1)定义如下的变量和符号：

(2)据探针和单抗可逆结合平衡、各成分荧光信号线性加、同时考虑动态及静态猝灭得：

$C_x=\frac{(C_0+x+K_d)-\sqrt{{(C_0+x+K_d)}^2-4\×C_0\×x}}{2}---\left(1\right)$

$\begin{array}{c}F=\frac{S_1\×(C_0-C_x)}{1+\mathrm{Ksv}\×(x-C_x)}+\frac{S_2\×C_x}{1+\mathrm{Ksv}\×(x-C_x)}\\ +S_3\×(x-C_x)+\frac{F_b}{1+\mathrm{Ksv}\×(x-C_x)}\end{array}---\left(2\right)$

(3)当测定荧光探针特有发射信号时确定滴定反应体系的单抗起始浓度C₀有两种方法：

(a)选择滴定曲线起始阶段的数据得到针对初始滴定数据的渐近线；选择接近饱和结合的数据得到探针饱和结合后的渐近线；两条渐近线延长线的交点在横坐标轴上对应的探针总浓度，是滴定反应体系单抗起始浓度C₀的近似值；

(b)实验测定S₃，用Equ.(2)拟合滴定曲线得到最优拟合对应的C₀为所需参数；

(4)测点单抗340nm荧光信号时起始信号等于(C₀×S₁+F_b)，即F_b与C₀、S₁之间有协方差，这使得用Equ.(2)拟合滴定曲线时拟合不收敛；用如下拟合策略可消除此协方差：

(a)先用Equ.(2)拟合某条滴定曲线获得决定系数高于0.99的拟合方程；从拟合方程推算其一阶导数；以一阶导数的最大值，即x趋近于零时的一阶导数，作为S₁的近似值；

(b)设定F_b为零，并将S₁固定在其近似值，再用Equ.(2)拟合相同的滴定曲线，获得对应最佳拟合的唯一C₀作为待测单抗的起始位点浓度。

2.据权利要求1所述一种荧光滴定测定单抗活性位点浓度的方法，其有如下应用特征：

(1)非荧光半抗原、缺乏色氨酸的连续抗原表位能直接作为探针用于滴定单抗活性位点；应用此类非荧光探针需测定340nm荧光信号，对应要求被分析的单抗样品中无其他蛋白或其它抗体或小分子产生的340nm荧光信号，从而使得本底荧光信号F_b为零；

(2)用荧光探针，即适合作为色氨酸FRET接受体荧光团与非荧光探针的加合物及适合作为色氨酸FRET接受体的荧光半抗原本身作为探针，可测定单抗在340nm荧光信号或者这些色氨酸FRET接受体特有荧光信号监测滴定过程获得滴定曲线；用Equ.(2)拟合分析用此类探针测定的色氨酸FRET接受体特异荧光信号能承受样品中的本底信号，同时还能同步确定探针与单抗的亲和力K_d，故应用这种探针还能筛选针对所用半抗原的高亲和力单抗；

(3)此方法所测单抗位点浓度对纯化单抗所含色氨酸的相对丰度变化有抗性。

应用实施例

所用材料和试剂来源

6组氨酸小肽6His及其N端丹磺酰胺(DNS-6His)由北京中科亚光生物科技有限公司合成并纯化到98％以上纯度；纯化抗6His单抗(mcAb-6His)来自南京中鼎生物科技有限公司。纯化的抗亲霉素单抗来自Abcam。亲霉素G(penicillinG，PNG)来自Aladin试剂有限公司。

本发明实施例所用荧光分光光度计为AgilentCarryEclipse荧光分光光度计；如未说明，激发和发射狭缝的宽度都是10nm；测定280m激发340nm发射时仪器的灵敏度即PMT设置为中，测定280nm激发540nm发射时仪器的灵敏度即PMT设置为高。

蛋白浓度用Bradford方法测定。厂家提供的单抗量用280nm吸收和1g/L单抗在1cm光径时吸收为1.37计算；据厂家标示蛋白量和位点分子量80kDa计算的位点浓度为理论浓度。

应用实施例1：用DNS-6His为探针滴定抗6His单抗mcAb-6His活性位点浓度

1.取2.0mL20mM且pH7.0磷酸缓冲液至4.0ml荧光比色杯中，加入稀释mcAb-6His溶液共50ul，理论浓度为75nM到225nM，混合均匀。

2.将DNS-6His溶解在上述中性磷酸盐缓冲液中，并用缓冲液稀释；单抗理论浓度为75nM时对应探针为4uM，单抗为150nM时对应探针为6uM，单抗为225nM时探针为6.0uM。

3.向比色杯内单抗溶液加入5到10μl稀释后探针，温和混合，静置5min至荧光信号稳定，280nm激发同步测定反应液340nm和540nm处的荧光信号(附图1和附图2)。

4.继续向单抗溶液加入5μL稀释探针溶液，摇匀，静置5min，测量荧光信号；重复这一步骤，直至探针的浓度达到抗体理论浓度的10倍。

5.按照下述分析所记录的滴定曲线：

(1)分析280nm激发340nm发射的滴定曲线，在Equ.(2)中，S3用实验测定数值；调整C₀的下界用Equ.(2)拟合滴定曲线得到决定系数大于0.995的拟合方程，据此方程计算得初始点的一阶导数dF/dx最大值为7.0；以此dF/dx的最大值作为单抗的荧光系数S₁代入Equ.(2)再拟合相同的滴定曲线，获得收敛的拟合且单抗的位点浓度C₀。

(2)分析280nm激发540nm发射的滴定曲线，忽略单抗在280nm激发下在540nm信号即以S₁为零，用Equ.(2)拟合得到C₀和Kd。

(3)以靠近滴定起点的渐近线和靠近饱和结合的渐近线的交点对应的横轴，为渐近线交点近似方法所得单抗活性位点浓度。

应用实施例2：用6His为探针滴定抗6His单抗mcAb-6His活性位点浓度

1.取2.0mL20mM且pH7.0磷酸缓冲液至4.0ml荧光比色杯中，加入稀释mcAb-6His溶液共50ul，理论浓度为75nM到225nm，混合均匀。

2.将6His溶解在上述中性磷酸盐缓冲液中，并用缓冲液稀释到2.0或4.0或6.0uM。

3.向比色杯中的mcAb-6His溶液中加入5到10μl稀释后探针溶液，温和混合均匀，静置5min至荧光信号稳定，280nm激发测定反应液340nm荧光信号。

4.继续向mcAb-6His溶液加入5μL稀释探针溶液，摇匀，静置5min，测量荧光信号；重复这一步骤，直至探针的浓度达到抗体理论浓度的10倍(附图3)。

5.分析280nm激发340nm发射的滴定曲线，在Equ.(2)中，S₃用实验测定数值；调整C₀的下界用Equ.(2)拟合滴定曲线得到决定系数大于0.995的拟合方程，据此方程计算得初始点的一阶导数dF/dx最大值为7.0；以此dF/dx的最大值作为单抗的荧光系数S₁代入Equ.(2)再拟合相同的滴定曲线，获得收敛的拟合且单抗的位点浓度C₀。

表1不同方法测定纯化mcAb-6His和抗亲霉素单抗(mcAb-PNG)的比较

**荧光滴定法与渐近线交点近似法相比P＜0.01。ND：未测定。6His：6聚组氨酸小肽。mcAb-6His：抗6His单抗。PNG：亲霉素G。mcAb-PNG：抗PNG单抗。

附图的说明

附图1.用DNS-6His滴定225nMmcAb-6His时测定280nm激发540nm发射的滴定曲线

附图2.用DNS-6His滴定225nMmcAb-6His时测定280nm激发340nm发射的滴定曲线

附图3.用6His滴定225nMmcAb-6His时测定280nm激发340nm发射的滴定曲线

附图4.用PNG滴定225nMmcAb-PNG时测定280nm激发340nm发射的滴定曲线。

Claims (2)

1.一种荧光滴定测定单抗活性位点浓度的方法，其特征如下：

(一)所适用单抗有较高纯度，能识别非荧光半抗原、缺乏色氨酸的连续抗原表位、激发峰在340nm附近而在280nm附近为激发谷的荧光半抗原，且不含有其它抗体或蛋白；

(二)所用滴定探针包括荧光探针和非荧光探针两类；非荧光探针为单抗所识别的非荧光半抗原、缺乏色氨酸连续抗原表位；激发峰在340nm附近且在280nm附近为激发谷的荧光团称色氨酸FRET接受体，对应荧光探针为色氨酸FRET接受体类荧光半抗原、上述非荧光探针与色氨酸FRET接受体荧光团的加合物；

(三)用滴定探针测定对应单抗的荧光滴定曲线；此滴定曲线测定过程的特征如下：

(1)取一定量中性磷酸盐缓冲液至荧光比色杯中，加入一定量单克隆抗体样品溶液混合均匀：用总容量为4.0ml的荧光比色杯时，混匀后液体总体积在2.0ml以上；用微量荧光比色杯时，混匀后液体总体积达到荧光分光光度计测定所含液体荧光信号的要求；

(2)准确称量所选滴定探针，用相同中性缓冲液直接溶解并稀释至不低于20μM，有强吸收探针用吸收标定浓度；或用二甲亚砜、二甲基甲酰胺为溶剂配制成浓度不低于2.0mM储备液，再用相同中性缓冲液稀释到20μM；滴定使用之前再稀释到2.0μM或所需浓度；

(3)取5～20μL探针溶液加入荧光比色杯内单抗溶液中，温和摇匀后静置反应3～10分钟；用非荧光探针滴定时，280nm激发测定340nm荧光信号；用荧光探针时280nm激发测定340nm荧光信号或荧光探针自身特有发射峰下荧光信号；用丹磺酰胺为色氨酸FRET接受体时，测定在540nm附近荧光信号；荧光信号稳定后记录在所选波长下的荧光信号；

(4)继续取5～20μL探针溶液加入相同荧光比色杯内含待测单抗的溶液中，温和摇匀，静置3～10分钟后测定所选波长下的稳定荧光信号；重复操作到加入探针后所测荧光信号相对变化小于1％或滴定探针累积浓度达到据其蛋白量换算所得抗体活性位点浓度10倍；

(5)按照信号和各种物质的浓度成正比的原则，校正加入的滴定探针溶液对单抗起始浓度C₀的稀释效应、对荧光信号的降低效应；

(四)用Matlab软件或自编程序，按如下公式拟合滴定曲线测定单抗的位点浓度：

(1)定义如下的变量和符号：

C_x：滴定探针和单抗的复合物的浓度；C₀：为单抗的位点浓度；

K_d：探针与单抗的解离常数；x：滴定探针的总浓度；

F：测量波长下的总荧光信号；S₁：游离单抗的荧光信号响应系数；

Ksv：滴定探针的动态猝灭常数；S₂：探针和单抗复合物的荧光信号响应系数；

F_b：杂蛋白及其它物质的荧光信号；S₃：游离探针的荧光信号响应系数；

(2)据探针和单抗可逆结合平衡、各成分荧光信号线性相加、考虑动态及静态猝灭得：

$C_x=\frac{(C_0+x+K_d)-\sqrt{{(C_0+x+K_d)}^2-4\×C_0\×x}}{2}---\left(1\right)$

$\begin{array}{c}F=\frac{S_1\×(C_0-C_x)}{1+Ksv\×(x-C_x)}+\frac{S_2\×C_x}{1+Ksv\×(x-C_x)}\\ +S_3\×(x-C_x)+\frac{F_b}{1+Ksv\×(x-C_x)}\end{array}---\left(2\right)$

(3)当测定荧光探针特有发射信号时确定滴定反应体系的单抗起始浓度C₀有两种方法：

(a)选择滴定曲线起始阶段的数据得到针对初始滴定数据的渐近线；选择接近饱和结合的数据得到探针饱和结合后的渐近线；两条渐近线延长线的交点在横坐标轴上对应的探针总浓度，是滴定反应体系单抗起始浓度C₀的近似值；

(b)实验测定S₃，用Equ.(2)拟合滴定曲线得到最优拟合对应的C₀为所需参数；

(4)测点单抗340nm荧光信号时起始信号等于(C₀×S₁+F_b)，即F_b与C₀、S₁之间有协方差，这使得用Equ.(2)拟合滴定曲线时拟合不收敛；用如下拟合策略可消除此协方差：

(a)先用Equ.(2)拟合某条滴定曲线获得决定系数高于0.99的拟合方程；从拟合方程推算其一阶导数；以一阶导数的最大值，即x趋近于零时的一阶导数，作为S₁的近似值；

(b)设定F_b为零，并将S₁固定在其近似值，再用Equ.(2)拟合相同的滴定曲线，获得对应最佳拟合的唯一C₀作为待测单抗的起始位点浓度。

2.据权利要求1所述一种荧光滴定测定单抗活性位点浓度的方法，其有如下应用特征：

(1)非荧光半抗原、缺乏色氨酸的连续抗原表位能直接作为探针用于滴定单抗活性位点；应用此类非荧光探针需测定340nm荧光信号，对应要求被分析的单抗样品中无其他蛋白或其它抗体或小分子产生的340nm荧光信号，从而使得本底荧光信号F_b为零；

(2)用荧光探针，即适合作为色氨酸FRET接受体荧光团与非荧光探针的加合物及适合作为色氨酸FRET接受体的荧光半抗原本身作为探针，可测定单抗在340nm荧光信号或者这些色氨酸FRET接受体特有荧光信号监测滴定过程获得滴定曲线；用Equ.(2)拟合分析用此类探针测定的色氨酸FRET接受体特异荧光信号能承受样品中的本底信号，同时还能同步确定探针与单抗的亲和力K_d，故应用这种探针还能筛选针对所用半抗原的高亲和力单抗；

(3)此方法所测单抗位点浓度对纯化单抗所含色氨酸的相对丰度变化有抗性。