CN103952479A

CN103952479A - 一种新的食管癌诊断标志物及其使用方法

Info

Publication number: CN103952479A
Application number: CN201410122954.XA
Authority: CN
Inventors: 曹秀峰; 李苏卿; 史卫红; 仝宇梭; 庹磊; 汪春梅; 谢海伟; 刘子豪; 杨同昕; 吕进; 纪律; 朱斌; 王和明; 李义生
Original assignee: Nanjing First Hospital
Current assignee: Nanjing First Hospital
Priority date: 2014-03-27
Filing date: 2014-03-27
Publication date: 2014-07-30

Abstract

本发明涉及一种长链非编码RNA及其应用，根据该长链非编码RNA序列，设计并合成特异性实时定量PCR引物和探针，制备用于食管癌辅助诊断或者疗效预测的制剂。利用实时定量PCR制剂，在食管癌临床病例标本中检测该长链非编码RNA的表达水平，发现该长链非编码RNA在食管癌中表达显著下调，本发明有望制备用于食管癌辅助诊断、疗效预测或者预后判断的制剂。

Description

一种新的食管癌诊断标志物及其使用方法

技术领域

本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及一种长链非编码RNA及其应用，具体而言，本发明涉及一种长链非编码RNA在制备食管癌辅助诊断或者预后制剂中的应用。

背景技术

食管癌(Esophageal Carcinoma，EC)是严重危害全人类健康的恶性疾病，全球范围内其发病率和死亡率分别居第八位和第六位。EC主要有两种病理类型：食管鳞状细胞癌(Esophageal Squamous Cell Carcinoma，ESCC)和食管腺癌(Esophageal Adenocarcinoma，EAC)，我国病理类型以鳞癌为主(占90％以上)。据世界卫生组织公布的最新资料显示，我国每年新发ESCC患者超过25万人，因食管癌死亡的患者约20万人，发病率居全国各类恶性肿瘤第5位，死亡率居第4位，均远超世界平均水平。尽管，目前临床上用于食管癌检查和治疗的技术手段在不断改进，但患者总体5年生存率仍然极低。近半个世纪以来，国内外关于EC发病机制的研究已在mRNA、蛋白质以及miRNA领域取得了一系列成果，但其确切的发病机制目前仍在积极的研究探索之中。(Jemal A，et a1.Global cancer statistics.CA：a cancer joumal for clinicians2011，61：69-90；Enzinger PC，et a1.Esophageal cancer.N Engl J Med2003，349：2241-2252；陈万青.2004—2005年中国恶性肿瘤发病与死亡的估计.中华肿瘤杂志2009，31：664-668；赫捷，等.中国食管癌流行病学现状、诊疗现状及未来对策.中国癌症杂志，2011，(7)：501-504.)

人类基因组测序计划完成以后，证实长期备受关注的蛋白编码基因仅约占整个转录组的2％，超过98％的转录产物为ncRNA(noncoding RNA，ncRNA)。随着RNA组学研究的进展，起初被认为是基因组转录“噪音”的ncRNA，被逐步证实其在包括人类在内的多物种，甚至是植物的生理及病理活动中，均具有鲜为人知的广泛而多样化的功能。目前证实具有调控作用的ncRNAs主要分为长度>200nt的LncRNAs以及<200nt的microRNAs，虽然microRNAs是目前为止研究相对比较深入的一类小ncRNAs，但随后人们发现在各个物种中，LncRNAs不仅数量大、种类多，而且在基因的转录和翻译、细胞分化和个体发育、遗传和表观遗传等生命活动中的调控作用较microRNAs更为广泛、精细和复杂(Birney E，et al.Identification and analysis of functional elements in1％of the humangenome by the ENCODE pilot project.Nature2007,447：799-816；Wilusz JE，et al.Long noncodingRNAs：Functional surprises from the RNA world.Genes and Development2009，23：1494-1504；Prasanth KV，et al.Eukaryotic regulatory RNAs：An answer to the′genome complexity′conundrum.Genes and Development2007，21：11-42；Tsai MC，et al.Long intergenic noncoding RNAs：newlinks in cancer progression.Cancer Res2011，71：3-7；Pauli A，et al.Non-coding RNAs as regulatorsof embryogenesis.Nature Reviews Genetics201l，12：136-149；Van LeeuwenS，et al.Longnon-coding RNAs：Guardians of development.Differentiation2010，80：175-183；UA，et al.Long Noncoding RNAs with Enhancer-like Function in Human Cells.Cell2010，143：46-58；CaleyDP,et al.Long noncoding RNAs，chromatin，and development.The Scientific World Journal2010，10：90-102.)。

长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一类转录本长度超过200个核苷酸的非编码RNA，近年研究发现它是一类具有重要生物学功能的RNA，参与基因组印记、染色体沉默、染色质修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等多种重要的调控过程，在细胞分化和发育、基因转录和翻译、遗传和表观遗传等生命活动中均发挥重要的调控作用。近年来，越来越多的权威研究证实lncRNA在肿瘤的发生发展中起着抑制或促进肿瘤的作用，在调控肿瘤细胞增殖、凋亡、细胞周期、侵袭转移能力等方面，均具有十分重要作用。目前已有较多LncRNAs被证实在包括乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤、肝癌、结直肠癌、膀胱癌等在内的人类多种肿瘤中存在差异表达并执行重要的调控功能(GuptaRA，et al.Long non-coding RNA HOTAIR reprograms chromatin state to promote cancermetastasis.Nature2010，464：1071-1076；Cui Z，et al.The prostate cancer-up-regulated longnoncoding RNA PlncRNA-1modulates apoptosis and proliferation through reciprocal regulation ofandrogen receptor.Urologic Oncology：Seminars and Original Investigations2013，31：1117-1123；Khaitan D，et al.The melanoma-upregulated long noncoding RNA SPRY4-ITl modulates apoptosisand invasion.Cancer Research2011，71：3852-3862；Du Y，et al.Elevation of Highly Up-regulatedin Liver Cancer(HULC)by Hepatitis B Virus X Protein Promotes Hepatoma Cell Proliferation viaDown-regulating pl8.J Biol Chem2012，287：26302-26311；Ling H，et al.CCAT2，a novelnoncoding RNA mapping to8q24，underlies metastatic progression and chromosomal instability incolon cancer.Genome Research2013，23：1446-1461；Liu Z，et al.Downregutation of GAS5Promotes Bladder Cancer Cell Proliferation，Partly by Regulating CDK6.PLoS ONE2013，8：9Article Number e73991.)。为探索LncRNA在ESCC中是否具有功能，发明人在人ESCC组织及细胞系中，用目前已经证实在其它肿瘤中具有相关功能的LncRNA进行探索性研究，证实在乳腺癌组织中发现的LncRNA HOTAIR不仅在ESCC癌与配对正常组织中差异表达，而且在ESCC细胞株中可明显抑制肿瘤细胞凋亡并促进肿瘤转移(Chen FJ，et al.Upregulation of the long non-coding rna hotair promotesesophageal squamous cell carcinoma metastasis and poor prognosis.Molecular Carcinogenesis2013，52：908-915.)。此外，发明人也证实在前列腺中发现的PlncRNA-1在ESCC组织中均显著上调并可调控肿瘤细胞增殖能力(Wang CM，et al.Upregulation of theLong Non-coding RNA PlncRNA-1Promotes Esophageal Squamous Carcinoma Cell Proliferationand Correlates with Advanced Clinical Stage，Dig Dis Sci2013.doi：10.1007／s10620-013-2956-7.)。

然而，追踪文献发现除发明人所在课题组外，关于食管鳞状细胞癌的lncRNA表达谱及其相关指标的功能性的研究目前还较少。为系统探索ESCC的lncRNA表达谱，发现与ESCC发生发展特异性相关的一组lncRNAs，发明人采用芯片技术筛选到一条在人ESCC癌组织中显著低表达的lncRNA，该基因被命名为PRSS3P2(Ensemble database)，其转录区域位于7号染色体正义链142，478，064-142，482，416bp对之间，基因全长约为905bp。发明人研究证实：与配对正常组织相比，该lncRNA在人ESCC癌组织中显著低表达，并在后期的大样本组织qRT-PCR(Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction，实时定量PCR)实验中进一步证实该指标在人ESCC癌组织中的表达，显著低于配对正常组织。为便于后期研究及论述，发明人将其命名为HDESCC-lncRNAl(highlydown-regulatedin esophageal squamous cell carcinoma，long noncoding RNA i)。发明人重点关注了ESCC的lncRNA表达谱，这一类新型的基因调控因子将有望进一步丰富和完善包括食管鳞癌在内的肿瘤发病机制的研究，也为发现肿瘤诊断及预后判断的标志物、新的肿瘤治疗靶点带来希望。

发明内容

为系统研究人食管鳞状细胞癌的lncRNA表达谱，发现与人食管鳞状细胞癌发生与发展密切相关的新的lncRNAs，由发明人提供的6对食管癌和配对正常组织标本，通过Qiagen公司的RNA提取试剂盒(RNeasy Micro Kit，货号74004)提取RNA后，采用北京博奥生物有限公司的晶芯lncRNA芯片V2(4×180K)检测筛选出一条在食管癌组织中显著低表达的lncRNA，命名为HDESCC-lncRNAl，其基因序列如序列表SEQ ID NO.1所示。后期经过共110对人ESCC癌与配对正常组织样本qRT-PCR验证发现，在88对样本中该lncRNA表达在癌组织中显著下调。该lncRNA有望成为肿瘤诊断和预后判断的标志物，同时也为肿瘤的治疗提供了新的靶点。

本发明的目的是提供一种检测在食管鳞状细胞癌组织中低表达的lncRNA序列及其应用方法。

本发明系统的研究食管鳞状细胞癌的lncRNA表达谱，发现与食管鳞状细胞癌发生与发展密切相关的新的lncRNA。

本发明的目的是提供一种检测在食管鳞状细胞癌组织中低表达的HDESCC-lncRNA1序列。

本发明提供了所述HDESCC-lncRNAl序列的检测应用方法，根据该序列制备用于食管癌辅助诊断或者疗效预测的制剂。

本发明根据所述HDESCC-lncRNAl序列设计了3对引物用于检测HDESCC-lncRNA1序列。

Pairl上游引物：SEQ ID NO.2

Pairl下游引物：SEQ ID NO.3

Pair2上游引物：SEQ ID NO.4

Pair2下游引物：SEQ ID NO.5

Pair3上游引物：SEQ ID NO.6

Pair3下游引物：SEQ ID NO.7

本发明根据所述HDESCC-lncRNAl序列设计并合成出用于实时定量PCR的检测引物组。所述引物组适用于SYBR Green、TaqMan探针、分子信标、双杂交探针、复合探针等的检测。

优选的用于染料类实时定量PCR检测的引物组分别为：

Pair3上游引物：SEQ ID NO.6

Pair3下游引物：SEQ ID NO.7

本发明中，qRT-PCR、实时定量PCR、荧光定量PCR是同一概念，可以相互替换使用。

本发明的另一目的是提供一种检测HDESCC-lncRNAl表达水平的荧光定量PCR试剂盒及使用方法，该荧光定量PCR试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，灵敏度高，定量快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景。

本发明制备了一种检测lncRNA表达水平的染料类实时定量PCR试剂盒，组分如下：特异性引物、标准DNA模板、荧光染料、实时定量PCR反应液。其中所述的特异性引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ IDNO.6，下游引物序列为SEQ ID NO.7。所述荧光定量PCR反应液包括dNTP、Mg²⁺、Taq酶及buffer缓冲液。所述荧光染料优选SYBR Green II，Taq酶优选热启动酶。

本发明还公开了一种检测食管鳞癌的染料类荧光定量PCR试剂盒的使用方法，荧光定量PCR体系：

上游引物(10μmol／L)2μL；下游引物(10μmol／L)2μL；样品cDNA4μL(或标准DNA模板DNA2μL)；50×ROX Reference Dye1μL；2×SYBR Premex ExTaq II(TIi RNaseH Plus)25μL，加离子水至50μL。荧光定量PCR程序：95℃30s预变性，接40个循环：95℃5s，60℃30-34s。

本发明还公开了一种长链非编码RNA的检测方法，包括样品总RNA的提取、样品cDNA的制备、HDESCC-lncRNAl的扩增。

以上所述的样品总RNA的提取、样品cDNA的制备、HDESCC-lncRNAl扩增的具体步骤包括：

1)样品总RNA的提取：按照Life Technologies公司的TRIZOL试剂(货号15596026)所需试剂及步骤提取食管鳞状细胞癌组织或肿瘤的Total RNA；再用NanoDrop ND-1000核酸定量仪定量(NanoDrop Technologies，Wilmington，Delaware)定量所提取的RNA的纯度和浓度，甲醛变性胶电泳质检确保提取的RNA的完整性。

2)样品cDNA的制备：采用TaKaRa试剂盒PrimeScript^TM RT reagent Kit withgDNA Eraser(Perfect Real Time)(货号RR047A)对提取的总RNA反转录合成cDNA；该试剂盒内含RNase-Free DNase，可有效去除混杂的基因组DNA。

第一步去除基因组DNA反应，反应体系及条件如下：

试剂	使用量
		5×gDNA Eraser Buffer	2.0μl
gDNA Eraser	1.0ul
		Total RNA	1μg
RNase Free dH2O	加水至10μl

将上述组份混合后42℃反应2min；

第二步反转录反应，反应体系及条件如下：

试剂	使用量
		步骤1的反应液	10.0μL
PrimeScript IRTEnzyme Mix I	1.0μl
		RT Primer Mix	1.0ul
5×PrimeScript Buffer2	4μl
		RNase Free dH₂O	4.0ul
总体积	20μl

将上述组份混合均匀后37℃孵育15min，然后85℃灭活5sec，即得到cDNA。

3）HDESCC-lncRNAl的扩增：采用TAKARA SYBR Premix Ex Taq^TM II(TIiRNaseH Plus)荧光定量试剂盒，以反转录的cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增。

染料类荧光定量PCR体系：上游引物(10μmol／L)2μL；下游引物(10μmol／L)2μL；样品cDNA4μL(或标准DNA模板DNA2μL)；50×ROX Reference Dye(或50×ROX Reference Dye II)1μL；2×SYBR Premex Ex Taq II(TIi RNaseHPlus)25μL，加离子水至50μL。荧光定量PCR程序：95℃30s预变性，接40个循环：95℃5s，60℃30-34s。

本发明还检测了试剂盒灵敏性，结果显示本发明试剂盒检测范围为10⁷-10²copies／μL，最小检出浓度为100copies／μL。

通过对阳性样品的检测，发现本发明染料类荧光定量试剂盒检测准确率为80％，连续3次重复实验，实验结果稳定。

附图说明

图1.LncRNA芯片聚类图

显示6对食管鳞癌癌与癌旁组织差异表达的LncRNA芯片聚类

图2.特异性引物筛选结果图

针对该LncRNA的序列设计的3对特异性引物PCR扩增后行琼脂糖凝胶电泳测试引物的效果

图3.第一批30例ESCC临床样本的HDESCC-lncRNAl初步qRT-PCR检测结果(2^-△ct作图)

图4.第二批80例ESCC临床样本的HDESCC-lncRNAl再验证qRT-PCR检测结果(2^-△ct作图)

图5.两批共110例样本HDESCC-lncRNAl在癌与癌旁组织差异表达qRT-PCR检测统计分析(2^-△ct值比较，^*P<0.05，^**P<0.01)

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。

实施例1人食管鳞状细胞癌癌与配对正常组织的IncRNA芯片表达分析

一材料和方法

1、材料

组织样本来自于6对食管鳞状细胞癌患者的住院病例手术切除样本，每对包含食管肿瘤组织和配对的正常食管组织。

2、方法

2.1肿瘤组织和配对正常组织总RNA的提取

按Qiagen公司的RNA提取试剂盒(RNeasy Micro Kit，货号74004)说明书提取食管磷癌病人肿瘤组织和配对正常组织的总RNA，该试剂盒内含RNase-Free DNase I(lyophilized)，可有效去除混杂的基因组DNA。再用NanoDropND-1000核酸定量仪定量(NanoDrop Technologies，Wilmington，Delaware)定量所提取的RNA的纯度和浓度，甲醛变性胶电泳质检确保提取的RNA的完整性。

2.2对样品RNA进行荧光标记(晶芯cRNA扩增标记试剂盒，产品目录号：360060-10)

2.2.1反转录合成第一链cDNA

以Total RNA为起始，含有T7启动子序列的T7Oligo(dT)Primer为引物，使用CbcScript酶合成第一链cDNA。

2.2.2合成2^nd-strand cDNA

用RNase H将杂合链中的RNA切成短片段，DNA Polymerase以RNA短片段为引物延伸，合成2^nd-strand cDNA，并纯化双链cDNA。

2.2.3体外转录合成cRNA

以cDNA为模板，利用T7Enzyme Mix合成cRNA；然后用RNA Clean-up Kit(MN)纯化。

2.2.4随机引物反转录

取5ug cRNA，用CbcScript II酶，Random Prime进行反转录，反转录产物用PCR NucleoSpinExtract II Kit(MN)纯化。

2.2.5cDNA用KLENOW酶标记

取上述反转录产物，以Random Primer为引物进行KLENOW酶标记，标记产物用PCR NucleoSpinExtract II Kit(MN)纯化，纯化后抽干。(Cy5-dCTP orCy3-dCTP(GE Healthcare)。

2.3杂交与清洗

标记的DNA溶于杂交液中(2×GEx Hyb Buffer(HI-RPM)，25％甲酰胺)，于45℃杂交过夜。杂交结束后，先在42℃左右含0.2％SDS，2×SSC的液体中洗5min，而后在0.2×SSC中室温洗5min。玻片甩干后即可用于扫描。

2.4芯片扫描

芯片用Agilent G2565CA Microarray Scanner进行扫描，得到杂交图片。

2.5芯片图像的采集和数据分析

2.5.1荧光信号值提取

采用Feature Extraction图像分析软件对芯片图像进行分析，把图像信号转化为数字信号。

2.5.2差异基因筛选

将原始数据输入到GeneSpring GX软件中，采用percentile shift方法对信号值进行归一化处理。然后用Absolute Fold change>2，同时Flag标记为Detected的标准进行差异基因筛选。

二结果

关于人食管鳞状细胞癌的LncRNA芯片聚类分析见图1。芯片筛查发现多条表达上调和表达下调的lncRNA。其中HDESCC-lncRNAl显示出在癌组织中表达显著下调，鉴于其可能在人食管鳞状细胞癌的癌组织中存在特异性表达，本发明通过以下实施例采用大规模样本分批次进行指标的重复验证。

实施例2qRT-PCR初步验证HDESCC-IncRNAl在食管鳞状细胞癌的癌组织和正常组织中的差异表达

一、实验材料

再选取另外30对(不同于芯片测试的样本)人食管鳞状细胞癌的癌组织和配对正常组织，对HDESCC-lncRNAl的表达差异进行qRT-PCR初步验证。

二、实验方法和结果

l引物特异性鉴定

1.1特异性引物的筛选

(1)从Ensemble数据库提取HDESCC-lncRNAl相关的转录本序列，并用根据转录本的序列通过NCBI的引物设计工具(Primer-BLAST)设计引物；

(2)设计后的引物用Oligo7评价，每条设计3对引物；

Pairl上游引物：SEQ ID NO.2

Pairl下游引物：SEQ ID NO.3

Pair2上游引物：SEQ ID NO.4

Pair2下游引物：SEQ ID NO.5

Pair3上游引物：SEQ ID NO.6

Pair3下游引物：SEQ ID NO.7

经RT-PCR及琼脂糖凝胶电泳实验验证，筛选用于染料类实时定量PCR检测的引物组如下(图2)：

Pair3上游引物：SEQ ID NO.6

Pair3下游引物：SEQ ID NO.7

(3)将人食管鳞状细胞癌的癌与配对正常组织按照Life Technologies公司的TRIZOL试剂(货号15596026)所需试剂及步骤提取总RNA；再用NanoDropND-1000核酸定量仪定量(NanoDrop Technologies，Wilmington，Delaware)定量所提取的RNA的纯度和浓度，甲醛变性胶电泳质检确保提取的RNA的完整性。

(4)采用TaKaRa试剂盒PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time)(货号RR047A)对提取的总RNA反转录合成cDNA，该试剂盒内含gDNA Eraser DNase，可有效去除混杂的基因组DNA。

第一步去除基因组DNA反应，反应体系及条件如下：

试剂	使用量
		5×gDNA Eraser Buffer	2.0μ1
gDNA Eraser	1.0μl
		Total RNA	1μg
RNase Free dH2O	加水至10μl

将上述组份混合后42℃反应2min；

第二步反转录反应，反应体系及条件如下：

试剂	使用量
		步骤1的反应液	10.0μl
PrimeScript RT Enzyme Mix I	1.0μl
		RT Primer Mix	1.0μl
5×PrimeScript Buffer2	4μl
		RNase Free dH₂O	4.0μl
总体积	20ul

将上述组份混合均匀后37℃孵育15min，然后85℃灭活5sec，即得到cDNA。以合成的cDNA为模板，分别针对3对引物设定反应组以及不加cDNA模板的阴性对照组，以除外引物二聚体可能，再按步骤(2)设计的引物进行PCR反应；

(5)电泳检测，选用Marker DLl000(TaKaRa)。引物选取标准：a.通过Marker对扩增片段大小进行初步评估，扩增片段大小与预期相同；b.扩增产物只有一个，即保证引物扩增的特异性。结果如图2所示，最佳引物对为Pairl，其序列见序列表SEQ ID NO.6，下游的特异性引物，其序列见序列表SEQ IDNO.7。

2样品总RNA的提取：

采用液氮研磨法，按照Life Technologies公司的TRIZOL试剂(货号15596026)所需试剂及步骤提取食管鳞状细胞癌组织或肿瘤的Total RNA。主要操作步骤如下：

(1)样品在离体后迅速冷冻在液氮中，抽提RNA时把组织放入己预冷的研钵中进行研磨，边研磨边加液氮，整个过程都不要使液氮挥发干；

（2)组织样品研磨成粉末状后，在液氮基本挥发完时，每个研钵中加入1-2mlTRIZOL试剂，TRIZOL加入后会冻结成固体状，可以继续研磨此固体成粉末，随着研钵温度回升到室温，固体状的TRIZOL逐步回复到液体状态，把此TRIZOL试剂转移到玻璃匀浆器中，再进一步匀浆3-5min；

(3)把TRIZOL试剂转移到1.5ml离心管中，每1毫升的TRIZOL试剂添加0.2毫升氯仿。小心盖好样品管。用手大力摇管15秒，15-30℃孵育2-3分钟。2-8℃，不超过12000g离心15分钟。离心后，混合物分离为红色下层(酚-氯仿相)、中间相以及上层的无色水相，RNA存在于水相；

（4)水相转移到一个新管，混合异丙醇以从水相中沉淀RNA，每1毫升用于初始的同质化的TRIZOL试剂使用0.5毫升异丙醇，15-30℃孵育样品10分钟，2-8℃，不超过12000g离心10分钟；

(5)弃上清，用75％的乙醇洗涤RNA沉淀一次，每毫升用于初始同质化的TRIZOL试剂使用至少1毫升75％的乙醇，涡旋混合，2-8℃，不超过7500g离心5分钟；

(6)弃上清，简单干燥RNA沉淀(空气干燥或真空干燥5-10分钟)，用20-100ul无RNA酶的水吹打几次溶解RNA并保存于-70℃，在该过程中需注意，不要让RNA沉淀完全干燥，因为这将大大降低其溶解度。

3标准DNA模板的制备

按照说明书，从食管鳞状细胞癌的配对正常组织中，利用Invitrogen RTIZOL试剂盒提取总RNA，并进一步采用NucleoSpinRNA clean-up试剂盒(MACHEREY-NAGEL，Germany)对总RNA进行过柱纯化，接着进行逆转录反应，反转录体系为：反转录随机引物(2μmol／L)1μL，总RNA4μL，dNTP混合物(每种2.5mmol／L)4μL，0.1mol／L DTT2μL，SuperScript RNase H逆转录酶(200U／μL)2μL(TAKARA)反应条件为：37℃水浴60min，95℃3min。

将逆转录反应得到的cDNA进行常规PCR，反应体系和条件如下：10×Ex Taqbuffer10μL，dNTP Mixture(各2.5mmol／L)4μL，Sequence NO.6(10pmol)4μL，Sequence NO.7(10pmol)4μL，cDNA(0.1-2μg)5μL，Ex Taq DNA聚合酶0.5μL，双蒸水补齐至100uL。反应条件为94℃预变性5min；94℃变性50s，50℃退火50s，72℃延伸50s，35cycles；最后72℃延伸10min。

取样5μL，对PCR扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，进行切胶回收并纯化(回收使用试剂盒：EZ-10Spin Column DNA Gel Extraction Kit)，将纯化产物连接到pGM-T克隆载体，随后转化到DH5a感受态细胞中。通过序列为SEQID NO.6和SEQ ID NO.7的特异性引物筛选阳性克隆。阳性克隆扩增后提取质粒DNA，质粒DNA采用NanoDrop ND-1000核酸定量仪定量(NanoDropTechnologies，Wilmington，Delaware)并做10倍系列稀释作为标准品用于标准曲线的制备(标准DNA模板浓度范围在10⁸-10²copies／μl)。

4敏感性实验

取重组质粒按比例稀释为10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²个拷贝／μL，进行荧光定量PCR，以检测为阳性的最低浓度为该方法的检测灵敏度。本研究所建立的方法检测范围为10⁸-10²copies／μL，最小检出浓度为100copies／μL。

5合成cDNA模板

取上述30对食管鳞癌癌组织和配对正常组织的总RNA，采用TaKaRa试剂盒PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)(货号RR047A)对提取的总RNA反转录合成cDNA，该试剂盒内含gDNA EraserDNase，可有效去除混杂的基因组DNA。

第一步去除基因组DNA反应，反应体系及条件如下：

试剂	使用量
		5×gDNA Eraser Buffer	2.0ul
gDNA Eraser	1.0μl
		Total RNA	1μg
RNase Free dH2O	加水至10μl

将上述组份混合后42℃反应2min；

第二步反转录反应，反应体系及条件如下：

试剂	使用量
		步骤1的反应液	10.0ul
PrimeScript RT Enzyme Mix I	1.0μl
		RT Primer Mix	1.0μl
5×PrimeScript Buffer2	4μl
		RNase Free dH₂O	4.0μl
总体积	20μl

6染料类荧光定量PCR检测HDESCC-IncRNAl表达量

采用TAKARA SYBR Premix Ex Taq^TM II(TIi RNaseH Plus)荧光定量试剂盒(货号RR820A)。50μLqRT-PCR反应体系包括：上游引物(10μmol／L)2μL；下游引物(10μmol／L)2μL；样品cDNA4μL；50×ROX Reference Dye1μL；2×SYBR Premex Ex Taq II(TIi RNaseH Plus)25μL，加离子水至50μL。仪器采用Applied Biosystems7500。荧光定量PCR程序：95℃30s预变性，接40个循环：95℃5s，60℃30-34s。

根据qRT-PCR的相对定量公式2^-△Ct，比较HDESCC-lncRNAl在食管鳞癌患者肿瘤组织和瘤旁组织中的表达水平。结果如图3所示：qRT-PCR扩增结果稳定，其中HDESCC-lncRNAl在正常组织中的表达水平在0.002-0.150之间，明显高于瘤组织和对照质粒100copies，而瘤组织中的HDESCC-lncRNAl的表达量主要集中在0.000-0.03之间，以上结果说明HDESCC-lncRNAl在肿瘤组织中普遍低表达。再按照相对表达量T-N>0定义为该指标表达上调；T-N<0定义为该指标表达下调。则本次实验结果显示：HDESCC-lncRNAl在30对ESCC癌组织中，与配对正常组织相比表达下调24对，再按照公式：下调表达例数／总检测例数x100％定义该指标的阳性检出率，则该指标的阳性率为80％。

实施例3qRT-PCR进一步验证HDESCC-IncRNAl在食管鳞状细胞癌的癌组织和正常组织中的差异表达

1、qRT-PCR试剂盒组成

1.1染料类HDESCC-lncRNA1qRT-PCR试剂盒组成：

(1)上游引物：SEQ ID NO.6

(2)下游引物：SEQ ID NO.7；

其他试剂参照SYBR Premix Ex Taq^TM II(Tli RNaseH Plus)荧光定量试剂盒(Code No.RR820A)。

2.HDESCC-lncRNAl qRT-PCR的检测

2.1总RNA的制备

选取另外80对食管鳞状细胞癌病人的癌组织和配对正常组织，按照LifeTechnologies公司的TRIZOL试剂(货号l5596026)所需试剂及步骤提取总RNA，具体参见说明书。再用NanoDrop ND-1000核酸定量仪定量(NanoDropTechnologies，Wilmington，Delaware)定量所提取的RNA的纯度和浓度，甲醛变性胶电泳质检确保提取的RNA的完整性。

2.2cDNA合成

采用TaKaRa试剂盒PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser(PerfectReal Time)(货号RR047A)，将检测合格的总RNA进行逆转录反应。

2.3qRT-PCR检测

qRT-PCR在仪器采用Applied Biosystems7500。qRT-PCR反应程序如实施例2中荧光染料类实时定量PCR检测HDESCC-lncRNAl表达量。

3检测结果

实时定量PCR检测结果显示，在80对食管鳞状细胞癌病人的样本中与配对正常组织相比，64对患者该指标在肿瘤组织中表达明显下调，测阳性率仍为80％(图4)。以上结果再次证明该指标在肿瘤组织中普遍低表达。我们对上述样本进行重复3次qRT-PCR检验，结果重复性达100％，表明本发明试剂盒的重复性和稳定性较好。

实施例4HDESCC-IncRNAl在ESCC诊断和预后判断的潜在价值分析

在检测了HDESCC-lncRNAl在110例ESCC患者的表达情况的基础上，对ciRT-PCR反应结果使用SPSS For Windows20.0软件，相关数据经过Normal test检验，依据数据类型选用Mann-Whitney检验进行数据分析，P<0.05认为该指标的差异表达有统计学意义。QRT-PCR结果分析HDESCC-lncRNAl在110对ESCC样本中的表达水平显著低于配对正常食管组织(图5，P<1×10^-6)。随着后期研究结果的深入，HDESCC-lncRNAl在ESCC中的功能及其作用机制将逐步阐明，这一新颖的长链非编码RNA不仅能成为诊断相关的生物标志物，更有望成为新的ESCC治疗靶点以改善、提高临床ESCC治疗效果。显然，找到更多、更准确的像HDESCC-lncRNAl这样的有望参与辅助ESCC诊断、治疗及预后相关的生物标志物，具有十分重要的现实意义。

Claims

1.一种长链非编码RNA在制备用于食管癌辅助诊断或者疗效预测试剂中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述食管癌为食管鳞状细胞癌。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述长链非编码RNA序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的用于食管癌辅助诊断或者疗效预测的试剂为实时定量PCR检测试剂。

5.一种用于食管癌辅助诊断或者疗效预测的实时定量PCR检测试剂盒，其特征在于，包括根据核苷酸序列为SEQ ID NO.1的长链非编码RNA设计并合成出特异性用于实时定量PCR的检测引物。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，用于长链非编码RNA实时定量PCR检测的特异性引物如序列表中SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。

7.一种长链非编码RNA的检测方法，包括样品RNA的提取、样品cDNA的制备、lncRNA的扩增。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述的样品RNA的提取、样品cDNA的制备、lncRNA的扩增的具体步骤包括：

1)样品总RNA的提取：按照Life Technologies公司的试剂所需试剂及步骤提取食管鳞状细胞癌组织或肿瘤的Total RNA；再用NanoDropND-1000核酸定量仪定量(NanoDrop Technologies，Wilmington，Delaware)定量所提取的RNA的纯度和浓度，甲醛变性胶电泳质检确保提取的RNA的完整性。

2)样品cDNA的制备：采用TaKaRa试剂盒PrimeScript^TM RT reagent Kitwith gDNA Eraser(Perfect Real Time)(货号RR047A)对提取的总RNA反转录合成cDNA；该试剂盒内含RNase-Free DNase，可有效去除混杂的基因组DNA。

3）lncRNA的扩增：采用TAKARA SYBR Premix Ex Taq^TM II(TIi RNaseHPlus)荧光定量试剂盒，以反转录的cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增。