CN103952295A - 细胞分离装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种细胞分离装置，包括浮动式隔板，离心管及分离液组成，可用于分离淋巴细胞，白细胞，单核细胞，精子等分离试验，可用于细胞治疗和临床检验和科研试验领域，操作简单，细胞纯度高，安全性高。本发明涉及的细胞分离装置，安全性高，成本低，适合在临床和科研领域大量推广。

Description

细胞分离装置

技术领域

本发明涉及一种浮动隔板式细胞分离装置，属于生物学领域，适用于淋巴细胞，白细胞，干细胞等生物细胞的分离，特别适用于细胞治疗等高风险、大批量样本处理的医疗技术领域。 

背景技术

细胞治疗是近几年兴起的疾病治疗新技术，是指利用某些具有特定功能的细胞的特性，采用生物工程方法获取和/或通过体外扩增、特殊培养等处理后，使这些细胞具有增强免疫、杀死病原体和肿瘤细胞、促进组织器官再生和机体康复等治疗功效，从而达到治疗疾病的目的，细胞治疗技术在肿瘤治疗中得到广泛应用，并取得了卓著的成果。随着该技术的不断成熟，大批量高效的淋巴细胞分离是其中的一个关键环节。目前，普遍采用的是淋巴细胞分离液通过密度梯度法实现细胞分离，但是分离过程中，特别是大批量样本处理时，血液样品加入和淋巴细胞分离液时，二者界面很容易发生混合，造成分离效果差，效率低。针对这种情况，美国的BD公司，greinerBio公司，Axis Shield公司以及深圳市达科为生物工程有限公司先后开发了淋巴细胞分离管产品，并申请了专利保护。前面三家公司是采用普通分离管，中间粘上了一层滤网，从而把分离管分成两个空间，避免血样与分离液的混合。深圳市达科为生物工程有限公司是采用一种医用半固体组织，将普通离心管分割成3个空间，分离液，半固体组织与分离液的吸附物和上部空间，从而避免了血样与分离液的混合。以上技术对于淋巴细胞分离技术进行了改进，并有效提高了分离效率。但是仍有一定的局限性。 

第一：国外公司采用的隔网式技术，要求技术含量高，成本昂贵，仅有几家公司可以生产。 

第二：这几家公司采用的胶水或者半固体组织需要做到无毒，无渗出，基本没有可能，因为该技术用于分离得到的淋巴细胞经过培养，再次输入人体，微量的渗出物可能造成严重的影响或潜在的危害。 

第三：长时间放置后，分离液体积挥发减少，造成隔板下或半固体组织表面存在气泡，影响分离效果。 

分离后，自下而上形成了红细胞，分离液，隔板或半固体组织，分离液，淋巴细胞，血浆几个分层，再吸取淋巴细胞的同时，很容易把血浆和分离液一并吸出，造成分离纯度和得率不高，并且后续洗涤过程中需要加入较多的清洗液，才能把分离物的密度降下来，造成工作量的增加。这也是以上几家公司的产品同时存在的问题。 

发明内容

为了解决以上存在的问题和缺陷，本发明提供了一种应用更广泛，特别是更加安全，高效，高得率，与目前国内外产品相比更加适合于细胞治疗领域的细胞分离管。 

本发明提供以下技术方案： 

本发明的基础是采用密度梯度法进行细胞分离，分离管由以下三个部分组成：

通用离心管（15ml或50ml），微孔板（孔径0.2~0.8mm，厚度2mm，直径），细胞分离液（密度1.0774，渗透压285）

淋巴细胞分离方法：

1.      离心管中加入分离液，放入隔板；

2.   将血液样品(15ml分离管加3~8ml，50ml分离管加30~40ml)倒入分离罐内，旋紧盖子；

3.      放入离心机，设置离心力为1000g，时间为20min，离心；

4.      取出分离管，吸去最上层血清；

5.      倒出淋巴细胞层；

6.      清洗，离心；

7.      染色，计数。

本方案操作时间最短，加血样时，直接倒入分离管中，不用担心二者混合，分离完成后，微孔板随着管中密度梯度的变化上浮，接近淋巴细胞层的位置。吸去上层血清，最后倒出来的就只有淋巴细胞层，保证了细胞的回收率和纯度。传统的吸取方法速度慢，容易造成溶液各层的混合，影响回收率和纯度。 

附图说明

图1 淋巴细胞分离过程示意图 

具体是实施方式

本发明的淋巴细胞分离管包括通用离心管和微孔隔板两部分组成，采用通用离心管是增加该技术的通用性，无需专用设备。微孔隔板的直径比离心管的直径小0,2 mm，边缘高度5mm，在使用时，可以预先把分离液加入分离管，离心，隔板自然漂浮于分离液液面之上，也可以在使用前加入分离液，离心，然后加入血样。隔板不需固定在管壁上。1隔板直径切面的对角线大于离心管直径，保证隔板不会再分离管中翻转；2 隔板与离心管直径间隙适中，不能太松或太紧；3 在往外倒出淋巴细胞时，由于毛细作用，不会使下层的分离液和红细胞漏出；4 隔板的材料为安全无毒的塑料制品，理化稳定性好，无渗出；5 隔板的密度为1.03~1.07之间，确保比血清比重大，比分离液比重小。 

按照上述方法进行离心时，红细胞透过隔板进入下层，分离液被置换到中层，隔板随着浮力作用上浮至血清层附近，分离过程见附图1： 1 分离管中加入分离液和隔板；2加入血样；3 离心后，离心管的各层分布。 

通过本发明的分离管进行分离试验，与国内外几家公司的产品进行对照，结果证明，分离效果非常好，分层条带清晰，其细胞得率和进口固定隔网式分离管和半固体分离管产品相当，在细胞纯度，操作简便性方面具有显著的优势。 

表一：淋巴细胞得率的比较（单位：10⁶） 

细胞得率	普通分离法	固定隔网分离管	半固体分离管	浮动隔板分离管
					15ml规格	4.12	5.80	5.96	5.90
50ml规格	29.30	35.86	35.48	35.81

以上四种方法采用同一个血样，15ml规格加3ml分离液，5ml抗凝血血样，50ml加15ml分离液，30ml抗凝血血样。普通分离方法分离之后，用移液枪吸出淋巴细胞层，后面三种方法，吸出上层血清后，采用直接倾倒法。每个品种做3个平行，分离样品采用细胞计数板计数，求平均值，计算细胞总数。

以上实验结果显示后面三种方法细胞得率没有显著差异，较普通方法得率有一定提高。 

表二：淋巴细胞纯度的比较（单位%） 

主要杂细胞比例	普通分离法	固定隔网分离管	半固体分离管	浮动隔板分离管
					红细胞比例	2.67	9.67	16.33	1.67
粒细胞比例	8.67	25.00	37.67	2.33

对以上分离得到的样品进行涂片染色，在显微镜下观察，对主要的杂细胞计数，计算得到与淋巴细胞的比值，取平均值，结果表明：浮动隔板分离管得到的样品中粒细胞和红细胞的相对比值显著优于前三种方法，总体纯度更高。

由于浮动隔板式分离管分离的细胞纯度较高，材料安全性更好，在后续的细胞培养过程中，浮动隔板式分离管分离的细胞在生长贴壁性和细胞分化方面，要明显优于其他产品。 

Claims (4)

1.一种细胞分离装置，包括离心管和隔离板，其特征在于隔离板可以通过浮力作用，在分离管中发生位置移动，可以避免样本与分离液混合，同时可以避免分离的目标细胞层与相邻层的混合。

2.细胞分离装置中隔离板，其特征在于所选用材料的密度在血清与分离液之间。

3.权利要求2中所述的隔离板，其特征在于材料为理化性能稳定，生物兼容性好，不影响分离细胞的生理生化性能。

4.权利要求2中所述的隔离板，其特征在于隔板上均匀布满小孔，可以使不同大小的细胞透过隔离板小孔。