CN103946392A - 生化分析的系统、设备和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供对样品（例如细胞或核酸）进行生化分析的系统、设备和方法。对样品进行分析以获取分子信息，并且样品仍可被用于后续分析或测试。所提供的系统、设备和方法以及系统可用于以高通量的方式对生物样品进行定量和高并行的生化反应。

Description

生化分析的系统、设备和方法

要求优先权

本国际申请要求于2011年7月14日提交的美国临时申请号61/507,966的优先权和权益，所述美国临时申请标题为“生化分析的系统、设备和方法”（参考文献144,717-025），所述申请的整体内容通过引用合并入本文。

相关申请信息

本申请涉及于2008年8月8日提交的，于2009年2月12日公开的美国申请2009/0042737，所述申请标题为“相关的、多参数单细胞测量和残余生物材料回收的方法和装置”，所述申请的整体内容通过引用合并入本文。本申请没有要求所述美国申请的优先权。

发明领域

本发明提供了对样品(例如细胞或核酸)进行生化分析的系统、设备和方法。分析样品以获取分子信息，并且样品优选地仍可被用于后续分析或测试。本发明所提供的系统、设备和方法对以高通量的方式对生物样品进行定量和高并行的生化反应是有用的。

发明背景

在溶液中进行的反应例如生化反应经常在腔室或其它容器内实施。此类腔室或反应容器，通常是由玻璃或塑料制成的，包括例如试管、微量离心管、毛细管和微量滴定板。目前应用的反应室不适用于1微升以下的体积，原因是例如反应室内的大端部体积（large head volume）的问题，其导致反应溶液的蒸发损失，并且难以向反应室中添加和从中移除反应混合物。相应地，可用的反应室不能为回收反应混合物用于后续测试或分析提供便利的手段。

许多类型的生物化学反应，例如核酸扩增，需要温度循环。许多反应室的材料是差的热导体，因此涉及到反应容器的温度变化和整个样品体积的温度变化的平衡时，会产生时间滞后。此种温度变化和温度平衡的滞后导致循环时间延长，单个反应中的不均匀反应条件，以及多重反应缺乏再现性，无论是同时的还是连续的。

通常需要对大量相同的样品进行一系列实验。通常这组样品必须连续地复制，或通过手动或通过机械液体递送系统。这些过程可能是缓慢的，因为它们依赖于将被复制的样品的总数，以及如果适用的话，机器人的速度。另外，可能有必要对同一个样品进行多个生化反应。目前的系统不允许对样品进行连续反应。

实时聚合酶链反应（qPCR）是用于定量测定从生物样品（例如细胞或血浆）中提取的DNA和RNA的技术。大多数qPCR反应是在大体积反应（bulk reaction）中使用相当于10,000至100,000个细胞的混合基因组完成的。越来越多的研究人员对测定生物样品，包括例如单个细胞或血浆中的游离核酸的遗传内容感兴趣，但这项工作由于试剂的高成本和目前可用的劳动密集型人工方法受到阻碍。即使是最先进机器人和1536微孔板，使用范围在1-10μL每孔，超过几百个孔后仍然造价昂贵。在罕见事件（例如罕见等位基因）发生在小部分目标遗传物质的情况下，逐一检查数千个生物样品的等分试样可能是可取的。如果不付出巨大的时间和金钱成本，目前的技术无法达到这个级别的通量。此外，目前的技术是端点系统，无法轻易回收生化反应后的遗传物质用于后续测试或分析，例如测序。

因此，需要一种适合于对微量生物样品进行生化反应的系统、设备和方法。另外一个需求是对回收这种经反应的样品用于后续分析或测试的改进方法。

发明概述

本发明提供了对样品（例如细胞或核酸）进行生化反应的系统、设备和方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于对样品进行生化反应的集成系统，其优选地包括：反应模块，所述反应模块包括装置，所述装置包括多个分散的反应体积，所述反应体积包括试剂和样品，其中所述反应体积可用来对所述样品进行一个以上的生化反应；用于分散装置中所述样品的分散模块，其中所述分散模块作用连接至所述装置；包括加热元件和热控制元件的热模块，所述热模块作用连接至所述装置；检测来自分散的反应体积的信号的检测模块；作用以从各个所述多个分散体积中单独地回收一部分或基本上所有的经反应的材料的回收模块，其中所述回收模块作用连接至装置。任选地，所述反应模块或装置被配置成接收油，以减少其他材料从反应体积中蒸发。可使用一种或多种油。所述油可以是非挥发性的，或具有相同或不同的挥发性特质。

在一个方面，所述装置是载片、微孔板或光盘微孔阵列。在其他方面，各个所述反应体积的体积足够小，以增强与大体积反应相比的反应动力学。在其他方面，所述反应体积小于1微升。在另一个方面，所述样品是细胞、核酸、全基因组、粗细胞裂解物、口腔拭子、血浆、血清、全血或尿液。在另一个方面，所述试剂是裂解缓冲液、中和缓冲液或扩增混合物。在另一个方面，所述装置是载片、微孔板或微孔盘。在另一个方面，所述反应体积被容纳在反应室中，所述反应室被配置成接收所述试剂和所述样品。在其它方面，所述试剂足以进行聚合酶链反应（PCR）或等温扩增。在其它实施方案中，所述系统还包括用于对所述经反应的材料进行测序的测序仪。在其它方面，所述回收模块包括针工具、移液管、载片或吸收性材料，在另一个方面，所述热模块还包括第二加热元件。

在其它方面，本发明进一步提供了用于分析样品的方法，所述方法优选地包括：将所述样品和试剂分散成多个分散的反应体积中；对所述分散的反应体积进行生化反应；检测来自所述分散的反应体积的信号；以及从所述分散的反应体积回收至少一部分或基本上全部的经反应的材料。在一个方面，所述方法进一步包括扩增所述分散的反应体积中的所述样品。在其他方面，所述方法进一步包括对所述经反应的材料进行测序。在其他方面，所述方法进一步包括对所述经反应的材料实施阵列比较基因组杂交技术（a-CGH）。在其他方面，所述方法进一步包括对所述经反应的材料进行基因分型。在另一个方面，所述方法进一步包括测量所述经反应的材料中的基因表达。任选地，一种或多种油，无论是挥发性或非挥发性的，可被提供给反应体积以减少蒸发。

在本发明的又一个方面，提供了用于接收装置的设备，该设备包括：基面和顶面以及包括用于接纳所述装置的至少一个开口的侧壁；一对隔开的导轨，用于使得所述装置接触所述基底并防止所述装置和所述顶面之间的接触；所述设备被配置成进一步接收流体。在一个方面，所述设备进一步包括密封装置，以将所述载片密封到所述装置中。在另一个方面，所述液体是油。在其它方面，所述油是矿物油、硅油或氟代烃油。在又一个方面，所述装置是载片。

附图概述

图1显示了本发明的集成系统的一个实施方案。

图2显示了本发明的集成系统的一个实施方案的框图。

图3A显示了对本发明所述的系统、设备和方法有用的装置的一个实施方案。

图3B显示了本发明的装置上的多个反应体积的图示。

图4A-B显示了对本发明所述的系统、设备和方法有用的装置的一个实施方案。

图5显示了对本发明所述的系统、设备和方法有用的装置的一个实施方案。

图6A显示了用以容纳载片的本发明的设备的一个实施方案。

图6B显示了容纳载片的本发明的设备的一个实施方案。

图7显示了用以容纳多孔板的本发明的设备的一个实施方案。

图8示例说明了在平面表面上的反应体积的接触角。

图9显示了本发明的挥发性油策略的一个实施方案。

图10A-B显示了本发明的分配模块的一个实施方案。

图11显示了本发明的回收模块的一个实施方案。

图12显示了本发明的回收模块的一个实施方案。

图13A-B显示了本发明的回收模块的一个实施方案。

图14显示了本发明的双面热模块的一个实施方案。

图15A-B提供的数据显示了本发明的实施方案的系统和方法对含有核酸的样品实施基因分析是有用的。

图16提供的数据显示了本发明的实施方案的系统和方法对细胞实施系列生化反应是有用的。

图17提供的数据显示了本发明的实施方案的系统和方法对细胞实施系列生化反应和后续基因组分析是有用的。

图18提供了本发明的回收模块的一个实施方案的回收结果。

发明详述

在描述本发明的系统、设备和方法前，应该理解，本发明并不限定于所述的特定的方法、方案、测定法和试剂，因为这些是可以变化的。还应理解，本文所使用的术语是为了描述本发明的特定实施方案，并且决不旨在限制如所附权利要求中阐述了的本发明的范围。

必须注意，如本文和所附权利要求中使用的单数形式的“一”，“一个”和“该”，包括复数引用，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及“一种遗传条件”可能包含多个这样的条件；提及“胎儿的遗传变异”可能是指一个或多个胎儿的遗传变异，等等。

除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。虽然类似或者等同于本文所描述的任何方法和材料能够用于本发明的实践或测试中，但是现在所描述的是优选的方法、系统和材料。本文引用的所有出版物的整体内容均通过引用合并入本文，用于描述和公开出版物中报告的、本发明可能用到的方法、试剂和工具。本文的任何内容不应解释为以任何方式限制公开内容。

集成系统

本发明提供了对样品（例如细胞或游离核酸）进行生化分析的集成系统、设备和方法。分析样品以获取遗传信息，并且样品优选地仍可用于后续分析或测试。所提供的方法和系统对以高通量方式对生物样品进行定量和高并行的生化反应是有用的。在一些实施方案中，本文更全面地描述了一种或多种油，无论是非挥发性油或挥发性油，或多油的组合，提供了生化反应后方便获取样品的油策略。如图1显示，本发明的集成系统包括被配置成接收多个分散的反应体积，并且提供对所述反应体积的获取的装置，该装置作用联接至多种模块，包括，例如，样品获取模块、温度模块和读出模块。在本发明的系统和方法中有用的样品获取模块提供了用于将样品分散、分离、等分至装置和/或向或从装置回收样品。对本发明的系统和方法有用的温度控制模块提供了等温或热循环条件，用于对包括样品和试剂的分散的反应体积实施生化反应。对本发明的系统和方法有用的读出模块提供了检测来自所述分散的反应体积的光、电或化学信号。

图2显示了本发明的集成系统的一个实施方案。该系统包括：用于含有核酸的样品10和进行一个或多个生化反应的试剂。包括分散器的分散模块20，用于将样品和试剂分散至装置30之中或之上。包括平面表面或孔阵列的装置30，其被配置成接收多个小体积反应体积，例如纳升反应体积。所述装置30被配置成可拆卸地且作用连接至所述分散模块20、热模块40、检测模块50和/或回收模块60。包括能够提供恒温控制或循环温度控制的加热和冷却元件的热模块40，为生化反应提供了便利条件。包括能够检测来自分散的反应体积的光、电或化学信号的探测器的检测模块50。包括回收设备的回收模块60，用于回收经由生化反应产生的材料。

分散模块

本发明包括方法和装置的用途，用于将部分样品分散至装置30之上或之中，以形成多个分散的反应体积，使得生化反应例如PCR扩增可以在所述分散的反应体积上实施。用于分散样品和任何检测试剂至装置之上或之中的方法和装置不是本发明的关键，并且本领域技术人员能够理解，许多方法和装置可被用于产生这样的分散的反应体积以及分散这样的样品和试剂。因此，本发明并非旨在限定用于产生分散的反应体积或者在装置上或装置中进行生化反应的特定的方法和装置。

所述分散模块20包括若干市售试剂分散器、压电分散器、电磁阀分散器等中的任何一个。本领域技术人员能认识到，存在其它类型的分散器和阀动设备，并且可以被有效地应用。可在本发明中使用的分散器的实例包括，例如，气刷分散器、压电分散器、流体脉冲分散器、热致动分散器等等。本发明所述系统中所使用的合适的分散器在美国专利申请公开号2010/0273680和美国专利号6,576,295中有所描述，上述两个申请的整体内容都通过引用合并入本文。

在某些实施方案中，容积式注射泵通过水力作用联接至所述分散器。可选地，所述泵可以是用于计量液体的精确量的若干种市售的泵送装置中的任何一个。但是，也可以使用各种各样的其它直流流体源。这些可以包括，但不限于，旋转泵、蠕动泵、壁球板泵等等，或电子调节的流体流源。

在某些方面，样品和/或试剂被分散成约1nL至约500nL的体积。应用本文所述的分散模块20生成的分散的反应体积由分散的样品和/或试剂组成，其体积可小至1nL、5nL、10nL、25nL或50nL。通常情况下，反应体积的变动范围是约1nL到约250nL，虽然特定的反应体积的变动范围是约10nL到约250nL，更特定的反应体积的变动范围是约50nL到约250nL。这种小的反应体积允许多个分散的反应体积被应用到单个的装置30，例如，显微镜载玻片，以便在装置30上/中被形成约1-5、5-10、10-100、500-1000或更多的分散样品，包括控制和测试样品的混合物。小样品体积也显著降低了生化反应所必需的测试试剂的量，从而进一步降低了进行生化反应的总成本，同时又增强了生化反应的结果的保真度，因为测试和控制样品能在相同的条件下进行处理。相比现有技术的大体积反应的体积，本发明的优选的反应体积要小1:20至1:100,000倍。此外，由于容纳在本发明的所述装置中/上的反应体积保持可利用状态，可通过后续分散另外的样品或试剂进行多个生化反应。

普通技术人员可商购到几种合适的注射泵，例如，Biodot CV1000注射泵分散器，可从Biodot，Inc（Irvine，Calif.）购买，其包括电子控制式步进电机，应用各种注射器尺寸而提供精确的液体处理。这种注射器泵具有从3,000到24,000步骤，尽管具有从48,000-768,000步骤的更高的分辨率泵可被用于本发明的集成系统。更高分辨率的泵，例如，如果需要的话，压电泵也可以用来提供更精细的分辨率。多个注射泵可以以并联的方式应用，例如，向分散器输送不同浓度的试剂和/或其他液体，或按本发明的设想进行生化反应时，在两种或更多种试剂间交替分散操作。

针工具可被用于本发明的系统中分散样品和试剂。针工具是指，能够无需施加压力而从流体源得到等分试样，便能将基本上所有或一部分流体从流体源转移至流体目的地的装置。图10A和10B显示了对本发明的所述方法和系统有用的示例性针工具。例如，液体的等分试样通常粘附在针上，使得针能够将等分试样转移到目的地，例如多孔板的孔或者塑料或玻璃载玻片的表面。在特定实施方案中，液体输送由包含多个针的针工具来实现。通常情况下，针工具的针对应于多孔容器的孔比如标准的微升板的印记，使得针能穿过孔以使流体体积沉积在孔中，或从孔中抽出流体体积，两者几乎同时发生。更具体地说，针头工具能够有，例如，6、12、24、48、96、192、384、768、1536、3456、9600或更多的针。针工具能够准确地传输在2和200nL范围之间的样品和/或试剂至本发明所述方法和系统中使用的装置。（参见，例如，Cleveland et al.(2005)Assay Drug Dev Technol.3:213-25.）针涂覆有亲水性材料，以影响流体传输量。相应地，任何技术人员已知的针工具可以在本发明所述的系统和方法中使用。

装置

在本发明所述的方法和系统中所使用的装置被配置为接收多个分散的反应体积。在一些实施方案中，分散的反应体积在装置中/上时保持可用。例如，在微孔板中对多个分散的反应体积进行生化反应后，分散的反应体积保持可用于回收，或用于通过添加试剂进行其他的生化反应。

用于本发明所述方法和系统的装置包括平面表面，例如，玻璃或塑料（例如聚合物）的载片。图3A和3B显示了，用于本发明所述的方法和系统的示例性的装置。在一些实施方案中，所述系统中使用的所述装置是包括玻璃或聚合物材料的平面表面。在一个方面，玻璃是钠钙玻璃、硼硅酸盐玻璃、铝硅酸盐玻璃、铅玻璃、96％的石英玻璃、熔融石英玻璃或石英。在其它方面，该聚合物是PMMA、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯、聚乙烯、高密度聚乙烯、COC或COP。

如图3B所示，纳升样品能够被分散到载片的表面上，以形成多个分散的体积反应。例如，一个20×40阵列的反应体积（即800个反应体积）能够被分散到在平面表面上用于后续测试。因此，分散到载片表面上的分散的体积反应的数量可以是约10至5000个体积反应、约500至5000个体积反应、约800至5000个体积反应或约1000至5000个体积反应。在某些实施方案中，分散到载片表面上的分散的体积反应的数量可以是800、1152或4608。在一些实施方案中，分散到载片表面上的分散的体积反应为约1-500nL、约5-100nL、约5-50nL、约5-30nL或约5-10nL。在具体实施方案中，分散到载片表面上的分散的体积反应为约30nL的。在一些实施方案中，寡核苷酸（例如，引物）被冷冻在平面表面上，之后添加多个分散的反应体积。

在一些实施方案中，载片表面是均匀的，在其它实施方案中，对载片表面进行预处理或涂覆有疏水或亲水材料。在一个方面，所述疏水材料是PDMS。在其它方面，所述亲水材料是经过后续氧气或空气等离子体处理的、利用掩模进行等离子处理的（即，选择性的处理或构图）或硅烷化的PDMS。样品和试剂被分散到平面表面（例如，载片表面）之后，施加油或其它任何合适的封装介质以隔离排列在平面表面上的分散的反应体积（例如，参见图3B）。

反应体积和平面表面之间的接触角和润湿性被选择用于阻止分散的反应体积在载片上的活动（参见，例如，图8）。接触角是反应体积界面与平面表面的接触的角度。润湿性是反应体积与平面表面保持接触的性能。一般而言，接触角小于90°（低接触角）通常表示该表面的润湿性是十分理想的，且反应体积将大面积地分散于平面表面。接触角大于90°（高接触角）通常表示该表面的润湿性是不理想的，因此液体将最大限度地减少与该表面接触，且形成紧凑的液体微滴，在某些实施方案中，利用平面表面使得反应体积的接触角小于90°。

在某些实施方案中，在本发明所述系统和方法中使用的装置是微孔板，例如，纳米孔阵列板。图4显示了在本发明所述方法和系统中有用的示例性装置。如图4所示，每个纳米孔具有用于容纳样品（例如，核酸或细胞）和生化反应必需的试剂的纳升体积。在一些实施方案中，纳米孔阵列板是32×32纳米孔阵列板。在其它实施方案中，孔的大小为70μm×70μm平方，深60μm。该纳米孔利用各种材料微加工制成，包括但不限于，玻璃、石英、塑料，例如，聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）等，以及其它可浇注或可行的聚合物（例如聚二甲基硅氧烷，PDMS或SU8）。样品和试剂被装入单个纳米孔，之后施加油或其它任何合适的封装介质，用于将分散的反应体积隔离在每个孔中。

在其他实施方案中，本发明所述系统和方法中使用的装置是光盘（CD）微孔阵列。图5显示了CD微孔阵列的示例性实施方案。

在某些方面，本发明提供了用于接收本发明所述方法和系统中使用的装置的设备。图6A显示了接收载片的示例性设备（即套筒）。该设备包括基面和顶面210以及用于接收所述载片的包含至少一个开口220的侧壁。该设备进一步包括一对隔开的导轨200，用于使得所述载片接触所述基底并防止所述载片和所述顶面之间的接触。该设备被配置为接收流体，例如，油。图6B显示了已被引入到设备的载片和用于将所述载片密封进所述设备的盖子230。例如，含有多个分散的反应体积的载片被引入图6B所示的设备，引入载片之前或之后，设备被充满与反应体积不混溶的流体例如油。

图7显示了用于接收在本发明所述的方法和系统中使用的多孔板的设备（即袋）。如所示，袋300含有多孔板340。袋300能由相对薄壁的膜或材料加工而成。袋300包括包含金属、塑料、聚合物、以及它们的组合等的一个或更多的壁。在一些实施方案中，袋70包含聚合物。袋300能被配置为容纳所需液体体积，例如，从100uL至10mL、从1mL至5mL、或更多。袋300的壁，例如，厚度小于约1.0mm、小于0.9mm、小于0.7mm或小于0.5mm，以增强热传递。袋300有入口310，通过该入口多孔板或类似的装置可以被引入。袋300能通过加热或胶进行密封。在一些实施方案中，用于接收多孔板的设备或袋是柔性塑料袋。

在生化反应中，例如，在PCR热循环反应中，袋300能被布置并且与定位在第一侧320的第一加热和冷却单元相接触，并且包含热转移表面的第二加热和冷却单元与袋300的侧面330接触。在一些实施方案中，加热和冷却单元各自包括珀耳帖单元。

热模块

图14显示了一个对本发明所述系统和方法有用的双面热模块的实施方案。双面热模块包括两个或更多加热元件或区块，其接触或辐射能量至本发明的设备或装置的相对侧。与那些用于传统的单块热循环仪类似的基于珀尔帖的加热区块被配置为在双面热循环应用中使用。如本文所述的使用双面加热和冷却方法所进行的热循环，能提供与仅加热和冷却设备或装置的一侧相比更有效的热传导。单面热传导单元，如通过将设备或装置放置在具有平区块的常规PCR热循环仪上的那些,能导致较慢的热传导，以及多个反应体积的热均匀性。在各种实施方案中，热模块可作用连接至本发明的设备。在一个方面，该设备是包含多孔板或含有载片的套筒的塑料袋。在一些实施方案中，扩增器或热循环仪的内部尺寸被配置为使得本发明的套筒或袋与加热和冷却板基本均匀和完全接触。

任何能支持所需的生化反应的有效温度可在本发明的等温生化反应中被采用。因此，等温反应可以在任何基本恒定和有效的温度下进行，包括在约20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃等等。

在其它实施方案中，本发明的热模块提供了热循环条件。例如，在实施生化反应的实施方案中，例如通过PCR扩增DNA，对温度进行循环以产生合适的温度用于所需的PCR循环数量。上述内容可以通过使用热区块或珀耳帖装置的标准热循环仪实现，或可以通过替代技术实现，例如烘箱、热风和冷风、具有良好的热传导流过加热的液体、在不同温度下的器械组件间传送该装置或本领域中已知的任何其他合适的加热元件。

检测模块

在一些实施方案中，本发明所述系统和方法包括检测模块，检测模块包括一个或多个光、电或化学检测器。在某些实施方案中，光检测器是扫描检测器或可选地是固定检测器。在其它实施方案中，光检测器是光电倍增管、CCD照相机、光电二极管或光电二极管阵列。在一些方面中，所述检测器测量来自分散的体积的反应荧光信号的强度。

回收模块

在一些实施方案中，回收模块用于回收一部分或基本上全部的单个反应体积用于后续分析和/或进一步的生化反应。一种或多种生化反应之后的材料回收可利用任何本文所述的分散装置来实现。从分散的反应体积中回收的材料可任选地用于后续的分析或其他的生化反应。在一些实施方式中，毛细作用可用于回收本发明所述系统和方法中的液体。例如，毛细管可与目标体积反应相接触。当毛细管接触到体积反应，目标体积反应不需要主动控制便通过毛细作用被回收，例如真空装置。亲水性的材料，如PMMA或玻璃能被用来增强毛细作用。在这个方面，该管是透明的，从而被回收材料的体积能被量化，在其它实施方案中，被回收的反应体积通过例如用移液管或注射器对管施加压力，被分散到二级装置用于后续分析或生化反应。

在其他实施方案中，上述针工具用于回收一种或多种生化反应后的材料（例如，参见图10A-B）。例如，使针与单个的反应体积接触，使等分试样或基本上全部的反应体积中的流体附着在针上，使得头能将流体转移到另一个孔里或表面上。针工具能精确地从本发明所述地方法和系统中使用的装置回收2至200nL的样品和/或试剂。

在其他实施方案中，吸收性的（例如多孔的）材料被用于本发明所述的系统和方法中以回收一种或多种生化反应后的材料。图11显示了吸收性材料与本发明所述的装置的平面表面上的分散的反应体积相接触。普通技术人员已知的任意多孔亲水材料可用于回收部分或基本上全部的单个反应体积。

在其它实施方案中，回收或分离多个反应体积是通过将有多个反应体积的第一载片与第二载片相接触来实现的。如图12所示，多个分散的反应体积被分散到第一平面表面上。接着，将第二平面表面与第一平面表面上的分散的反应体积相接触。第二平面表面被移除，分散的反应体积的原始含量被分成两部分。在一些实施方案中，额外的样品和/或试剂被分离后分散到各个反应体积。

在其他实施方案中，上述分散器被用于本发明所述的系统和方法，以回收一种或多种生化反应后的材料。

方法

本发明提供了用于分析样品的方法，该方法包括：将所述样品和试剂分散至多个分散的反应体积中；对上述分散的反应体积实施生化反应；检测来自所述分散的反应体积的信号；并且从所述分散的反应体积回收一部分或基本上全部的经反应的材料。在一些实施方案中，分散的反应体积仍然可以用于后续的分析或测试。在其它实施方案中，分散的反应体积是非密封的。

本发明进一步提供了用于对样品或分散的反应体积实施系列或多重生化反应的方法。如下述实施例2所示，使多个分散的反应体积进行第一全基因组扩增反应和第二全基因组扩增。在一些实施方案中，本发明提供了用于从装置或向装置分离、等分或回收样品的方法。例如，如上所述的针工具可用于回收生化反应后的一部分或基本上全部的反应体积。

在一些实施方案中，分散的反应体积通过将疏水性的封装介质应用到分散的反应体积上进行封装。在一些方面，油是挥发性油。挥发性油在本发明所述的系统和方法中的应用使得反应体积能进行进一步分析或引入额外的试剂。例如，可以控制挥发油覆盖的蒸发，以允许向反应体积添加多重试剂或回收生化反应后的反应体积。在一些方面，不同分子量的油被用于提供各种蒸气压力，或不同的蒸发率。例如，0.65cSt硅油的蒸发速度大于5cSt硅油。因此，0.65cSt硅油可用于在短时间内的低温孵育或高温孵育。由于生化反应需要较长的高温孵育时间，在高温下使用5cSt硅油或高分子量的硅油可（而不是具有较高的蒸气压的0.65cSt硅油）。孵育后的5cSt硅油或其它高分子量油能通过引入0.65cSt硅油被移除。通过暴露于空气的蒸发随后移除0.65cSt硅油，使反应体积得以利用，并且可以分散额外的试剂或回收反应体积。本方法部分所描述的使用一种或多种油状物的方法和技术也适用于本申请中所述的系统和设备。

本发明提供了对多个反应体积实施生化反应的方法。在一些实施方案中，本发明进一步提供了用于对所述反应体积进行测序的方法。例如，一种或多种生化反应后，在微反应器中对单个反应体积进行测序。Sims等描述了在微反应器中进行荧光DNA测序的技术。（Sims et al.(2011）Nature Methods8:575-80.）在其它实施方案中，本发明进一步提供了在所述分散的反应体积中扩增所述样品的方法。在其它实施方案中，本发明提供了对所述经反应的材料实施阵列比较基因组杂交（a-CGH）。在其它实施方案中，本发明提供了对所述经反应的材料进行基因分型的方法。在一些实施方案中，本发明进一步提供了测量所述经反应的材料中的基因表达的方法。

本文所描述的系统和方法能用在各种各样的应用中，在一些实施方案中，本发明所述的系统和方法用于检测胎儿基因组中发现的等位基因。目前已知的产前诊断方法通常涉及如羊膜穿刺术、移除绒毛和移除胎儿血液或组织活检等微创技术。已描述了就胎儿细胞，基于富集母体血液样品并分析该样品中的细胞群以鉴定胎儿细胞的非侵入性的方法（参见国际公开号WO2008/048931和WO2010/075459）。美国专利号6,258,540公开了对母体血液样品实施产前诊断的方法，该方法包括获取血液样品的非细胞部分，从非细胞部分扩增父系遗传核酸并对扩增核酸实施核酸分析以检测父系遗传胎儿核酸。本文描述的方法，在特定实施方案中，可用于对生物样品例如母体血液或血浆中的的胎儿基因组DNA进行生化分析。

本发明的系统和方法可以与本领域中已知的方法相结合用于确定胎儿的基因变体。例如，Oliphant的国际公开号WO2010/075459，其整体内容通过引用合并入本文，公开了对母体样品进行基因分型，获取母体和胎儿细胞的混合物，以及就胎儿细胞对样品进行浓缩并被分成子样品的方法。选择其至少一个目标基因座是纯合的母体样品的实验组，用于筛选子样品或对子样品进行基因分型。每个子样品被单个筛选或对至少一个这些基因座进行基因分型，在子样品中检测指示非母体等位基因的存在的杂合基因型。可选地，选择其至少一个目标靶基因座是杂合的母体样品的实验组，用以筛选子样品或对子样品进行基因分型。每个子样品被单个筛选或对至少一个这些基因座进行基因分型，在子样品中检测指示非母体等位基因的存在的纯合基因型。本文所描述的用于生化分析的系统和方法特别适合用于Oliphant描述的那种和其他方法，并提供了在母体样品中检测和分析胎儿DNA的方法，特别是通过扩增和检测胎儿基因组材料的方法。

实施例1：核酸样品基因组分析

就罕见的等位基因（例如，胎儿等位基因）的存在，对生物样品进行分析。20微升产妇和胎儿的DNA(0.5ng/μL)的混合物用35μL2XGenotyping Master Mix(Part No.4371353,Life Technologies,Carlsbad,CA)，1.75μL TaqMan SNP基因分型预混合物(40X,dbSNP:rs4144457)和13.25μL DEPC H2O进行混合。所得体积由分散器（Biodot,Irvine,CA）分散到20X40阵列中的COP载片上（Zeon Chemicals,Louisville,KY），形成30nL的800个分散的反应体积。分散后，载片被插入到含有1mL的FC40油（3M,St.Paul,MN）的本发明的塑料套筒。塑料帽用以将载片封闭在套筒内。油密封防止了反应体积蒸发和交叉污染。套筒内的导轨防止了分散的反应体积与套筒的顶面相接触。套筒随后被插入到热循环仪，进行以下加热周期；2分钟50℃的1个循环，10分钟95℃的1个循环和15秒95℃和1分钟60℃的46个循环。热循环后，将载片从套筒移除，暴露在空气中将油蒸发，并放置在成像模块内，以检测来自容纳在载片表面上的分散的反应体积的荧光信号（VIC和FAM）。

图15A-B显示了结果。图15A显示了对于罕见的等位基因是阳性的反应体积。图15B显示了对主要等位基因是阳性的反应体积。FAM/VIC阳性率为7.9％。这些结果表明，本发明实施方案中的系统和方法用于对含有核酸的样品实施基因分析是有用的。结果还表明，本发明实施方案中的系统和方法用于对生物样品以高通量方式实施定量和高并行的生化反应是有用的。

实施例2：对细胞进行系列生化反应以及后续的基因组分析

将新鲜的人细胞（9802个细胞）悬浮于PBS（0.1cell/nL），并将其以10nL的等分试样分散到32×32的多孔板的各个孔中，使用分散器(Biodot,Irvine,CA)平均地将单个细胞递送到板上的各个孔中，以形成分散的反应体积。接着，将2.0nL的裂解缓冲液(200mM KOH和83mM DTT)分散到每个孔中。将板插入到含有5.0cSt硅油的本发明所述的袋中，从而将反应体积封闭在各个孔中。油密封防止了反应体积蒸发和交叉污染。该袋是热封的，对反应体积在65℃下进行第一生化反应（例如，细胞裂解）10分钟。孵育后，将该板从袋中取出，并引入到含有0.65cSt硅油的袋中，轻轻搅拌5分钟以稀释该板上的5cSt硅油。将板从第二袋中取出，将0.65cSt硅油放置在板上蒸发，暴露每个孔中的反应体积。接着，将20nL的中和缓冲液(900mM Tris和200mM HCl)分散到每个孔中，随后将150nL含有phi29聚合酶、随机引物、25mM dNTPs和盐混合物的WGA反应混合物分散进去。分散之后，该板被引入至含有0.65cSt硅油的袋，该袋是热封的，反应体积在30℃下进行第二生化反应（全基因组扩增，WGA）4小时，随后在65℃下反应10分钟，以灭活phi29聚合酶（参见图16）。

关于基因组分析，WGA之后对反应体积进行PCR。简言之，将该板从袋中取出并暴露于空气中以除去0.65硅油。将32x32的针阵列引入到32×32孔板上，取出，并浸入到第二个32×32孔板中，该第二孔板预充有150nL的包含用于SRY基因（Y染色体）与X2基因（X染色体）的引物和探针的的二倍PCR母混合物。对平行的板重复转移过程来验证全基因组扩增反应。将两个PCR板的反应体积用5cSt油覆盖进行封装，并在95℃下孵育10分钟，随后在95℃下行15秒和在60℃下60秒的50次热循环。进行PCR之后，拍摄板的FAM和VIC荧光图像，根据FAM和VIC的双阳性信号（参见图17）确定9802个细胞的位置。利用毛细管为基础的回收模块（参见图18）收集样品，用于进一步的基因组分析。

结果表明，本发明的实施方案中的系统和方法用于对细胞实施生化反应和后续的基因组序列分析。结果还表明，在本发明的实施方案中的系统和方法用于对生物样品以高通量方式实施定量和高并行的生化反应是有用的。

根据本文所公开的内容，本发明的这些和其它实施方案将会容易被普通技术人员所理解。本发明不限于示例的实施方案的范围，实施方案只意于说明本发明的单一方面内容。任何在功能上等同的设备或方法都包括在本发明的范围内。根据上述描述和附图，本文所未描述的各种修改在本领域技术人员看来是明显的。这些修改将在所附权利要求范围中展现。

本文引用的所有参考文献整体且为了所有目的通过引用合并入本文。下述被包括的实施例仅作说明用途并非用于限制本发明的范围。

Claims (22)

1.一种对样品进行生化反应的集成系统，其包括：

（ａ）反应模块，所述反应模块包括：包括多个分散的反应体积的装置，所述反应体积包括试剂和样品，其中所述反应体积可用于对所述样品进行一次以上的生化反应；

（ｂ）用于分散所述装置中的所述样品的分散模块，其中所述分散模块作用联接至所述装置；

（ｃ）包括加热元件和热控制元件的热模块，其中所述热模块作用联接至所述装置;

（ｄ）检测来自分散的反应体积的信号的检测模块；

（ｅ）作用以从各个所述多个分散的反应体积单独回收至少一部分或基本上全部的经反应的材料的回收模块，其中所述回收模块作用联接至该装置。

2.根据权利要求1的系统，其中所述装置是载片、微孔板或光盘微孔阵列。

3.根据权利要求1的系统，其中各个所述反应体积的体积足够小，以增强与大体积反应相比的反应动力学。

4.根据权利要求1的系统，其中所述反应体积小于1微升。

5.根据权利要求1的系统，其中所述样品是细胞、核酸、全基因组、粗细胞裂解物、口腔拭子、血浆、血清、全血或尿。

6.根据权利要求1的系统，其中所述试剂是裂解缓冲液、中和缓冲液或扩增混合物。

7.根据权利要求1的系统，其中所述反应体积中被容纳在反应室中，所述反应室被配置为接收所述试剂和所述样品。

8.根据权利要求1的系统，其中所述试剂足以进行聚合酶链式反应或等温扩增。

9.根据权利要求1的系统，其中所述系统进一步包括用于对所述经反应的材料进行测序的测序仪

10.根据权利要求1的系统，其中所述回收模块包括针工具、移液管、载片或吸收性材料。

11.根据权利要求1的系统，其中所述加热元件是双加热元件。

12.一种用于分析样品的方法，所述方法包括：

（a）将所述样品和试剂分散至多个分散的反应体积中；

（b）对所述分散的反应体积实施生化反应；

（c）检测来自所述分散的反应体积的信号；以及

（d）从所述分散的反应体积回收至少一部分或基本上全部的经反应的材料。

13.根据权利要求12的方法，其进一步包括扩增所述分散的反应体积中的所述样品。

14.根据权利要求12的方法，其进一步包括对所述经反应的材料实施测序。

15.根据权利要求12的方法，其进一步包括对所述经反应的材料进行阵列比较基因组杂交（a-CGH）。

16.根据权利要求12的方法，其进一步包括对所述经反应的材料进行基因分型。

17.根据权利要求12的方法，其进一步包括测量所述经反应的材料中的基因表达。

18.一种用于接收装置的设备，该设备包括：基面和顶面以及包括用于接纳所述装置的至少一个开口的侧壁；一对隔开的导轨，用于使得所述装置接触所述基底并防止所述装置和所述顶面之间的接触；所述设备被配置成接收液体。

19.根据权利要求18的设备，所述设备进一步包括密封结构以将所述载片密封到所述装置中。

20.根据权利要求18的设备，其中所述液体是油。

21.根据权利要求18的设备，其中所述装置是载片。

22.根据权利要求20的设备，其中所述油是矿物油、硅油或氟代烃油。