CN103940983A - 在不使用对照细胞的情况下测量细胞活力的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种通过检测一个或更多个细胞死亡稳定蛋白质或酶活性来测量所培养细胞活力的方法。本发明所提供的方法使活力与细胞培养物含细胞与不含细胞比率中酶活性的相对水平相关。

Description

在不使用对照细胞的情况下测量细胞活力的方法
本专利申请是国际申请日为2008年11月6日、国家申请号为200880115903.7、发明名称为“在不使用对照细胞的情况下测量细胞活力的方法”的专利申请的分案申请。
本申请要求2007年11月9日提交的美国专利申请60/986,751号的优先权，其全部内容通过引用包含于此。
技术领域
本发明涉及如下领域：细胞生物学以及细胞培养和组织工程。更具体而言，本发明涉及通过检测蛋白质或酶活性来测量所培养细胞的活力的方法。
背景技术
组织工程（见Langer和Vacanti，Science，260:920-926（1993））领域关注于对基质或支架的使用以支持细胞的生长和维持。例如，基质诱导自体软骨细胞移植（移植）是用来修复软骨的第二代自体软骨细胞移植（ACI）方法。在移植中，将培养扩增的软骨细胞接种到胶原基膜基质上，此后便于外科移植。移植可以用于通过关节镜检查或者通过微创手术来治疗软骨缺损。
组织工程化产品中对基质的使用对试图测量工程化产品组成细胞活力的研究者提出重大挑战。现有的测量细胞活力的方法有赖于活细胞两个特征中的至少一个特征：呈现出完整质膜和/或其代谢活性。在体外，细胞的死亡伴随着失去质膜的完整性。使用活体染料在显微镜下可以容易地观测到这种现象。在最常用的活体染料化验中，将染料台盼蓝添加到细胞的悬浮液中。染料无法进入膜完整的活细胞，但使膜破损的死亡或正在死亡的细胞着色。可替选地，可以通过测量细胞代谢活性的一个或更多个标记来评定细胞活力。一个这样的方法是：对在活细胞中存在但在死亡细胞中枯竭或不存在的主要代谢物（例如，ATP、NADH）进行量化。补充方法是：对从膜受损细胞释放出的特定酶活性进行化验。例如，Cytox-Fluor细胞毒性化验（Promega，麦迪逊市，威斯康星州，Cat.No.G9260）使用内部淬灭荧光肽底物双-(丙氨酰-丙氨酰-苯丙氨酰)-罗丹明-110(bis-(Ala-Ala-Phe)-Rhodamine-110)来检测从死亡细胞释放出的蛋白酶，诸如三肽基肽酶。
在应用于组织工程化产品时，大多数现有细胞活力检验需要在检验之前分离（收回）细胞。然而，分离过程常常是复杂的，有时是苛刻的，从来不是100%有效的。在该过程中，随着活细胞失去或被杀死，或者，随着死亡细胞失去，会出现测量人为因素。例如，在通过台盼蓝拒染法进行评估时，所收回细胞的活力总是接近100%，这未能反映出获得收回细胞的原始样本的真实活力。由于基质干扰、非特异性结合、检测的上限低、范围不够，或者在不同培养基类型中的精度低，在不首先收回细胞的情况下使用基于代谢活性的活力检验的尝试同样是不成功的。此外，现有的基于代谢活性的细胞活力检验都有根本的缺点，即，为了测量测试样本的活力，需要细胞数量和活力已知的阳性和/或阴性对照。为了做出有效的比对，对照和测试样本中使用的细胞必须是来自同一供体或同一株的同样类型的细胞，还必须具有同样的代谢轮廓(metabolic profile)。此方式不能应用于如下这些组织工程产品：其中，接种在3维基质中的细胞常常得到与生长在悬浮液中或2维表面上的同样的细胞非常不一样的代谢概况。另外，在每天的活力和质量控制中检验大量批次的工业生产实践中准备适当的对照以及获得额外的细胞常常是不实际的。
所移植细胞的活力在采用组织工程化产品的成功治疗中仍然是关键的决定因素。鉴于现有活力检验的缺点，需要容易、迅速且准确的方法以测量组织工程化产品中细胞的活力。这种方法需要在大范围细胞密度上、采用许多不同的细胞类型、培养基和基质进行操作。此外，这种细胞活力方法在无需对照细胞群的情况下有利地进行操作。
发明内容
本发明提供了用以在各种情况下并且无需对照细胞而容易、快速、准确地测量细胞活力的方法。这些方法部分地基于这样的发现：所培养组织工程化产品中细胞的活力可以通过检测培养物上清液中所呈现培养细胞的一个或更多个酶活性的比率来确定。
为了本发明的目的，所理论化但不局限于的方面是，在伴随细胞死亡而失去膜完整性时，在细胞培养上清液中由质膜正常限制的细胞的内含物变得可检测。本发明的方法有赖于对细胞死亡稳定蛋白质或酶（即，可以检测其是呈现在活的还是死亡细胞中的蛋白质或酶）的检测。然后可以通过检测细胞死亡稳定蛋白质或酶在不含细胞的条件培养基（例如，上清液、或者支持基质或支架）中与在含有细胞的条件培养基（例如，膜完整的细胞以及相关联的条件培养基）中的相对量来确定培养物的细胞活力。仅在含有细胞的条件培养基的细胞中的细胞死亡稳定蛋白质或酶的量可以通过这样的方式确定：破坏膜完整细胞的膜完整性（例如，部分或完全裂解）、测量含有细胞部分（即，破损细胞以及相关联的条件培养基）中总的酶活性，并且然后减去由相关联的条件培养基贡献的任何酶活性。通过对无细胞条件培养基进行检验来测量所减去的值。
本发明的一个方面提供了用于通过这样的方式测量培养基中维持的细胞群中活细胞的比率的方法：检测条件培养基的不含细胞的部分（例如，条件培养基）中的细胞死亡稳定蛋白质或酶活性，检测培养基的含有细胞的部分（例如，细胞和条件培养基）中的细胞死亡稳定蛋白质或酶活性，并且将两个部分中的细胞死亡稳定蛋白质或酶活性的水平相比较。通过该方法，群中活细胞的比率与含有细胞的部分中细胞死亡稳定蛋白质或酶活性的水平与不含细胞部分的细胞死亡稳定蛋白质或酶活性的水平之间的差成比例。
在一些实施例中，所检验的细胞可以生长在传统的二维细胞培养底物（例如，玻璃或组织培养塑料）上。在其它实施例中，在三维支架或基质上或者三维支架或基质中支持细胞，即，细胞是组织工程化产品的一部分。在某些实施例中，细胞生长在猪胶原蛋白衍生基质上。
在某些实施例中，本发明的方法还包括步骤：提供细胞群以及成比例量的不含细胞的培养条件培养基的样本部分。然后，样本部分被分成含细胞（即，细胞加条件培养基）和不含细胞（仅条件培养基）组成部分并根据本发明方法进行处理。
在某些实施例中，通过例如剪切、声波降解法、低气压、高温、低温、化学或酶裂解、或者膜解耦剂破坏样本部分细胞的膜完整性。在一些实施例中，可以通过添加两亲分子破坏膜完整性。在某些实施例中，两亲分子是皂素。
本发明其它方面提供了用于测量组织工程化产品的基质中所呈现活人类软骨细胞（在培养基中维持，具有1.5×104个细胞/cm2和6×106个细胞/cm2之间的细胞密度）的比率的方法。该步骤包括：提供含有细胞以及成比例量的培养条件培养基的组织工程化产品部分；提供培养条件培养基的不含组织工程化产品细胞的部分；将皂素以及双-(丙氨酰-丙氨酰-苯丙氨酰)-若丹明-110(bis-(Ala-Ala-Phe)-Rhodamine-110)添加到这些部分中；并且检测两个部分中来自附着（cleave）的bis-(Ala-Ala-Phe)-Rhodamine-110的荧光信号。在一些实施例中，可以在这些方法中用具有缀合离去基团的另一底物或者丙氨酰-丙氨酰-苯丙氨酰(Ala-Ala-Phe-AMC)代替bis-(Ala-Ala-Phe)-Rhodamine-110。组织工程化产品中活细胞的比率与含有细胞与不含细胞部分之间荧光信号强度的差除以两个部分中荧光信号的总量的结果成比例。
在另一个方面，本发明提供了确定测试治疗（例如，采用药理或生物化合物的治疗；或者暴露于各种条件（例如，渗透压、pH、温度、或者气压）下；或者光、电或机械治疗；或者这些的组合）对于所培养细胞测试群的细胞毒性的方法。该方法需要：将测试治疗应用于测试群，通过本发明的方法测量试验群中活细胞的比率，并将测量到的试验群的活力与所培养细胞的未治疗群（“对照群”）的活力相比较。
可以在各种条件下采用各种细胞来使用本发明的方法。在一些实施例中，细胞可以是哺乳动物的（例如，人类的、灵长类的、绵羊的、牛的、猪的、马的、猫的、犬科的或啮齿类的）。在某些实施例中，细胞是人类的。衍生自任何来源组织的细胞均可以用于本发明的方法中。在特定实施例中，细胞是软骨细胞。
本发明的方法可以用于密度范围广泛的细胞。在一些实施例中，细胞以1.5×104个细胞/cm2与6×106个细胞/cm2之间的密度呈现。在其它实施例中，细胞可以以2.2×104个细胞/cm2与2.8×106个细胞/cm2之间、3.5×104个细胞/cm2与2.8×106个细胞/cm2之间、或者5×104个细胞/cm2与1×106个细胞/cm2之间的密度呈现。在某些实施例中，细胞可以以至少2.0×105、5.0×105、1.0×106、2.0×106、2.8×106、3×106、4×106、5×106、6×106、8×106、10×106个细胞/cm2、或者更高密度呈现。
在本发明的一些实施例中，通过这样的方式来测量细胞死亡稳定酶活性：将样本部分与细胞死亡稳定酶活性的底物相接触，其中，底物缀合到可检测离去基团；然后检测该离去基团。通过该方法，所检测离去基团的量与样本部分中所呈现细胞死亡稳定酶活性的水平成比例。在各种实施例中，离去基团可以是显色的、发光的或者荧光的。在特定实施例中，离去基团是荧光的。在某些实施例中，离去基团是罗丹明110。在其它实施例中，离去基团是香豆素衍生物，例如，7氨基4甲基香豆素（AMC）。
用于酶活性的底物可以是可以由酶处理的任何分子。在某些实施例中，底物是三肽。在一些实施例中，底物是bis-(Ala-Ala-Phe)-Rhodamine-110。在其它实施例中，底物是Ala-Ala-Phe-AMC。
在一些实施例中，本发明的方法可以还包括步骤：添加对离去基团的信号进行调制（例如，增强/增大或者衰减/降低）的制剂。在一些实施例中，制剂可以将信号调制至少5%、10%、15%、20%、40%、60%或80%；或者大于1、2、3、5、10、50或100倍（fold）。在某些实施例中，对离去基团的信号进行调制的制剂通过使离去基团的信号衰减来进行工作。在特定实施例中，使离去基团的信号衰减的制剂是酚红。在一些实施例中，酚红可以以达到10、20、40、60、70、100、150、200mg/L或者更高的浓度呈现。
在本发明的各种实施例中，所检测的细胞死亡稳定酶活性可以是例如合成代谢的或分解代谢的、氧化还原酶、转染酶、水解酶、裂解酶、激酶、磷酸酸、异构酶或者连接酶。在一些实施例中，细胞死亡稳定酶活性可以是蛋白水解的，例如，一个或更多个三肽基肽酶、糜蛋白酶或者类糜蛋白酶（诸如，钙蛋白酶）。
在一些实施例中，细胞死亡稳定蛋白质或酶活性是这样的蛋白质或酶活性：在坏死性或程序性细胞死亡（或者二者均有）后是稳定的（以及优选地，在二者之一形式的细胞死亡后是稳定的）。在其它实施例中，细胞死亡稳定蛋白质或酶活性是坏死性稳定蛋白质或酶活性。在另外一些实施例中，细胞死亡稳定蛋白质或酶活性是程序性细胞死亡稳定蛋白质或酶活性。
在一些实施例中，本发明的方法可以包括质量控制检验。在这种实施例中，本发明的方法可以还包括步骤：检测含有细胞或不含细胞部分（或者二者均有）中污染物特定酶活性。检测污染物特定酶活性表明了培养污染物。
结合在本说明书中并形成本说明书一部分的附图示例了本发明的若干实施例，连同描述一起进一步用以解释本发明的原理。
附图说明
图1是细胞活力检验的示意性说明。
图2A是这样的实验的图形化表示：证明了样本的细胞和上清液中呈现的酶活性与细胞群的密度线性相关。
图2B是这样的实验的图形化表示：证明了样本的上清液中呈现的酶活性与细胞群的密度线性相关。
图3是这样的实验的图形化表示：证明了所公开的检验准确地预测了活力。
图4是这样的实验的图形化表示：证明了添加酚红不影响所公开检验的准确性。
图5是这样的实验的图形化表示：证明了使用替选基质不影响所公开检验的准确性。
图6是这样的实验的图形化表示：证明了没有基质不影响所公开检验的准确性。
图7是这样的实验的图形化表示：证明了使用非人类细胞不影响所公开检验的准确性。
图8是这样的实验的图形化表示：证明了所公开的检验可以使用具有并非罗丹明的离去基团的底物。
定义
单数形式的“一”、“一个”、“该”包括复数引用，除非上下文明确规定了例外的情况。
除非规定了例外的情况，用语“约”表示±10%。
本文中所使用的“表面积”，例如，方形面积，cm2，是指底物的宏观表面积，即，表面到二维平面上的Z轴投影。
本文中所使用的“密度”意思是每单位面积或体积中一些物质（例如，细胞或其它对象）的平均数量。在本申请中最常出现的是，密度将会出现在细胞密度（每单位表面积中细胞的数量）的上下文中。通过将所植细胞的数量除以其生长表面的宏观表面积来估量此平均数目。此定义预见到二维表面、以及三维结构或点阵。
本文中所使用的用语“培养基”是指在培养物中支持细胞生长或维持的所有成分。这可以包括传统的流体细胞培养基以及所述培养基会含有的任何额外因子。这些因子可以包括例如血清、抗生素、生长因子、药理剂、缓冲剂、pH指示剂等。培养基不应一般地指其上或其中维持了或生长了细胞的任何基质或支持物，除非明确规定了例外的情况。相应地，在组织工程化产品中，基质通常是含有细胞部分的一部分。
相应地，“细胞培养基的不含细胞的部分”包括培养基的流体部分，并且不包括任何含有细胞的基质。类似地，“细胞培养基的含有细胞的部分”包括与培养基相关联的、所分离的细胞或者基质相关联的细胞。
“条件培养基”意思是这种培养基：与细胞相接触以允许修改培养基的成分，即，通过摄取或释放一个或更多个代谢物、营养素、或者基因(factor)（例如，一个或更多个细胞死亡稳定蛋白质或酶活性）。除非规定了例外的情况，条件培养基通常意思是这种培养基：与细胞群相接触，用以从膜完整性受损的细胞采集细胞死亡稳定蛋白质或酶活性。
如本申请中所使用的，“可检测的离去基团”是指可以用来监测酶促反应进度的酶促反应产物。
“蛋白质组”意思是一组细胞中所表达的所有蛋白的集合。
“重组细胞”在本文中是指非原生生物分子，例如，核酸、其转录或翻译产物、或者含有以上任何内容的细胞。
酶的“内在活性”意思是其Vmax；即，在仅酶的制备底物的能力有限时的产物产出率；否则针对酶活性优化反应条件。
本申请中所使用的“完整膜”意思是用以在标准实验室条件下阻止染料台盼蓝的能力。
“比例因子”意思是对于特定检验条件所确定的数值常数。
“相对大小”在本申请中是指将数目表示成参考值的函数；例如，将一个值表示成另一个值的分数。
“绝对大小”在本申请中意思是一些数目的实际数值，即，不是相对大小。
具体实施方式
本发明提供了基于样本两部分中细胞死亡稳定蛋白质或酶活性的相对大小来计算活力的方法。与活体染料检验不同，不需要从基质中回收细胞。相应地，本发明的方法可以排除与现有方法相关联的测量人为因素，例如，在过程中失去细胞、低估或高估了活力。
确定细胞活力
本发明提供了测量培养基所维持的群中活细胞比率的方法。这是通过这种方式完成的：将不含细胞的条件培养基部分中细胞死亡稳定酶活性的量与含有细胞的条件培养基部分中细胞死亡稳定蛋白质或酶的量相比较。通常，本发明的方法包括三个步骤：
（1）将样本分成两部分，含有细胞的部分（“X”）和不含细胞的部分（“Y”）；
（2）将含有细胞部分的细胞（或者取自含有细胞部分的样本）裂解（lyse）；以及
（3）检测或测量每个部分（“X”和“Y”）中细胞死亡稳定蛋白质或酶的量。技术人员可以以各种方式将这些测量结果转换为细胞群中活细胞的比率。
在一个示例中，首先将条件培养基均等地分成两个部分（即，两半），含有细胞的部分（“X”）和不含细胞的部分（“Y”）。如图1中所示以及如示例1中所描述的，当含有细胞的部分（“Y”）具有样本的条件培养基的一半并且其余一半是在不含细胞的部分（“X”）中时，则比率活力（fractional viability）只是差值除以活性的和，即：
此表达式的分子是膜完整的细胞中呈现的酶活性（含有细胞部分中的量，即，细胞和条件培养基，小于只有条件培养基的情况下呈现的量），而分母是样本中所呈现酶活性的总量。如果样本的含有细胞和不含细胞部分中所呈现测量到的酶活性为500和50，则比率活力为：
500 - 50 500 + 50 = 450 550 ≈ 0.82
当然，在本发明方法的第一个步骤中，不需要在含有细胞的与不含细胞的部分之间均分样本中的条件培养基。在两个部分之间未均分样本中全部条件培养基比率的情况下，则比率活力给出如下：
X - cY X + Y
其中， c = 1 - f f .
在第一个表达式中，c是比例因子，用于相对于所检验含有细胞部分中条件培养基的体积来调整所检验无细胞部分中条件培养基的体积。此比例因子是Y部分（不含细胞的样本部分）中所呈现全部样本条件培养基的非零十进制分数f的函数。在示例性的示例中，将组织工程化产品的样本分成：
（1）X部分，含有细胞以及样本条件培养基的25%；以及
（2）Y部分，不含细胞，含有样本条件培养基的75%。
此处，c为：
1 - . 75 . 75 = . 25 . 75 = 1 3
如果对于X和Y测量到的酶活性为400和30，则
以上讨论包括使用本发明所提供的方法来计算活力的详细手段。这可以是在所生长的仅用于检验或者用于估算一些较大群活力的培养物的上下文中。例如，在对于组织工程化产品的“批次释放”检验中，通过取产品的样本（即，活组织检查）、以及加置的条件培养基中的一些来确定产品组成细胞的活力。以其最简单的形式，加置于(overlying)产品的全部条件培养基的百分比以及产品被活组织检查的总表面积或体积（以及因此的细胞）的百分比是一样的。例如，如果活组织检查包括产品细胞的约2%，则样本中还应当呈现加置于产品的条件培养基体积的约2%。取样可以通过这样的方式完成：使用技术人员所能预见到的任意数量的步骤，取细胞连同条件培养基一起、或者按顺序（按两者之一的次序）、或者两项技术的一些组合（例如，取细胞和一些条件培养基，然后移除另外的条件培养基）。以上公式隐含假定了样本中百分比细胞对百分比体积的该1:1的比值。
技术人员将会明白的是，1:1的细胞对体积取样比值可以变化，以及，特定的细胞类型、产品、或者培养条件是可以修改为（或者，甚至需要）样本中细胞和条件培养基的变换的比值。如对于技术人员将会是明显的，应当根据所使用取样策略的不同采用对以上所呈现计算的特定修改。例如，样本中百分比条件培养基体积对百分比细胞的比值偏离1，则样本的活力可以给出如下：
其中，α＝样本中全部细胞百分比对总的条件培养基体积百分比的比值。因此，如果样本包括全部细胞的2%以及条件培养基总体积的4%（即，全部细胞百分比与条件培养基百分比的比值小于1），并且“X”和“Y”样本部分中的活性分别为1000和200，则：
可替选地，样本中百分比细胞对百分比条件培养基的比值可以大于1。因此，如果样本包括全部细胞的5%以及全部条件培养基的1%，并且“X”和“Y”样本部分中的活性分别为820和20，则：
值得注意的是，在这些示例中，仅需要在以上已呈现公式的分母中进行校正。该修正后的公式假定在所检验的“X”与“Y”部分之间均分样本中所呈现条件培养基的总体积。在未均分条件培养基时，对于在样本的“X”与“Y”部分之间未均分条件培养基的情况，可以将该同样的分母校正应用于已提供的公式。
本发明所提供的用于确定细胞活力的方法消除了对于对照细胞的需要。对照细胞用来标定针对特定培养基、基质或者细胞类型的基于酶的检验。这部分地因为现有检验做出了蛋白质或酶活性的绝对大小。蛋白质或酶活性的绝对大小会受到如下因素的影响：例如，血清、添加剂、维生素、酚红或基质/底物存在或者不存在。另外，蛋白质或酶活性的绝对大小会受到如下因素的影响：内在的供体对供体、株对株、以及细胞传代对传代的变化性。
另外，现有方法即使在应用（诸如，组织工程）中密度低的一端也常常饱和。本发明所提供的方法对于在高细胞密度应用（诸如，组织工程）中测量活力是有用的。
细胞死亡稳定蛋白质和酶活性、检验条件以及细胞破损
细胞死亡稳定蛋白质和酶活性是这样的活性：在由于各种机制（例如，程序性细胞死亡（需要能量的过程）或者坏死（不需要能量的过程））而出现的细胞死亡过程中保持在可检测的水平的活性。因为各种细胞死亡过程以不同的程度影响不同的蛋白质，所以细胞死亡稳定蛋白质可以是程序性细胞死亡稳定的、坏死性稳定的、或者二者均有。对于细胞死亡的概述，参见例如Guimaraes和Linden，Eur.J.Biochem.，271:1638-1650（2004）以及Hengartner，Nature，407:770-6（2000）。
在一些实施例中，相对于未经历细胞死亡过程的细胞，在具有经历了细胞死亡过程的细胞中，细胞死亡稳定蛋白质和酶活性的相对浓度不受影响，或改变不大于5%、10%、15%、20%、40%、60%或80%，或者不大于1、2或3倍。在某些实施例中，细胞死亡稳定蛋白质和酶活性的半衰期可以为约30、60、90或120分钟；约2、3、4、5、6、8、10或12小时；或者达到约1、2、3、4天、或者更长时间。
技术人员将会明白的是：可以通过各种手段来识别适合于本发明的蛋白质或酶活性。例如，相对于未经历细胞死亡过程的细胞的基因表达简档(gene expression profile)，对经历了细胞死亡过程的细胞的基因表达简档的分析可以用来识别蛋白质产物为细胞死亡稳定蛋白质或者酶活性的基因。这种基因相对于未经历细胞死亡过程的细胞，在经历了细胞死亡过程的细胞中可以有差异地表达为不大于5%、10%、15%、20%、40%、60%或80%，或者不大于1、2或3倍。技术人员将会认识到的是：需要在不同细胞死亡过程中针对酶活性或蛋白产物的稳定性进一步对以此方式识别出的基因进行评估。
应当由细胞的外围（例如，在质膜上或质膜内、在细胞质中、或者在膜结合细胞器内）约束细胞死亡稳定蛋白质和酶活性。目标分子不应当是分泌蛋白质（secreted protein），因为无法容易地确定这种蛋白质或酶活性的起源（即，来自活细胞或非活细胞）。如果被约束在质膜内，则细胞死亡稳定蛋白质或酶活性在失去膜完整性后应该变得可检验。
细胞群中细胞的膜完整性会由于技术人员已知的各种手段而破损。这种手段应当保留所有或大多数细胞死亡稳定蛋白质或酶活性。例如，通过剪切、声波降解法、真空、高温、低温（例如，冷冻）、化学或酶裂解、或者膜解耦剂会破坏细胞膜完整性。可以通过采用两亲分子（诸如，脂肪酸盐（soap）、去污剂、或者某些苷（例如，皂素））进行孵化（incubation）来实现化学裂解。可以调整化学裂解剂的量以实现期望的效果。例如，可以以0.01%与2%（W/V）之间（例如，0.05%与0.5%之间）的最终浓度来使用皂素。
细胞死亡稳定蛋白质或酶活性可以是细胞群蛋白质组天然出现的成分，或者，非天然出现的成分，例如，所表达的重组蛋白质或酶活性。这种重组分子可以通过本领域中已知的常规方法引入，并可以被稳定地或瞬时地表达，即，整合到基因组中、或者基于质粒。参见例如JosephSambrook和David Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual ColdSpring Harbor Laboratory Press；第3版（2001）。
将会理解的是：可以有多于一个酶负责细胞死亡稳定酶活性。例如，底物可以由一组相关酶共享。在一些实施例中，可以通过至少1、2、3、4、5、10、20或更多个不同的酶来催化酶活性。
检测方法
可以通过本领域已知的传统技术（例如，蛋白免疫印迹（Westernblot）、ELISA、质谱学、色谱法或者免疫化学）来检测细胞死亡稳定蛋白质。可替选地，可以通过特性化的细胞死亡稳定酶活性来检测细胞死亡稳定蛋白质。即，可以通过其功能（例如，它所催化的反应）间接地检测蛋白质。通过将酶分散到细胞外、底物进入到细胞中或者二者均有，破损的膜完整性允许检测之前对于细胞外环境中的分子无法接触到的酶活性。
技术人员将会认识到的是：可以对离去基团和底物的组合进行筛选以用于本发明的方法，而无需知晓负责对离去基团的释放进行催化的酶。例如，测试样本可以根据本发明的方法采用候选底物进行孵化以及根据已知数目的活细胞和非活细胞（见例如示例1）做出。然后，检测离去基团并相对于活细胞与非活细胞的已知比绘制其密集度。有用的底物将会是这些底物：以活细胞与非活细胞的已知比例承载线性相关性。通过以此方式对底物进行测试，无需知晓细胞死亡稳定酶活性的来源。
酶底物/离去基团缀合物是本领域中公知的。这种化合物的有用属性是可检测离去基团的内部淬灭。即，离去基团在缀合到酶底物时一点也不能（或者仅仅很少地能够）检测，但是，在从底物分离后迅速变得可检测，例如，按照酶底物的酶处理。可以用于本发明方法中的离去基团的类别包括但不限于：显色分子、荧光分子以及发光分子。
用于检测酶活性的显色分子是本领域中公知的。四唑盐和甲臜（formazan）是用来检测酶活性的首选底物中的一些（Altman，Prog.Histochem.Cytochem.，9:1-56（1976））。在例如美国专利7,026,111号的第11栏中可以找到另外的比色法化合物。
发光分子（诸如，鲁米诺和异鲁米诺）可以缀合到酶底物并直接用于本发明的方法中（见例如美国专利4,748,116号）。可替选地，在表达出虫荧光素酶的系统中可以采用缀合到虫荧光素的底物（见例如美国专利7,148,030号）。
本发明的方法可以采用荧光离去基团，例如，吨染料、荧光素、罗丹明、基于香豆素的分子、以及其衍生物。可用的荧光分子是本领域中公知的。（对于荧光离去基团的示例，参见例如美国专利4,557,862号；4,640,893号；4,694,070号；4,801,534号；5,352,803号；6,130,101号；6,248,904号；6,342,611号；6,458,966号；6,750,357号；6,759,207号；其中的RE38,723，特别是表II，以及，2002年5月6日提交的美国专利申请10/138,375号（以美国专利公开2003/0208037号公开）和2003年7月18日提交的10/621,311号（以美国专利公开2005/0014160号公开））。
可以通过任何适合的手段（例如，视觉观测、分光光度计、光度计、或者荧光计）来检测离去基团所产生的信号。在样本中呈现两个或更多个可区分离去基团的应用中，可以同时或按顺序检测它们。
在本发明的方法中有用的底物离去基团缀合物将会具有缀合到细胞死亡稳定酶底物的离去基团，例如，糖类、油脂、蛋白质、缩氨酸、核酸、激素或者维生素基团；或者，一个或更多个这些底物的组合。这些基团可以是天然出现的（例如，生化纯化的）或者合成的（例如，化学合成的或者重组产生的）。另外，这些底物可以不含、含有一些、或者含有所有非原生成分（例如，非天然氨基酸、封闭或保护基团等）。酶/底物对的扩展种类是本领域中已知的（对于这种酶/底物对的示例，参见例如美国专利4,167,449号（特别是表II）、5,871,946号（特别是表I）、以及7,026,111号（特别是13－18栏））。另外，如美国专利6,680,178号中所公开的，底物库可以生成并被筛选以识别有用的肽底物以用于本发明的方法中。在一些实施例中，可以使用噬菌体显示技术来说明酶活性的底物偏好，例如，如Felber等人，Biol.Chem.386:291-98（2005）中所公开的。
其它在本发明方法中有用的分子包括：在对于蛋白酶活性的检验中有用的荧光染料罗丹明到肽基团的缀合物（Leytus等人，Biochem.J.，209:299-307（1983）），例如，Grant等人，J.of Biomol.Screen，7:531-540（2002）和Hug等人，Biochemistry，38:13906-11（1999）。可以将这些试剂整合到多重检验中，例如，如2004年1月22日提交的美国专利申请10/762,836号（2005年7月28日以美国专利公开2005/0164321号公开）中所公开的。
蛋白酶在维持跨门类细胞和机体动态平衡中的核心作用是标记肽底物作为蛋白酶活性标记流行的一个原因（见例如美国专利6,037,137号和6,984,718号，其提供用于检测原位和整个细胞中蛋白酶活性的试剂和方法）。
内在酶活性在不同的酶之间以及对于特定酶的不同底物广泛变化。影响酶活性的内在因素包括：培养基的条件（例如，pH、温度、渗透压等）、酶的表达水平或翻译后调整、以及底物浓度。专业人员需要适当地调整底物浓度。对于给定的酶以及培养基条件，合适的底物浓度会处于例如0.01ng/ml至100mg/ml、或者10μg/ml至10mg/ml的范围内。在一些情形中，0.001mM与10mM之间的底物浓度会是适当的。可替选地，底物浓度可以在0.01mM与0.5mM之间。类似地，允许发展出可检测信号的孵化时间将会依据这些同样参数而广泛变化。相应地，孵化时间的范围可以从30秒或更短直到1、2、3、5、10、20、30、45、60、75或90分钟；或者甚至2、4、6、10或12小时、或者更长时间。
本发明方法中用于检测蛋白水解活性的一个有用底物是bis-(Ala-Ala-Phe)-Rhodamine-110（Promega，Cat.No.G9260）。本发明方法中另外的有用底物是Ala-Ala-Phe-AMC（Bachem Cat No.1-1415.0050）。所理论化但不局限于的方面是：Ala-Ala-Phe三肽是用于溶酶体外三肽基肽酶II酶（TPP II；Balow等人，J.Biol.Chem.，261:2409-2417（1986））以及溶酶体三肽基肽酶I酶（TPP I；Vines和Warburton，Biochim.Biophys.Acta.，1384:233-242（1998）以及Steinfeld等人，J.Histochem.Cytochem.，54:991-996（2006））的底物。值得注意的是，Ala-Ala-Phe是用于功能上与三肽基肽酶类似的细菌枯草杆菌（Stambolieva等人，Arch.Biochem.Biophys.，294:703-6（1992））的普通具体底物。在例如Tian等人，J.Biol.Chem，281:6559-72（2006）（对底物的大库进行筛选）以及美国专利6,824,998号（公开了对于组织学应用有用的底物（具有沉淀的离去基团））中可以找到TPP I另外的底物。
已知Ala-Ala-Phe还是用于糜蛋白酶的底物。用于糜蛋白酶和相关酶（如，钙蛋白酶）的其它底物是本领域中已知的——对于这些酶的结构/功能相关性也是如此。在例如Sharma等人，Biol.Chem.（2008；8月8日的电子刊物；PubMed Id（PMID）18690777号），Croall和ErsfeldGenome Biol.8:218（2007）；Czapinska和Otlewski Euro.J.Biochem260:571-95（1999）；Perona和Craik J.Biol.Chem.272:29987-90（1997）中对这些内容进行了进一步的讨论。
细胞培养基以及基质
本发明提供了可以用来测量从众多宿主生物体（例如，哺乳动物，包括人）以及从众多来源组织衍生出的培养的细胞活力的方法。所检验的细胞可以衍生自处于各种发育阶段的组织。细胞可以衍生自成体、胚儿或者胚胎来源。细胞可以是从起源于三个原始生殖层（即，外胚层、中胚层或内胚层）的器官衍生出的全能干细胞或多能干细胞。例如，细胞可以得自皮肤、心脏、骨骼肌、平滑肌、肾脏、肝脏、肺、骨、胰腺、中枢神经组织、周围神经组织、循环组织、淋巴组织、肠、脾脏、甲状腺、结缔组织（例如，软骨细胞）或者性腺。细胞可以是非扩增原代细胞、培养扩增原代细胞或者建立的细胞系。另外，细胞可以在例如，有或没有血清的（例如，化学定义的培养基）以及有或没有酚红的各种培养基中生长。
本发明提供了用以在大范围细胞密度上测量细胞活力的方法。例如，细胞可以以2.2×104个细胞/cm2与2.8×106个细胞/cm2之间、3.5×104与2.8×106之间、或者5×104与1×106个细胞/cm2之间的密度呈现。细胞还可以以至少2.0×105、5.0×105、1.0×106、2.0×106、2.8×106、3×106、4×106、5×106、6×106、8×106、10×106个细胞/cm2、或者更高密度呈现。已经采用达到约3×106个细胞/cm2的细胞密度实践了本发明所提供的方法。可以预见到的是，这些方法可以采用达到106个细胞/cm2、或者更高的细胞密度进行工作。应当理解的是，本公开通篇所引用的所有细胞密度用术语“平均”限定。技术人员将会毫无疑义地明白的是：细胞密度的局部波动将会出现并且是本发明所提供的方法中可以预见到的。
在培养基中孵化细胞以允许培养基中细胞死亡稳定蛋白质或酶活性的聚集，即，以产生条件培养基。本发明所提供的方法在细胞与培养基相接触的时间量上测量活力，即，在紧邻检验之前通常不能用新鲜培养基代替条件培养基。取决于特定应用（例如，细胞类型、细胞密度、培养基类型、或细胞死亡稳定蛋白质或酶活性的半衰期），可以将细胞孵化可变的时间量。可以在检验之前将细胞孵化约1、5、10、30、60、90、120、150、180、210或240分钟；或者约3、4、5、6、8、10、12、18或24小时；或者达到约1、2、3、4、5天、或者更长时间。
本发明的方法对于测量各种底物或基质上所生长活细胞的比率是有用的。细胞可以生长在传统的二维细胞培养底物（例如，采用塑料处理过的表面或者玻璃）上。可替选地，可以用支架或基质（例如，其中，细胞是组织工程化产品的一部分）支持细胞。合适的支架可以包括由金属、塑料、玻璃、硅、陶瓷和/或磷酸钙构建的结构。其它的合适支架材料包括可吸收聚酯（例如，乳酸或乙交酯的聚合物、以及其衍生物或共聚物）；糖类（例如，玻酸、几丁质、淀粉、或者海藻酸钠）；以及蛋白质（例如，胶原蛋白（例如，猪胶原蛋白衍生基质）或者明胶）、或者这些基质中任何基质的组合。在例如Langer和Vacanti（1993）；Ikada，J.R.Soc.Interfac，3:589-601（2006）；以及美国专利6,689,608号和6,800,296号中可以找到对组织工程中所使用基质的进一步讨论。
检验变化
申请人发现了酚红可以进一步扩展本发明方法可检验细胞密度的范围。这是通过衰减离去基团的信号实现的。即，酚红减小例如罗丹明110（R110）的信号，检验在较高细胞密度处饱和。理论化但不取决于的是：除去蛋白质的酚红能够有此作用，因为其吸收光谱与罗丹明110的激发和发射光谱这二者显著重叠。
除了用于R110的酚红之外，还可以预见到适用于其它离去基团的衰减剂的使用。用于特定离去基团激发和或发射谱的适当衰减剂将会在其吸收谱中具有期望的重叠程度。吸收、激发以及发射谱是本领域中已知的或者可以按经验的方式（例如，通过荧光）容易地确定。
此外，本发明所提供的方法是模块化的以及可修改为复用的。即，另外的过程、步骤、和/或制剂可以进一步扩展检验的效用。例如，本发明所提供的方法可以进一步包括对多于一个细胞死亡稳定蛋白质或酶活性的检测。这是通过使用例如正交底物和/或离去基团在样本部分中对于两个或更多个细胞死亡稳定酶活性应用多个酶特定的底物实现的。这种“检测混合物”含有耦联到一个或更多个可检测离去基团的、用于细胞死亡稳定酶活性的一个或更多个种类的底物。这些复用方法可以分成两大类：单个种类的离去基团、以及多个种类的离去基团。
单个种类的离去基团与多个种类的酶底物耦联的检测混合物将会产生整合信号。即，所得信号是所检测酶活性的和。例如，可以通过独特的酶活性来处理每个底物。通过对多个酶活性进行检验和求和，整合信号更准确反映了样本的整体代谢状态。在期望较短孵化时间的情况下整合信号也可以是有用的。
本发明方法中对多个种类离去基团的使用提供了对活力的独立测量。含有用于耦联到多个种类离去基团的酶活性的单个种类底物的检测混合物提供了对活力的并行测量。不同的信号为使用例如在不同波长和或强度可以具有机器或检测仪相关灵敏度的检测设备的研究者提供了附加的灵活性。
对多个底物种类（每个种类耦联到不同种类的离去基团）的使用提供了对活力的完全独立测量。底物可以例如属于低、中或高相对活性的酶。相对活性可以按照至少10%、20%、40%或80%、或者按照至少1、2、5、10、50、100、500或1000倍、或者更多从低到高变化。通过进行对活力的多个独立测量，研究者更有可能用至少一个底物种类保持在线性检测范围中。
使用多个离去基团的进一步的应用是质量控制检验。特别地，本发明的方法还可以包括添加一个或更多个污染物特定底物，每个底物耦联到同样种类的离去基团，并检测一个或更多个污染物特定的酶的活性。污染物特定的底物种类是用于特定于普通细胞培养污染物（诸如，真菌、细菌、古生菌以及原生生物—并且在所培养细胞的蛋白质组中不存在）的酶的底物。相应地，对污染物特定的离去基团的检测表明所培养细胞群的污染。自然地，用于污染物特定的酶活性的离去基团将会是与用来测量所培养细胞活力的离去基团中可区分的。
本发明的方法还可以适用于测量治疗的细胞毒性。治疗可以是环境或生理治疗，例如，热、气压、机械或者光刺激。治疗还可以是化学治疗，例如，渗透压、pH、药理或生物制剂、或者以上的任意组合。本发明的方法还可以包括如下这些步骤：将治疗应用于测试细胞群、通过本发明的方法测量测试细胞群的活力并将该活力与未接受治疗的同样细胞的对照培养组相比较。在某些实施例中，可以将细胞毒性计算为1减去群的比率活力。在这些实施例中，不需要对照群。
示例
示例1：测量组织工程化产品的细胞活力
图1中示出了细胞活力检验的简要示意。此处，“读取#1”是含有细胞和条件培养基的群部分中所呈现细胞死亡稳定或酶活性的量，而“读取#2”是条件培养基的不含培养物细胞的部分中所呈现酶活性的细胞死亡稳定蛋白质的量。
人类关节软骨细胞扩增到单层培养物的第二或第三传代。为了重复移植中使用的培养条件，将软骨细胞以每穿孔大约25,000至600,000个细胞的密度种植三份到膜基质穿孔（直径6mm）粗糙侧的白色不透明96孔板(96well plate)上。Matricel膜基质是具有光滑侧和粗糙侧的猪胶原基膜基质。此种植密度等同于8.75×104至2.1×106个细胞/cm2（相当于每膜基质（20cm2）1.75×106至42×106个细胞）。在将检验应用于全尺寸种植样本时，从每个样本取两个小穿孔（通常直径为6mm）以及成比例量的条件培养基。对于两个直径6mm的穿孔（共同代表20cm2膜的大约2.8%），条件培养基的比例量为加置于20cm2膜的条件培养基总体积的大约2.8%。在原尺度以及小尺度的情形中，将空白的膜基质穿孔以及培养基处理为对照组。
在细胞种植之后三小时，将条件培养基的一半（将会含有死亡（不能存活的）细胞所释放任何蛋白酶总量的一半）转移到空的孔。
接下来，将含有具有皂素（10%w/v的水溶液，Sigma，圣路易斯，密苏里州，Cat.No.S4521）以及酚红（可选的；通过在磷酸盐缓冲液（PBS）中稀释0.5%的酚红（Sigma Cat.No.P0290）所配制的0.1%的溶液）的bis-(Ala-Ala-Phe)-Rhodamine-110底物（双-丙氨酰-丙氨酰-苯丙氨酰-罗丹明110；Promega Cat.No.G9260）的预混液添加到样本中。皂素用来渗透含有细胞和条件培养基部分中的活细胞以使得细胞内的蛋白酶可接触到底物。预混液中各种成分的最终浓度通常为：
●bis-(Ala-Ala-Phe)-Rhodamine-110底物，0.83mM
●皂素1.67%
●酚红0.167mg/mL（可选的）
在孵化之后（45－90分钟），按激励485nm－发射520nm用SoftMaxPro Software、使用Molecular Devices SpectraMax M5Microplate Reader对该板进行读取。然后在Microsoft EXCEL中对数据进行处理。
图2中示出了代表性实验的结果。示出了作为细胞种植密度函数的荧光指示信号强度的散点图（读取#1，具有上清液的活的细胞，图2A；以及读取#2，仅上清液，图2B）。数据点是三个重复的平均值。采用bis-(Ala-Ala-Phe)-Rhodamine-110底物的孵化时间为45、60或者90分钟。信号与细胞密度之间的关系是线性的并且对于进行测试的所有孵化时间有少许变化。在随后的测量中使用60分钟的孵化步骤。
示例2：检验准确性和精度
通过将测量到的培养物活力与活细胞的已知百分比相比较来评估检验的准确性。培养物包括已知数目的活的细胞和死亡细胞的混合物、以指定密度被预混和种植、随后如示例1中被处理。以试验混合物中活细胞百分比函数的形式绘制测量到的活力（图3）。所绘制的数据点是两个重复的平均值。通常，测量到的活力与实际活力之间的差值小于15%。对于低于0.175×106个细胞/cm2的细胞种植密度，较长的孵化时间（至少90分钟）帮助确保检验准确性。
为了测量检验的株间准确性，以7.0×105个细胞/cm2的密度种植来自3个不同株的1:1比例的活的细胞和死亡细胞。虽然在来自不同细胞株的绝对信号等级中会存在显著的内在变化性（表1，第一数据列；%CV＝41.49），但测量到的活力中的变化性基本上较小（表1，第二数据列；%CV＝7.62）。
表1
读取#1信号 测量到的活力
株#1 20724.01 58.27
株#2 10029.55 51.04
株#3 24999.32 51.37
平均值 18584.29 53.56
标准差（SD） 7710.85 4.08
%CV=(100×SD/平均值) 41.49 7.62
示例3：基质、试剂以及化验员变化性对于检验精度的贡献
为了评估不同的化验员以及不同的基质或试剂批次对于测量到的活力精度的作用，来自单个亲体培养物的细胞在膜穿孔上以7.0×105个细胞/cm2的密度被种植并如示例1中被处理。对三个变量进行分析：基质批次、检验批次，以及化验员。每个变量在两个组（每个治疗组具有三个统计重复）中被测试。表2中示出了结果。
这些结果显示了检验对于这些技术变量的改变较不灵敏。
表2
示例4：酚红的作用
在此检验进展过程中，发现：将酚红添加到检验混合物中会以取决于剂量的方式使信号强度衰减，并将检验的线性范围扩展到较高细胞密度。细胞按变化的密度被种植并如示例1中被处理（采用或不采用酚红），图4中示出了三个重复的平均活力。酚红的添加不影响检验的准确性，它只用于通过以取决于剂量的方式抑制信号输出而防止信号等级接近饱和。可以按照需要调整酚红的量。对于低于0.5×106个细胞/cm2膜基质的种植密度通常不需要酚红。
示例5：添加酚红的时机
发现：将酚红添加到检验混合物中的时机是灵活的。为了证明这一点，来自单个株的细胞被声波降解法裂解以释放所有细胞内蛋白酶，并且，在100μl/孔的体积中，在96孔板中以1.0×104个细胞/孔的密度被种植。以根据表3的量和时间添加底物和酚红。表4中以每个治疗三个重复平均信号强度的形式示出了结果。这些结果证明了：在检验过程中在变化时间点添加的浓度变化的酚红在衰减信号的过程中同样地有效。
对酚红的使用在使用如下内容中的二者之一时显著扩大了用以测量活力的新检验的动态范围：高细胞种植密度（通常高于1.4×106个细胞/cm2）、或者各种培养基（包括含有血清或无血清的、以及含有酚红或无酚红的）。
表3
表4
示例6：在替选基质上生长的细胞
为了证明不同基质材料对该方法的作用，以范围从7.1×104至2.3×106个细胞/cm2的密度在Gelfoam（Upjohn Pharmacia，卡拉马祖，密歇根）（非常多孔的明胶海绵）上种植细胞。如示例1中对细胞进行处理。图5中以三个重复平均活力的形式示出了结果。如通过紧邻种植以前通过台盼蓝拒染法所确定的，细胞的活力为91%。这些数据表明：检验可修改为对种植在各种不同基质上的细胞进行分析。
示例7：2D培养物（组织培养塑料）上生长的细胞。
为了证明检验在较传统组织培养环境中的有效性（即，无机、平坦底物上的生长），以范围从2.2×104至2.8×106个细胞/cm2的密度在塑料六孔组织培养板（不采用基质）中直接种植细胞。如示例1中对细胞进行处理。图6中以两个重复平均活力的形式示出了结果。如通过紧邻种植以前通过台盼蓝拒染法所确定的，细胞的活力为96%。这些结果证明了：除了各种基质上生长的细胞之外，采用传统细胞培养底物上生长的细胞也较好地执行了检验。
示例8：非人类细胞
为了证明检验对非人类细胞的有效性，以范围从0.175至1.4×106个细胞/cm2的密度在膜基质穿孔（直径6mm）上种植来自两个供体的兔软骨细胞。如示例1中对细胞进行处理。图7中以两个重复平均活力的形式示出了结果。如通过紧邻种植以前通过台盼蓝拒染法所确定的，株1和2的活力分别为88.0%和84.9%。这些结果证明了：采用非人类来源的细胞较好地执行了检验。
示例9：替选底物
为了证明使用除bis-(Ala-Ala-Phe)-Rhodamine-110以外底物的方法的有效性，使用以范围8.75×104至1.4×106个细胞/cm2的密度种植的三株人类软骨细胞对替选底物(Ala-Ala-Phe)-AMC（Bachem Cat No.1-1415.0050，托伦斯，加利福尼亚）进行测试。除了用(Ala-Ala-Phe)-AMC代替bis-(Ala-Ala-Phe)-Rhodamine-110并且按激励360nm－发射440nm对样本板进行读取之外，如示例1中对细胞进行处理。在种植以前通过台盼蓝拒染法所确定的株A、B和C的活力分别为98.6%、98.6%和99.2%。图8中以两个重复平均活力的形式示出了结果。这些结果证明了：替选(Ala-Ala-Phe)-AMC底物是有效的（图8）。
对于本文中所引述的所有专利、申请、或者其它参考，应当理解的是，为了所有的目的以及为了所引述的提案，将其整体经引用并入。在经引用并入的文件与本申请之间存在任何冲突的情况下，将以本申请为主。
根据对说明书的研究以及对本文中所公开发明的实践，本发明的其它实施例对于本领域技术人员而言将会是明显的。意在：仅以示范性的形式对说明书和示例进行考虑，本发明的真实范围和实质由所附权利要求而定。

Claims (32)

1.一种测量细胞培养基中维持的细胞群中活细胞的比率的方法，包括：
（a）检测细胞培养条件培养基的不含所述细胞群细胞的部分中的细胞死亡稳定蛋白质或酶活性；
（b）检测所述细胞培养基的含有所述细胞群细胞的部分所述细胞和条件培养基中的细胞死亡稳定蛋白质或酶活性；以及
（c）将所述细胞培养基的含有细胞的所述细胞和条件培养基部分中的细胞死亡稳定蛋白质或酶活性的水平与所述细胞培养条件培养基的不含细胞的部分中细胞死亡稳定蛋白质或酶活性的水平相比较，
其中，细胞群中活细胞的比率与如下因素成正比：所述细胞培养基的含有细胞的部分中细胞死亡稳定蛋白质或酶活性的水平与所述细胞培养条件培养基的不含细胞的部分中细胞死亡稳定蛋白质或酶活性的水平之间的差。
2.一种测量细胞培养基中维持的组织工程化产品中活细胞的比率的方法，包括：
（a）检测细胞培养条件培养基的不含所述组织工程化产品的细胞的部分中的细胞死亡稳定酶活性；
（b）检测所述细胞培养基的含有所述组织工程化产品的细胞的部分的所述细胞和条件培养基中的细胞死亡稳定酶活性；以及
（c）将所述细胞培养基的含有所述组织工程化产品的细胞和条件培养基的部分中细胞死亡稳定酶活性的水平与所述细胞培养条件培养基的不含所述组织工程化产品的细胞的部分中细胞死亡稳定酶活性的水平相比较，
其中，所述组织工程化产品中活细胞的比率与如下因素成正比：所述细胞培养基的含有所述组织工程化产品的细胞和条件培养基的部分中细胞死亡稳定酶活性的水平与所述细胞培养条件培养基的不含所述组织工程化产品的细胞的部分中细胞死亡稳定酶活性的水平之间的差。
3.一种测量细胞培养基中维持的组织工程化产品中活细胞的比率的方法，包括：
（a）提供所述组织工程化产品的含有细胞和成比例量的细胞培养条件培养基的样本部分；
（b）从步骤（a）中提供的样本部分检测细胞培养条件培养基的不含所述组织工程化产品的细胞的部分中的细胞死亡稳定酶活性；
（c）破坏步骤（a）中提供的所述组织工程化产品的样本部分中细胞的膜完整性；
（d）检测步骤（a）中提供的所述组织工程化产品的样本部分的细胞和条件培养基中的细胞死亡稳定酶活性；以及
（e）将步骤（b）和（d）中所检测的细胞死亡稳定酶活性的水平相比较，
其中，所述组织工程化产品中活细胞的比率与（d）和（b）中所检测的细胞死亡稳定酶活性的水平之间的差成正比。
4.如权利要求3所述的方法，其中，通过剪切、声波降解法、低气压、高温、低温、化学或酶裂解或者膜解耦剂来破坏所述组织工程化产品的膜完整性。
5.如权利要求4所述的方法，其中，通过添加两亲分子来破坏所述组织工程化产品的膜完整性。
6.如权利要求5所述的方法，其中，所述两亲分子是皂素。
7.一种测量细胞培养基中维持的组织工程化产品中活细胞的比率的方法，包括：
（a）提供所述组织工程化产品的含有细胞和成比例量的细胞培养条件培养基的部分；
（b）提供步骤a）中提供的所述细胞培养条件培养基的不含所述组织工程化产品的细胞的部分；
（c）将皂素以及双-(丙氨酰-丙氨酰-苯丙氨酰)-罗丹明-110(bis-(Ala-Ala-Phe)-Rhodamine-110)添加到步骤a）和b）中提供的样本中；以及
（d）检测与步骤a）和b）中提供的样本中所附着的bis-(Ala-Ala-Phe)-Rhodamine-110相对应的荧光，
其中，所述细胞是以1.5×104个细胞/cm2与6×106个细胞/cm2之间的密度维持于基质中的人类软骨细胞，所述组织工程化产品中活细胞的比率与d）中所检测荧光的所述差除以所述和成比例。
8.一种测量治疗对于细胞培养基中维持的组织工程化产品中细胞的细胞毒性的方法，包括：
（a）将所述治疗应用于所述组织工程化产品；
（b）检测细胞培养条件培养基的不含所述组织工程化产品的细胞的部分中的细胞死亡稳定酶活性；
（c）检测所述细胞培养基的含有所述组织工程化产品的细胞的部分的所述细胞和条件培养基中的细胞死亡稳定酶活性；以及
（d）将所述细胞培养基的含有所述组织工程化产品的细胞的部分中细胞死亡稳定酶活性的水平与所述细胞培养条件培养基的不含所述组织工程化产品的细胞的部分中细胞死亡稳定酶活性的水平相比较，
其中，所述治疗的细胞毒性与经治疗的组织工程化产品与未经治疗的组织工程化产品中活细胞比率的差成比例，并且其中，所述组织工程化产品中活细胞的比率与所述细胞培养基的含有所述组织工程化产品的细胞的部分中细胞死亡稳定酶活性的水平和所述细胞培养条件培养基的不含所述组织工程化产品的细胞的部分中细胞死亡稳定酶活性的水平之间的差成正比。
9.如权利要求1、2、3或8中任一项所述的方法，其中，所述细胞是哺乳动物的。
10.如权利要求9所述的方法，其中，所述细胞是人类的。
11.如权利要求10所述的方法，其中，所述细胞是软骨细胞。
12.如权利要求9所述的方法，其中，所述细胞生长在基质上。
13.如权利要求9所述的方法，其中，所述细胞以1.5×104个细胞/cm2和6×106个细胞/cm2之间的密度呈现。
14.如权利要求1、2、3、7或8中任一项所述的方法，其中，所述细胞以高密度呈现。
15.如权利要求14所述的方法，其中，所述细胞以2×105个细胞/cm2和6×106个细胞/cm2之间的密度呈现。
16.如权利要求1、2、3、7或8中任一项所述的方法，其中，通过包括下述的步骤来测量细胞死亡稳定酶活性：
（a）将样本与所述细胞死亡稳定酶活性的底物相接触，其中，所述底物缀合到可检测离去基团；以及
（b）对所述离去基团进行检测，
其中，所检测离去基团的量与细胞死亡稳定酶活性的水平成比例。
17.如权利要求16所述的方法，其中，所述离去基团是显色的、发光的或者荧光的。
18.如权利要求17所述的方法，其中，所述离去基团是荧光的。
19.如权利要求18所述的方法，其中，所述离去基团是罗丹明110。
20.如权利要求16所述的方法，其中，所述底物是bis-(Ala-Ala-Phe)-Rhodamine-110。
21.如权利要求18所述的方法，其中，所述离去基团是香豆素衍生物。
22.如权利要求21所述的方法，其中，所述离去基团是AMC。
23.如权利要求22所述的方法，其中，所述底物是丙氨酰-丙氨酰-苯丙氨酸-AMC(Ala-Ala-Phe-AMC)。
24.如权利要求16所述的方法，还包括步骤：添加对可检测离去基团的信号进行调制的制剂。
25.如权利要求24所述的方法，其中，对所述离去基团的信号进行调制的制剂使所述离去基团的信号衰减。
26.如权利要求25所述的方法，其中，所述使所述离去基团的信号衰减的制剂是酚红。
27.如权利要求26所述的方法，其中，所述酚红以达到500mg/L的浓度呈现。
28.如权利要求1、2、3、7或8中任一项所述的方法，其中，所述细胞死亡稳定酶活性是蛋白水解的。
29.如权利要求28所述的方法，其中，所述细胞死亡稳定酶活性包括一个或更多个三肽基肽酶。
30.如权利要求1、2、3、7或8中任一项所述的方法，其中，所述细胞死亡稳定酶活性是坏死性和程序性细胞死亡稳定酶活性。
31.如权利要求30所述的方法，其中，所述细胞死亡稳定酶活性是程序性细胞死亡稳定酶活性。
32.如权利要求30所述的方法，其中，所述细胞死亡稳定酶活性是坏死性稳定酶活性。
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