CN103940784B - 一种检测溶液中mmp9蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测溶液中MMP9蛋白的方法，该方法包括以下步骤：⑴设计MMP9特异性小分子配体；⑵小分子配体的化学合成：①制备KF-CaF2熔融物：②制备对甲基苯磺酰氟；③采用催化剂LDA进行反应得化合物Ⅰ；④HCL气体脱去反应物上Boc基团，得化合物Ⅱ；⑤采用催化剂三乙胺进行反应得化合物Ⅲ；⑥化合物Ⅱ与化合物Ⅲ反应得化合物Ⅳ；⑦化合物Ⅳ与NaOH溶液进行反应得化合物Ⅴ；⑧采用催化剂为O-(四氢-2H-吡喃-2-基)羟基胺、NMM、HOBT和EDC进行反应得化合物Ⅵ；⑨化合物Ⅵ脱去保护基团得MMP9小分子配体；⑶SPR法检测溶液中的MMP9：ⅰ裸金膜芯片的修饰；ⅱ小分子配体的固定；ⅲ非特异性小分子吸附的排除；ⅳ检测溶液中的MMP9蛋白；ⅴMMP9非特异性蛋白吸附的排除。本发明方法灵敏度高。
Description
技术领域
本发明涉及化学医药领域，尤其涉及一种检测溶液中MMP9蛋白的方法。
背景技术
分子对接技术（Moleculardockingtechnology）从分子水平上模拟生物大分子特异性的活性中心与配体小分子之间的相互作用，计算出大分子和小分子之间的结合自由能，用于设计新的能和大分子物质特异性结合的、亲和性强的配体小分子，可节省大量时间，缩短实验过程分子。对接技术是计算机辅助药物设计中常用的一种方法和手段，近年来在药物设计方面取得了很大的成功，分子对接技术的引入成为解决特定蛋白的特异性识别的一种可能。
合成化学是有机化学、无机化学、药物化学、高分子化学、材料化学等学科的基础和核心。合成化学提供了很多药物生产的新途径，合成了磺胺类、抗生素类、维生素类以及口服避孕药等。现在很多镇痛剂、麻醉剂、防腐剂、催眠剂等都是合成出来的。合成化学与生物学、物理学等学科的密切配合，预计将来在征服疾病如癌症、精神病，以及控制遗传，延长人类的寿命等方面会发挥重要作用。
表面等离子体共振(surfaceplasmonresonance,SPR)技术利用全反射时入射光可以和金属表面的等离子发生共振的原理，探测生物分子之间是否发生作用以及反应的动力学参数，是发生在光学介质界面（SPR芯片）上的非常灵敏的光学现象。SPR技术由瑞典科学家Liedberg等于80年代首次运用于IgG抗体与其抗原相互反应的测定。随后，该技术被引入生物传感器领域并迅速渗透到基础生命科学研究中。基于SPR技术的光学生物传感器具有其它相互作用技术所无法比拟的优点：如高灵敏度（无需逐级放大试验，检测灵敏度就可达到pg水平），不需对分子进行标记、能实时检测生物分子结合反应的全过程等，其发展非常迅速，已经成为一种成熟的检测生物分子间相互作用的方法。研究发现SPR较ELISA方法相比有着无需逐级放大反应即可达到相似的检测敏感度（ng/ml），且无需标记，步骤简单的特点，从而达到对所检测微量蛋白质的无需标记、无需逐级放大反应的直接检测。SPR生物传感器目前在生物分子相互作用、药物筛选、食物检测及环境监控等领域广泛应用。
近年来由于分子对接技术在大分子物质的特异性识别优势，在药物靶标设计等方面获得了广泛应用，并取得了良好的成绩；但基于用分子对接原理设计的小分子配体在SPR芯片表面检测特异性蛋白方面的研究上尚未见报道。因此寻找一种新的基于分子对接技术、合成化学和SPR技术相结合的方法对溶液中特异性蛋白进行检测不仅具有创新性，更具有重要的科研价值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种高灵敏度的检测溶液中MMP9蛋白的方法。
为解决上述问题，本发明所述的一种检测溶液中MMP9蛋白的方法，包括以下步骤：
⑴应用分子对接技术设计MMP9的特异性小分子配体，该MMP9的特异性小分子配体的化学结构式如下：
；
⑵小分子配体的化学合成：
①制备氟化钾-氟化钙（KF-CaF2）熔融物：
将二水氟化钾和氟化钙按物质的量之比为1：1.5~2.5混合，搅拌均匀后研磨1~2h，得到粉末状混合物，该粉末状混合物在140~160℃下真空干燥5~8h，即得氟化钾-氟化钙（KF-CaF2）熔融物；
②在干燥乙腈中依次加入对甲基苯磺酰氯、所述氟化钾-氟化钙熔融物，常温下搅拌8~12h，反应结束后用沙芯漏斗覆盖2~3cm厚的硅藻土进行过滤，得到滤液，该滤液经30~40℃减压蒸馏，得到白色固体对甲基苯磺酰氟；所述对甲基苯磺酰氯与所述干燥乙腈的质量体积比为5g：30~40mL；所述对甲基苯磺酰氯与所述氟化钾-氟化钙熔融物的质量比为5g：6~8g；
③在无水无氧条件下，在10~12mL四氢呋喃（THF）中加入1.5~2.5mol/L二异丙基氨基锂（LDA）10~11mL，并在-78℃搅拌5~10分钟，然后缓慢滴入溶于20~25mL干燥THF的4.5~5mLN-Boc-4-哌啶甲酸乙酯，搅拌30min后，缓慢滴入溶于20~25mLTHF的所述对甲基苯磺酰氟3.4~3.5g，混合液搅拌8~15min后移至常温搅拌16~20h；反应结束后用饱和氯化铵溶液淬灭，得到pH值为8~9的反应溶液，该反应溶液在常温常压条件下用乙酸乙酯萃取，得到有机层；所述有机层依次经饱和氯化钠溶液洗涤、无水硫酸钠干燥，经过滤后在30℃~40℃条件下旋干有机溶剂得黄色油状固体的粗产物；该黄色油状固体的粗产物用石油醚-丙酮进行柱层色谱纯化，经TLC检测、紫外显色，得到淡黄色固体产物，即化合物Ⅰ；
④将2mmol的所述化合物Ⅰ溶于25~30mL乙酸乙酯中，得到反应液，该反应液置于冰浴中，开启搅拌，通入HCL气体至反应物上的Boc基团全部脱去，然后在30℃~40℃条件下旋干有机溶剂，得到白色泡沫状固体产物，即化合物Ⅱ；
⑤取1g3-溴丙胺氢溴酸盐溶于30~40mL二氯甲烷溶液，开启搅拌，再依次加入0.9~1g二碳酸二叔丁酯、滴加1.9~2.5mL三乙胺，搅拌过夜后，加入2~3mol/L的盐酸溶液15~20mL，分层后得到有机层；所述有机层依次用2~3mol/L的盐酸溶液洗涤、饱和氯化钠洗涤、无水硫酸钠干燥，经过滤后在30~40℃下旋干有机溶剂，得到白色固体粗产物A；该白色固体粗产物A用石油醚-丙酮进行柱层色谱纯化，经TLC检测、碘显色，得到白色固体产物A，即化合物Ⅲ；
⑥将4mmol的所述化合物Ⅱ溶于2~3mLDMF中，然后在该溶液中加入溶于2~3mLDMF的4.6~4.7mmol的所述化合物Ⅲ溶液，接着加入3~3.5mmol无水碳酸钾，在55~60℃条件下加热12~18h，得到混合液；所述混合液溶于50~60mL乙酸乙酯中，依次用水洗、饱和碳酸氢钠洗涤、饱和氯化钠洗涤、无水硫酸钠干燥，经过滤后在30~40℃下旋干有机溶剂，得到白色固体粗产物B；该白色固体粗产物B用石油醚-丙酮进行柱层色谱纯化，经TLC检测、紫外显色，得到白色固体产物B，即化合物Ⅳ；
⑦将2mmol的所述化合物Ⅳ加入8~10mL的体积比为1：1的四氢呋喃和无水甲醇混合液中，缓慢滴加10mmol/L的氢氧化钠溶液2.5~3mL，55~60℃条件下加热反应5~8h，停止反应后，加入3~5mL水和20~25mL无水乙醇形成共沸混合物，在45~55℃条件下旋干溶剂得到白色固体产物A，即化合物Ⅴ；以80%的产率估计投入下一步反应；
⑧将1.6mmol的所述化合物Ⅴ溶于2~3mLDMF中，开启搅拌，依次加入2.3~2.5mmol的O-(四氢-2H-吡喃-2-基)羟基胺、4.5~5mmol的NMM、4.5~5mmol的HOBT，搅拌10~20min后加入2.3~2.5mmol的EDC，得到反应液，该反应液在常温下搅拌48~72h，反应结束后加入50~60mL乙酸乙酯在常温常压的条件下萃取，得到有机层；所述有机层依次用水洗、饱和碳酸氢钠洗涤、饱和氯化钠洗涤、无水硫酸钠干燥，经过滤后在30~40℃下旋干有机溶剂，得到白色固体粗产物C，该白色固体粗产物C用石油醚-丙酮进行柱层色谱纯化，经TLC检测、紫外显色，得到白色固体化合物Ⅵ，即MMP9小分子探针的阴性对照小分子；
⑨将1mmol的所述化合物Ⅵ溶于20~30mL的5~6mol/L的1，4二氧六环-无水甲醇溶液中，缓慢通入HCL气体，常温搅拌2~4h；然后滴加15~18mL无水乙醚至白色沉淀不再增多，用三乙胺调节pH值至8~8.5，过滤后在30~40℃下旋干有机溶剂，得到白色固体；向所述白色固体中加入1~3mL饱和氨的甲醇溶液，在30℃~40℃下旋干溶剂，得到白色固体产物B，即MMP9小分子配体；
⑶SPR法检测溶液中的MMP9：
ⅰ裸金膜芯片的修饰：
将玻片用N2吹干，置于镀膜平台上，在所述玻片上先镀上厚度为2~3nm的Cr膜，然后在该Cr层上镀厚度为8~10nm的Au膜，得到金膜芯片；
将所述金膜芯片插入到含有4~6mmol/L胱胺（cystamine）的体积浓度为70~85%乙醇溶液中反应6~8h，在所述金膜表面形成尾部带有伯胺（-NH2）基团的单子分子自组装膜（Self-assembledMonolayer，SAM），即得修饰有氨基基团的金膜芯片；
将所述修饰有氨基基团的金膜芯片插入到浓度为0.2~0.3%w/v的交联剂对苯二异硫氰酸酯（1,4-phenylenediisothiocyanate，PDC）的溶液中，反应2~3h；然后依次用DMF和无水乙醇淋洗，再用N2吹干，得到表面修饰有-N=C=S基团的金膜芯片；
ⅱ小分子配体的固定：
将所述表面修饰有-N=C=S基团的金膜芯片固定到SPR仪器上；将浓度为3.5mmol/L的所述MMP9小分子配体以10~100μL/min的恒定流速注射到所述表面修饰有-N=C=S基团的金膜芯片表面，通过SPR仪观察，当动力学曲线基本走平；再次以10~100μL/min的恒定流速注入浓度为10mmol/L的所述MMP9小分子配体，当动力学曲线不再随小分子配体浓度的升高而变化，此时所述MMP9小分子配体在所述表面修饰有-N=C=S基团的金膜芯片表面覆盖率已基本饱和，即得固定有小分子探针的金膜芯片；
ⅲ非特异性小分子吸附的排除：
在与所述步骤ⅱ实验条件一致的情况下，依次以10~100μL/min的恒定流速将浓度为3.5mmol/L、浓度为10mmol/L的所述MMP9小分子探针的阴性对照小分子注射到所述表面修饰有-N=C=S基团的金膜芯片表面，通过SPR仪观察，当其反应前后的SPR共振角变化明显小于所述步骤ⅱ中MMP9小分子配体固定后的共振角变化，即排除了非特异性吸附的存在；
ⅳSPR法检测溶液中的MMP9蛋白：
以10~100μL/min的恒定流速，将浓度为100ng/mL的MMP9注射到所述固定有小分子探针的金膜芯片表面，当动力学曲线不再随MMP9蛋白浓度的升高而变化，此时金膜芯片表面的MMP9蛋白覆盖率已基本饱和，即100ng/mL为MMP9蛋白检测的最低浓度；
ⅴMMP9非特异性蛋白吸附的排除：
在与所述步骤ⅳ实验条件一致的情况下，将浓度为100ng/mL的白蛋白注射到所述固定有小分子探针的金膜芯片表面，通过SPR仪观察，当其反应前后的SPR共振角变化明显小于所述步骤ⅳMMP9固定后的共振角变化，即排除了非特异性吸附的存在。
所述步骤②中的干燥乙腈是指在乙腈中加入五氧化二磷回流2~3天并用碳酸钾蒸馏，最后用分馏柱分馏即得；所述五氧化二磷与所述乙腈的质量体积比为0.5~1mg：1L；所述碳酸钾与所述乙腈的质量体积比为1g：1~2L。
所述步骤③中的石油醚-丙酮是指石油醚与丙酮按10~15mL：1mL的比例混合而成的混合物。
所述步骤⑤中的石油醚-丙酮是指石油醚与丙酮按25~35mL：1mL的比例混合而成的混合物。
所述步骤⑥中的石油醚-丙酮是指石油醚与丙酮按4~6mL：1mL的比例混合而成的混合物。
所述步骤⑧中的石油醚-丙酮是指石油醚与丙酮按1~1.5mL：1mL的比例混合而成的混合物。
所述步骤⑨中的1，4二氧六环-无水甲醇溶液是指1，4二氧六环与无水甲醇按2~3mL：1mL的比例混合而得。
所述步骤ⅰ中浓度为0.2~0.3%w/v的交联剂对苯二异硫氰酸酯的溶液是指在1L吡啶-DMF混合液中加入0.2~0.3mg的对苯二异硫氰酸酯，搅拌均匀所得；所述吡啶-DMF混合液是指吡啶与DMF按1mL：8~10mL的比例混合而得。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明所述的MMP9的小分子配体为目前自然界中不存在且尚未通过人工方法获得的物质，本发明通过查阅文献设计出一系列合成路线，最终选择一条最佳路线对其合成并验证。
2、本发明所合成的MMP9的小分子配体为一种白色固体，用质谱、氢谱对合成的化合物进行鉴定，其分子量为355，在质谱上呈M+1峰（参见图1）；从氢谱的吸收峰和化学位移可以确认该化合物的结构是正确的（参见图2）。
3、本发明将分子对接技术与表面等离子体共振（SPR）技术相结合，并将合成的MMP9小分子配体固定在金膜芯片表面，通过SPR共振角的变化来检测其与溶液中的MMP9蛋白的结合情况（其检测原理如图3所示），从而实现检测溶液中的MMP9的目的。
经测试，在加入小分子探针反应前后，SPR共振角位移+0.25°，而阴性对照则只变化+0.01°，说明小分子探针已固定在SPR芯片表面。在加入MMP9蛋白反应前后，SPR共振角位移变化了+0.14°，而阴性对照蛋白（BSA）只变化+0.05°，说明已检测到MMP9蛋白，结果见表1。
表1SPR法检测共振角变化情况
4、本发明通过在SPR芯片表面固定小分子来检测大分子，与以往普通的SPR检测法不同，但继承了SPR技术高灵敏度、无须标记、可保持分子的生物活性、实时检测、操作方便等优势，创造性地将其与分子对接技术结合在一起提高了检测的特异性，并开辟了一条检测其它蛋白类生物标记物的新的思路。
5、本发明所述的SPR法每一步都在相同的条件下进行了阴性对照，结果可信度高；检测所用的MMP9蛋白为一种人类MMP9全长蛋白，检测的最低浓度为100ng/mL，与其他方法相比具有高灵敏度；阴性对照蛋白为人血清白蛋白（BSA）。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1为本发明小分子配体的质谱图。
图2为本发明小分子配体的氢谱图。
图3为本发明SPR法检测原理图。
图4为本发明MMP9的小分子配体固定到SPR芯片表面过程的SPR动力学曲线。
图5为本发明MMP9的小分子配体固定到SPR芯片表面上反应前后的SPR曲线变化。
图6为本发明MMP9的小分子配体的阴性对照小分子流过SPR芯片表面反应前后的SPR曲线变化。
图7为本发明MMP9与小分子配体在SPR芯片表面结合的SPR动力学曲线。
图8为本发明MMP9与小分子配体在SPR芯片表面结合反应前后SPR曲线变化。
图9为本发明BSA与小分子配体在SPR芯片表面反应前后SPR曲线变化。
具体实施方式
实施例1一种检测溶液中MMP9蛋白的方法，包括以下步骤：
⑴应用分子对接技术设计MMP9的特异性小分子配体（可溶于水的白色固体，分子量为355，化学性质稳定），该MMP9的特异性小分子配体的化学结构式如下（设计原理见参考文献XiL,DuJ,LiS,etal.Acombinedmolecularmodelingstudyongelatinasesandtheirpotentinhibitors[J].JComputChem.2010,31(1):24-42.）：
。
⑵小分子配体的化学合成：
①制备氟化钾-氟化钙（KF-CaF2）熔融物：
将二水氟化钾和氟化钙按物质的量之比为1：1.5混合，搅拌均匀后研磨1h，得到粉末状混合物，该粉末状混合物在140℃下真空干燥8h，即得氟化钾-氟化钙（KF-CaF2）熔融物。
②在干燥乙腈中依次加入对甲基苯磺酰氯、氟化钾-氟化钙熔融物，常温下搅拌8h，反应结束后用沙芯漏斗覆盖2cm厚的硅藻土进行过滤，得到滤液，该滤液经30℃减压蒸馏，得到白色固体对甲基苯磺酰氟。
其中：对甲基苯磺酰氯与干燥乙腈的质量体积比为5g：30mL。
对甲基苯磺酰氯与氟化钾-氟化钙熔融物的质量比为5g：6g。
干燥乙腈是指在乙腈中加入五氧化二磷回流2~3天并用碳酸钾蒸馏，最后用分馏柱分馏即得；五氧化二磷与乙腈的质量体积比为0.5mg：1L；碳酸钾与乙腈的质量体积比为1g：1L。
③在无水无氧条件下，在10mL四氢呋喃（THF）中加入1.5mol/L二异丙基氨基锂（LDA）10mL，并在-78℃搅拌5分钟，然后缓慢滴入溶于20mL干燥THF的4.5mLN-Boc-4-哌啶甲酸乙酯，搅拌30min后，缓慢滴入溶于20mLTHF的对甲基苯磺酰氟3.4g，混合液搅拌8min后移至常温搅拌16h；反应结束后用饱和氯化铵溶液淬灭，得到pH值为8的反应溶液，该反应溶液在常温常压条件下用乙酸乙酯萃取，得到有机层；有机层依次经饱和氯化钠溶液洗涤、无水硫酸钠干燥，经过滤后在30℃条件下旋干有机溶剂得黄色油状固体的粗产物；该黄色油状固体的粗产物用石油醚-丙酮进行柱层色谱纯化，经TLC检测、紫外显色，得到淡黄色固体产物，即化合物Ⅰ。
其中：石油醚-丙酮是指石油醚与丙酮按10mL：1mL的比例混合而成的混合物。
④将2mmol的所述化合物Ⅰ溶于25mL乙酸乙酯中，得到反应液，该反应液置于冰浴中，开启搅拌，通入HCL气体至反应物上的Boc基团全部脱去，然后在30℃条件下旋干有机溶剂，得到白色泡沫状固体产物，即化合物Ⅱ。
⑤取1g3-溴丙胺氢溴酸盐溶于30mL二氯甲烷溶液，开启搅拌，再依次加入0.9g二碳酸二叔丁酯、滴加1.9mL三乙胺，搅拌过夜后，加入2mol/L的盐酸溶液15mL，分层后得到有机层；有机层依次用2mol/L的盐酸溶液洗涤、饱和氯化钠洗涤、无水硫酸钠干燥，经过滤后在30℃下旋干有机溶剂，得到白色固体粗产物A；该白色固体粗产物A用石油醚-丙酮进行柱层色谱纯化，经TLC检测、碘显色，得到白色固体产物A，即化合物Ⅲ。
其中：石油醚-丙酮是指石油醚与丙酮按25mL：1mL的比例混合而成的混合物。
⑥将4mmol的化合物Ⅱ溶于2mLDMF中，然后在该溶液中加入溶于2mLDMF的4.6mmol的化合物Ⅲ溶液，接着加入3mmol无水碳酸钾，在55℃条件下加热18h，得到混合液；混合液溶于50mL乙酸乙酯中，依次用水洗、饱和碳酸氢钠洗涤、饱和氯化钠洗涤、无水硫酸钠干燥，经过滤后在30℃下旋干有机溶剂，得到白色固体粗产物B；该白色固体粗产物B用石油醚-丙酮进行柱层色谱纯化，经TLC检测、紫外显色，得到白色固体产物B，即化合物Ⅳ。
其中：石油醚-丙酮是指石油醚与丙酮按4mL：1mL的比例混合而成的混合物。
⑦将2mmol的化合物Ⅳ加入8mL的体积比为1：1的四氢呋喃和无水甲醇混合液中，缓慢滴加10mmol/L的氢氧化钠溶液2.5mL，55℃条件下加热反应8h，停止反应后，加入3mL水和20mL无水乙醇形成共沸混合物，在45℃条件下旋干溶剂得到白色固体产物A，即化合物Ⅴ；并以80%的产率估计投入下一步反应。
⑧将1.6mmol的化合物Ⅴ溶于2mLDMF中，开启搅拌，依次加入2.3mmol的O-(四氢-2H-吡喃-2-基)羟基胺、4.5mmol的NMM、4.5mmol的HOBT，搅拌10min后加入2.3mmol的EDC，得到反应液，该反应液在常温下搅拌48h，反应结束后加入50mL乙酸乙酯在常温常压的条件下萃取，得到有机层；有机层依次用水洗、饱和碳酸氢钠洗涤、饱和氯化钠洗涤、无水硫酸钠干燥，经过滤后在30℃下旋干有机溶剂，得到白色固体粗产物C，该白色固体粗产物C用石油醚-丙酮进行柱层色谱纯化，经TLC检测、紫外显色，得到白色固体化合物Ⅵ，即MMP9小分子探针的阴性对照小分子。
其中：石油醚-丙酮是指石油醚与丙酮按1mL：1mL的比例混合而成的混合物。
⑨将1mmol的化合物Ⅵ溶于20mL的5mol/L的1，4二氧六环-无水甲醇溶液中，缓慢通入HCL气体，常温搅拌2h；然后滴加15mL无水乙醚至白色沉淀不再增多，用三乙胺调节pH值至8，过滤后在30℃下旋干有机溶剂，得到白色固体；向白色固体中加入1mL饱和氨的甲醇溶液，在30℃下旋干溶剂，得到白色固体产物B，即MMP9小分子配体。
其中：1，4二氧六环-无水甲醇溶液是指1，4二氧六环与无水甲醇按2mL：1mL的比例混合而得。
⑶SPR法检测溶液中的MMP9：
ⅰ裸金膜芯片的修饰：
将玻片用N2吹干，置于镀膜平台上，在玻片上先镀上厚度为2nm的Cr膜(这是为了使金能够更牢固的吸附在玻片表面)，然后在该Cr层上镀厚度为8nm的Au膜，得到金膜芯片。
将金膜芯片插入到含有4mmol/L胱胺（cystamine）的体积浓度为70%乙醇溶液中反应6h，在金膜表面形成尾部带有伯胺（-NH2）基团的单子分子自组装膜（Self-assembledMonolayer，SAM），即得修饰有氨基基团的金膜芯片。
将修饰有氨基基团的金膜芯片插入到浓度为0.2%w/v的交联剂对苯二异硫氰酸酯（1,4-phenylenediisothiocyanate，PDC）的溶液中，反应2h；然后依次用DMF和无水乙醇淋洗，再用N2吹干，得到表面修饰有-N=C=S基团的金膜芯片。
其中：浓度为0.2%w/v的交联剂对苯二异硫氰酸酯的溶液是指在1L吡啶-DMF混合液中加入0.2mg的对苯二异硫氰酸酯，搅拌均匀所得；吡啶-DMF混合液是指吡啶与DMF按1mL：8mL的比例混合而得。
ⅱ小分子配体的固定：
将表面修饰有-N=C=S基团的金膜芯片固定到SPR仪器上。
将浓度为3.5mmol/L的MMP9小分子配体以10~100μL/min的恒定流速注射到表面修饰有-N=C=S基团的金膜芯片表面，通过SPR仪观察，SPR光强迅速增大，随着配体固定反应的进行，化学反应速率逐渐降低，动力学曲线的斜率逐渐降低，当动力学曲线基本走平；再次以10~100μL/min的恒定流速注入浓度为10mmol/L的MMP9小分子配体，SPR光强再次升高并迅速走平，当动力学曲线不再随小分子配体浓度的升高而变化，此时MMP9小分子配体在表面修饰有-N=C=S基团的金膜芯片表面覆盖率已基本饱和，即得固定有小分子探针的金膜芯片（如图4所示），10mm/L即为MMP9小分子配体固定的最适浓度。扫描结果显示反应前后SPR共振角变化+0.25°（如图5所示）。
ⅲ非特异性小分子吸附的排除：
在与步骤ⅱ实验条件一致的情况下，依次以10~100μL/min的恒定流速将浓度为3.5mmol/L、浓度为10mmol/L的MMP9小分子探针的阴性对照小分子注射到表面修饰有-N=C=S基团的金膜芯片表面，通过SPR仪观察，当其反应前后的SPR共振角变化明显小于步骤ⅱ中MMP9小分子配体固定后的共振角变化，即排除了非特异性吸附的存在。如图6所示，反应前后的SPR共振角变化+0.01°，明显小于步骤ⅱ中MMP9小分子配体固定后的共振角变化，由此判断上一步实验结果可信，小分子配体固定成功。
ⅳSPR法检测溶液中的MMP9蛋白：
以10~100μL/min的恒定流速，将浓度为100ng/mL的MMP9注射到固定有小分子探针的金膜芯片表面，通过SPR仪观察，SPR光强迅速增大，随着MMP9固定反应的进行，化学反应速率逐渐降低，动力学曲线的斜率逐渐降低，动力学曲线基本走平，当动力学曲线不再随MMP9蛋白浓度的升高而变化，此时金膜芯片表面的MMP9蛋白覆盖率已基本饱和（如图7所示），即100ng/mL为MMP9蛋白检测的最低浓度。扫描结果显示固定MMP9反应前后SPR共振角变化+0.14°（如图8所示）。
ⅴMMP9非特异性蛋白吸附的排除：
在与步骤ⅳ实验条件一致的情况下，将浓度为100ng/mL的白蛋白（BSA）注射到固定有小分子探针的金膜芯片表面，通过SPR仪观察，当其反应前后的SPR共振角变化明显小于步骤ⅳMMP9固定后的共振角变化，即排除了非特异性吸附的存在（参见图9）。反应前后的SPR共振角变化+0.05°，明显小于步骤ⅳMMP9固定后的共振角变化，即在SPR芯片表面的小分子配体只能和溶液中的MMP9蛋白结合而不能和其它蛋白（BSA）结合。
实施例2一种检测溶液中MMP9蛋白的方法，包括以下步骤：
⑴应用分子对接技术设计MMP9的特异性小分子配体同实施例1。
⑵小分子配体的化学合成：
①制备氟化钾-氟化钙（KF-CaF2）熔融物：
将二水氟化钾和氟化钙按物质的量之比为1：2.5混合，搅拌均匀后研磨2h，得到粉末状混合物，该粉末状混合物在160℃下真空干燥5h，即得氟化钾-氟化钙（KF-CaF2）熔融物。
②在干燥乙腈中依次加入对甲基苯磺酰氯、氟化钾-氟化钙熔融物，常温下搅拌12h，反应结束后用沙芯漏斗覆盖3cm厚的硅藻土进行过滤，得到滤液，该滤液经40℃减压蒸馏，得到白色固体对甲基苯磺酰氟。
其中：对甲基苯磺酰氯与干燥乙腈的质量体积比为5g：40mL。
对甲基苯磺酰氯与氟化钾-氟化钙熔融物的质量比为5g：8g。
干燥乙腈是指在乙腈中加入五氧化二磷回流2~3天并用碳酸钾蒸馏，最后用分馏柱分馏即得；五氧化二磷与乙腈的质量体积比为1mg：1L；碳酸钾与乙腈的质量体积比为1g：2L。
③在无水无氧条件下，在12mL四氢呋喃（THF）中加入2.5mol/L二异丙基氨基锂（LDA）11mL，并在-78℃搅拌10分钟，然后缓慢滴入溶于25mL干燥THF的5mLN-Boc-4-哌啶甲酸乙酯，搅拌30min后，缓慢滴入溶于25mLTHF的对甲基苯磺酰氟3.5g，混合液搅拌15min后移至常温搅拌20h；反应结束后用饱和氯化铵溶液淬灭，得到pH值为9的反应溶液，该反应溶液在常温常压条件下用乙酸乙酯萃取，得到有机层；有机层依次经饱和氯化钠溶液洗涤、无水硫酸钠干燥，经过滤后在40℃条件下旋干有机溶剂得黄色油状固体的粗产物；该黄色油状固体的粗产物用石油醚-丙酮进行柱层色谱纯化，经TLC检测、紫外显色，得到淡黄色固体产物，即化合物Ⅰ。
其中：石油醚-丙酮是指石油醚与丙酮按15mL：1mL的比例混合而成的混合物。
④将2mmol的所述化合物Ⅰ溶于30mL乙酸乙酯中，得到反应液，该反应液置于冰浴中，开启搅拌，通入HCL气体至反应物上的Boc基团全部脱去，然后在40℃条件下旋干有机溶剂，得到白色泡沫状固体产物，即化合物Ⅱ。
⑤取1g3-溴丙胺氢溴酸盐溶于40mL二氯甲烷溶液，开启搅拌，再依次加入1g二碳酸二叔丁酯、滴加2.5mL三乙胺，搅拌过夜后，加入3mol/L的盐酸溶液20mL，分层后得到有机层；有机层依次用3mol/L的盐酸溶液洗涤、饱和氯化钠洗涤、无水硫酸钠干燥，经过滤后在40℃下旋干有机溶剂，得到白色固体粗产物A；该白色固体粗产物A用石油醚-丙酮进行柱层色谱纯化，经TLC检测、碘显色，得到白色固体产物A，即化合物Ⅲ。
其中：石油醚-丙酮是指石油醚与丙酮按35mL：1mL的比例混合而成的混合物。
⑥将4mmol的化合物Ⅱ溶于3mLDMF中，然后在该溶液中加入溶于3mLDMF的4.7mmol的化合物Ⅲ溶液，接着加入3.5mmol无水碳酸钾，在60℃条件下加热12h，得到混合液；混合液溶于60mL乙酸乙酯中，依次用水洗、饱和碳酸氢钠洗涤、饱和氯化钠洗涤、无水硫酸钠干燥，经过滤后在40℃下旋干有机溶剂，得到白色固体粗产物B；该白色固体粗产物B用石油醚-丙酮进行柱层色谱纯化，经TLC检测、紫外显色，得到白色固体产物B，即化合物Ⅳ。
其中：石油醚-丙酮是指石油醚与丙酮按6mL：1mL的比例混合而成的混合物。
⑦将2mmol的化合物Ⅳ加入10mL的体积比为1：1的四氢呋喃和无水甲醇混合液中，缓慢滴加10mmol/L的氢氧化钠溶液3mL，60℃条件下加热反应5h，停止反应后，加入5mL水和25mL无水乙醇形成共沸混合物，在55℃条件下旋干溶剂得到白色固体产物A，即化合物Ⅴ；并以80%的产率估计投入下一步反应。
⑧将1.6mmol的化合物Ⅴ溶于3mLDMF中，开启搅拌，依次加入2.5mmol的O-(四氢-2H-吡喃-2-基)羟基胺、5mmol的NMM、5mmol的HOBT，搅拌20min后加入2.5mmol的EDC，得到反应液，该反应液在常温下搅拌72h，反应结束后加入60mL乙酸乙酯在常温常压的条件下萃取，得到有机层；有机层依次用水洗、饱和碳酸氢钠洗涤、饱和氯化钠洗涤、无水硫酸钠干燥，经过滤后在40℃下旋干有机溶剂，得到白色固体粗产物C，该白色固体粗产物C用石油醚-丙酮进行柱层色谱纯化，经TLC检测、紫外显色，得到白色固体化合物Ⅵ，即MMP9小分子探针的阴性对照小分子。
其中：石油醚-丙酮是指石油醚与丙酮按1.5mL：1mL的比例混合而成的混合物。
⑨将1mmol的化合物Ⅵ溶于30mL的6mol/L的1，4二氧六环-无水甲醇溶液中，缓慢通入HCL气体，常温搅拌4h；然后滴加18mL无水乙醚至白色沉淀不再增多，用三乙胺调节pH值至8.5，过滤后在40℃下旋干有机溶剂，得到白色固体；向白色固体中加入3mL饱和氨的甲醇溶液，在40℃下旋干溶剂，得到白色固体产物B，即MMP9小分子配体。
其中：1，4二氧六环-无水甲醇溶液是指1，4二氧六环与无水甲醇按3mL：1mL的比例混合而得。
⑶SPR法检测溶液中的MMP9：
ⅰ裸金膜芯片的修饰：
将玻片用N2吹干，置于镀膜平台上，在玻片上先镀上厚度为3nm的Cr膜(这是为了使金能够更牢固的吸附在玻片表面)，然后在该Cr层上镀厚度为10nm的Au膜，得到金膜芯片。
将金膜芯片插入到含有6mmol/L胱胺（cystamine）的体积浓度为85%乙醇溶液中反应8h，在金膜表面形成尾部带有伯胺（-NH2）基团的单子分子自组装膜（Self-assembledMonolayer，SAM），即得修饰有氨基基团的金膜芯片。
将修饰有氨基基团的金膜芯片插入到浓度为0.3%w/v的交联剂对苯二异硫氰酸酯（1,4-phenylenediisothiocyanate，PDC）的溶液中，反应3h；然后依次用DMF和无水乙醇淋洗，再用氮气吹干，得到表面修饰有-N=C=S基团的金膜芯片。
其中：浓度为0.3%w/v的交联剂对苯二异硫氰酸酯的溶液是指在1L吡啶-DMF混合液中加入0.3mg的对苯二异硫氰酸酯，搅拌均匀所得；吡啶-DMF混合液是指吡啶与DMF按1mL：10mL的比例混合而得。
ⅱ小分子配体的固定同实施例1。
ⅲ非特异性小分子吸附的排除同实施例1。
ⅳSPR法检测溶液中的MMP9蛋白同实施例1。
ⅴMMP9非特异性蛋白吸附的排除同实施例1。
实施例3一种检测溶液中MMP9蛋白的方法，包括以下步骤：
⑴应用分子对接技术设计MMP9的特异性小分子配体同实施例1。
⑵小分子配体的化学合成：
①制备氟化钾-氟化钙（KF-CaF2）熔融物：
将二水氟化钾和氟化钙按物质的量之比为1：2混合，搅拌均匀后研磨1.5h，得到粉末状混合物，该粉末状混合物在150℃下真空干燥6h，即得氟化钾-氟化钙（KF-CaF2）熔融物。
②在干燥乙腈中依次加入对甲基苯磺酰氯、氟化钾-氟化钙熔融物，常温下搅拌10h，反应结束后用沙芯漏斗覆盖2.5cm厚的硅藻土进行过滤，得到滤液，该滤液经35℃减压蒸馏，得到白色固体对甲基苯磺酰氟。
其中：对甲基苯磺酰氯与干燥乙腈的质量体积比为5g：35mL。
对甲基苯磺酰氯与氟化钾-氟化钙熔融物的质量比为5g：7g。
干燥乙腈是指在乙腈中加入五氧化二磷回流2~3天并用碳酸钾蒸馏，最后用分馏柱分馏即得；五氧化二磷与乙腈的质量体积比为0.8mg：1L；碳酸钾与乙腈的质量体积比为1g：1.5L。
③在无水无氧条件下，在11mL四氢呋喃（THF）中加入2mol/L二异丙基氨基锂（LDA）10.5mL，并在-78℃搅拌8分钟，然后缓慢滴入溶于23mL干燥THF的4.8mLN-Boc-4-哌啶甲酸乙酯，搅拌30min后，缓慢滴入溶于22mLTHF的对甲基苯磺酰氟3.45g，混合液搅拌10min后移至常温搅拌18h；反应结束后用饱和氯化铵溶液淬灭，得到pH值为8.5的反应溶液，该反应溶液在常温常压条件下用乙酸乙酯萃取，得到有机层；有机层依次经饱和氯化钠溶液洗涤、无水硫酸钠干燥，经过滤后在35℃条件下旋干有机溶剂得黄色油状固体的粗产物；该黄色油状固体的粗产物用石油醚-丙酮进行柱层色谱纯化，经TLC检测、紫外显色，得到淡黄色固体产物，即化合物Ⅰ。
其中：石油醚-丙酮是指石油醚与丙酮按12mL：1mL的比例混合而成的混合物。
④将2mmol的所述化合物Ⅰ溶于28mL乙酸乙酯中，得到反应液，该反应液置于冰浴中，开启搅拌，通入HCL气体至反应物上的Boc基团全部脱去，然后在35℃条件下旋干有机溶剂，得到白色泡沫状固体产物，即化合物Ⅱ。
⑤取1g3-溴丙胺氢溴酸盐溶于35mL二氯甲烷溶液，开启搅拌，再依次加入0.95g二碳酸二叔丁酯、滴加2.2mL三乙胺，搅拌过夜后，加入2.5mol/L的盐酸溶液18mL，分层后得到有机层；有机层依次用2.5mol/L的盐酸溶液洗涤、饱和氯化钠洗涤、无水硫酸钠干燥，经过滤后在35℃下旋干有机溶剂，得到白色固体粗产物A；该白色固体粗产物A用石油醚-丙酮进行柱层色谱纯化，经TLC检测、碘显色，得到白色固体产物A，即化合物Ⅲ。
其中：石油醚-丙酮是指石油醚与丙酮按30mL：1mL的比例混合而成的混合物。
⑥将4mmol的化合物Ⅱ溶于2.5mLDMF中，然后在该溶液中加入溶于2.5mLDMF的4.65mmol的化合物Ⅲ溶液，接着加入3.2mmol无水碳酸钾，在58℃条件下加热15h，得到混合液；混合液溶于55mL乙酸乙酯中，依次用水洗、饱和碳酸氢钠洗涤、饱和氯化钠洗涤、无水硫酸钠干燥，经过滤后在35℃下旋干有机溶剂，得到白色固体粗产物B；该白色固体粗产物B用石油醚-丙酮进行柱层色谱纯化，经TLC检测、紫外显色，得到白色固体产物B，即化合物Ⅳ。
其中：石油醚-丙酮是指石油醚与丙酮按5mL：1mL的比例混合而成的混合物。
⑦将2mmol的化合物Ⅳ加入9mL的体积比为1：1的四氢呋喃和无水甲醇混合液中，缓慢滴加10mmol/L的氢氧化钠溶液2.8mL，58℃条件下加热反应7h，停止反应后，加入4mL水和22mL无水乙醇形成共沸混合物，在50℃条件下旋干溶剂得到白色固体产物A，即化合物Ⅴ；并以80%的产率估计投入下一步反应。
⑧将1.6mmol的化合物Ⅴ溶于2.5mLDMF中，开启搅拌，依次加入2.4mmol的O-(四氢-2H-吡喃-2-基)羟基胺、4.8mmol的NMM、4.8mmol的HOBT，搅拌15min后加入2.4mmol的EDC，得到反应液，该反应液在常温下搅拌60h，反应结束后加入55mL乙酸乙酯在常温常压的条件下萃取，得到有机层；有机层依次用水洗、饱和碳酸氢钠洗涤、饱和氯化钠洗涤、无水硫酸钠干燥，经过滤后在35℃下旋干有机溶剂，得到白色固体粗产物C，该白色固体粗产物C用石油醚-丙酮进行柱层色谱纯化，经TLC检测、紫外显色，得到白色固体化合物Ⅵ，即MMP9小分子探针的阴性对照小分子。
其中：石油醚-丙酮是指石油醚与丙酮按1.8mL：1mL的比例混合而成的混合物。
⑨将1mmol的化合物Ⅵ溶于25mL的5.5mol/L的1，4二氧六环-无水甲醇溶液中，缓慢通入HCL气体，常温搅拌3h；然后滴加16mL无水乙醚至白色沉淀不再增多，用三乙胺调节pH值至8.2，过滤后在35℃下旋干有机溶剂，得到白色固体；向白色固体中加入2mL饱和氨的甲醇溶液，在35℃下旋干溶剂，得到白色固体产物B，即MMP9小分子配体。
其中：1，4二氧六环-无水甲醇溶液是指1，4二氧六环与无水甲醇按2.5mL：1mL的比例混合而得。
⑶SPR法检测溶液中的MMP9：
ⅰ裸金膜芯片的修饰：
将玻片用N2吹干，置于镀膜平台上，在玻片上先镀上厚度为2.5nm的Cr膜(这是为了使金能够更牢固的吸附在玻片表面)，然后在该Cr层上镀厚度为9nm的Au膜，得到金膜芯片。
将金膜芯片插入到含有5mmol/L胱胺（cystamine）的体积浓度为78%乙醇溶液中反应7h，在金膜表面形成尾部带有伯胺（-NH2）基团的单子分子自组装膜（Self-assembledMonolayer，SAM），即得修饰有氨基基团的金膜芯片。
将修饰有氨基基团的金膜芯片插入到浓度为0.25%w/v的交联剂对苯二异硫氰酸酯（1,4-phenylenediisothiocyanate，PDC）的溶液中，反应2.5h；然后依次用DMF和无水乙醇淋洗，再用氮气吹干，得到表面修饰有-N=C=S基团的金膜芯片。
其中：浓度为0.25%w/v的交联剂对苯二异硫氰酸酯的溶液是指在1L吡啶-DMF混合液中加入0.25mg的对苯二异硫氰酸酯，搅拌均匀所得；吡啶-DMF混合液是指吡啶与DMF按1mL：9mL的比例混合而得。
ⅱ小分子配体的固定同实施例1。
ⅲ非特异性小分子吸附的排除同实施例1。
ⅳSPR法检测溶液中的MMP9蛋白同实施例1。
ⅴMMP9非特异性蛋白吸附的排除同实施例1。
Claims (1)
1.一种检测溶液中MMP9蛋白的方法，包括以下步骤：
⑴应用分子对接技术设计MMP9的特异性小分子配体，该MMP9的特异性小分子配体的化学结构式如下：
；
⑵小分子配体的化学合成：
①制备氟化钾-氟化钙熔融物：
将二水氟化钾和氟化钙按物质的量之比为1：1.5~2.5混合，搅拌均匀后研磨1~2h，得到粉末状混合物，该粉末状混合物在140~160℃下真空干燥5~8h，即得氟化钾-氟化钙熔融物；
②在干燥乙腈中依次加入对甲基苯磺酰氯、所述氟化钾-氟化钙熔融物，常温下搅拌8~12h，反应结束后用沙芯漏斗覆盖2~3cm厚的硅藻土进行过滤，得到滤液，该滤液经30~40℃减压蒸馏，得到白色固体对甲基苯磺酰氟；所述对甲基苯磺酰氯与所述干燥乙腈的质量体积比为5g：30~40mL；所述对甲基苯磺酰氯与所述氟化钾-氟化钙熔融物的质量比为5g：6~8g；所述干燥乙腈是指在乙腈中加入五氧化二磷回流2~3天并用碳酸钾蒸馏，最后用分馏柱分馏即得；所述五氧化二磷与所述乙腈的质量体积比为0.5~1mg：1L；所述碳酸钾与所述乙腈的质量体积比为1g：1~2L；
③在无水无氧条件下，在10~12mL四氢呋喃中加入1.5~2.5mol/L二异丙基氨基锂10~11mL，并在-78℃搅拌5~10分钟，然后缓慢滴入溶于20~25mL干燥THF的4.5~5mLN-Boc-4-哌啶甲酸乙酯，搅拌30min后，缓慢滴入溶于20~25mLTHF的所述对甲基苯磺酰氟3.4~3.5g，混合液搅拌8~15min后移至常温搅拌16~20h；反应结束后用饱和氯化铵溶液淬灭，得到pH值为8~9的反应溶液，该反应溶液在常温常压条件下用乙酸乙酯萃取，得到有机层；所述有机层依次经饱和氯化钠溶液洗涤、无水硫酸钠干燥，经过滤后在30℃~40℃条件下旋干有机溶剂得黄色油状固体的粗产物；该黄色油状固体的粗产物用石油醚-丙酮进行柱层色谱纯化，经TLC检测、紫外显色，得到淡黄色固体产物，即化合物Ⅰ；所述石油醚-丙酮是指石油醚与丙酮按10~15mL：1mL的比例混合而成的混合物；
④将2mmol的所述化合物Ⅰ溶于25~30mL乙酸乙酯中，得到反应液，该反应液置于冰浴中，开启搅拌，通入HCL气体至反应物上的Boc基团全部脱去，然后在30℃~40℃条件下旋干有机溶剂，得到白色泡沫状固体产物，即化合物Ⅱ；
⑤取1g3-溴丙胺氢溴酸盐溶于30~40mL二氯甲烷溶液，开启搅拌，再依次加入0.9~1g二碳酸二叔丁酯、滴加1.9~2.5mL三乙胺，搅拌过夜后，加入2~3mol/L的盐酸溶液15~20mL，分层后得到有机层；所述有机层依次用2~3mol/L的盐酸溶液洗涤、饱和氯化钠洗涤、无水硫酸钠干燥，经过滤后在30~40℃下旋干有机溶剂，得到白色固体粗产物A；该白色固体粗产物A用石油醚-丙酮进行柱层色谱纯化，经TLC检测、碘显色，得到白色固体产物，即化合物Ⅲ；所述石油醚-丙酮是指石油醚与丙酮按25~35mL：1mL的比例混合而成的混合物；
⑥将4mmol的所述化合物Ⅱ溶于2~3mLDMF中，然后在该溶液中加入溶于2~3mLDMF的4.6~4.7mmol的化合物Ⅲ溶液，接着加入3~3.5mmol无水碳酸钾，在55~60℃条件下加热12~18h，得到混合液；所述混合液溶于50~60mL乙酸乙酯中，依次用水洗、饱和碳酸氢钠洗涤、饱和氯化钠洗涤、无水硫酸钠干燥，经过滤后在30~40℃下旋干有机溶剂，得到白色固体粗产物B；该白色固体粗产物B用石油醚-丙酮进行柱层色谱纯化，经TLC检测、紫外显色，得到白色固体产物，即化合物Ⅳ；所述石油醚-丙酮是指石油醚与丙酮按4~6mL：1mL的比例混合而成的混合物；
⑦将2mmol的所述化合物Ⅳ加入8~10mL的体积比为1：1的四氢呋喃和无水甲醇混合液中，缓慢滴加10mmol/L的氢氧化钠溶液2.5~3mL，55~60℃条件下加热反应5~8h，停止反应后，加入3~5mL水和20~25mL无水乙醇形成共沸混合物，在45~55℃条件下旋干溶剂得到白色固体产物，即化合物Ⅴ；以80%的产率估计投入下一步反应；
⑧将1.6mmol的所述化合物Ⅴ溶于2~3mLDMF中，开启搅拌，依次加入2.3~2.5mmol的O-(四氢-2H-吡喃-2-基)羟基胺、4.5~5mmol的NMM、4.5~5mmol的HOBT，搅拌10~20min后加入2.3~2.5mmol的EDC，得到反应液，该反应液在常温下搅拌48~72h，反应结束后加入50~60mL乙酸乙酯在常温常压的条件下萃取，得到有机层；所述有机层依次用水洗、饱和碳酸氢钠洗涤、饱和氯化钠洗涤、无水硫酸钠干燥，经过滤后在30~40℃下旋干有机溶剂，得到白色固体粗产物C，该白色固体粗产物C用石油醚-丙酮进行柱层色谱纯化，经TLC检测、紫外显色，得到白色固体化合物Ⅵ，即MMP9小分子探针的阴性对照小分子；所述石油醚-丙酮是指石油醚与丙酮按1~1.5mL：1mL的比例混合而成的混合物；
⑨将1mmol的所述化合物Ⅵ溶于20~30mL的5~6mol/L的1，4二氧六环-无水甲醇溶液中，缓慢通入HCL气体，常温搅拌2~4h；然后滴加15~18mL无水乙醚至白色沉淀不再增多，用三乙胺调节pH值至8~8.5，过滤后在30~40℃下旋干有机溶剂，得到白色固体；向所述白色固体中加入1~3mL饱和氨的甲醇溶液，在30℃~40℃下旋干溶剂，得到白色固体产物，即MMP9小分子配体；所述1，4二氧六环-无水甲醇溶液是指1，4二氧六环与无水甲醇按2~3mL：1mL的比例混合而得；
⑶SPR法检测溶液中的MMP9：
ⅰ裸金膜芯片的修饰：
将玻片用N2吹干，置于镀膜平台上，在所述玻片上先镀上厚度为2~3nm的Cr膜，然后在该Cr层上镀厚度为8~10nm的Au膜，得到金膜芯片；
将所述金膜芯片插入到含有4~6mmol/L胱胺的体积浓度为70~85%乙醇溶液中反应6~8h，在所述金膜表面形成尾部带有伯胺基团的单子分子自组装膜，即得修饰有氨基基团的金膜芯片；
将所述修饰有氨基基团的金膜芯片插入到浓度为0.2~0.3%w/v的交联剂对苯二异硫氰酸酯的溶液中，反应2~3h；然后依次用DMF和无水乙醇淋洗，再用N2吹干，得到表面修饰有-N=C=S基团的金膜芯片；
所述浓度为0.2~0.3%w/v的交联剂对苯二异硫氰酸酯的溶液是指在1L吡啶-DMF混合液中加入0.2~0.3mg的对苯二异硫氰酸酯，搅拌均匀所得；所述吡啶-DMF混合液是指吡啶与DMF按1mL：8~10mL的比例混合而得；
ⅱ小分子配体的固定：
将所述表面修饰有-N=C=S基团的金膜芯片固定到SPR仪器上；将浓度为3.5mmol/L的所述MMP9小分子配体以10~100μL/min的恒定流速注射到所述表面修饰有-N=C=S基团的金膜芯片表面，通过SPR仪观察，当动力学曲线基本走平；再次以10~100μL/min的恒定流速注入浓度为10mmol/L的所述MMP9小分子配体，当动力学曲线不再随小分子配体浓度的升高而变化，此时所述MMP9小分子配体在所述表面修饰有-N=C=S基团的金膜芯片表面覆盖率已基本饱和，即得固定有小分子探针的金膜芯片；
ⅲ非特异性小分子吸附的排除：
在与所述步骤ⅱ实验条件一致的情况下，依次以10~100μL/min的恒定流速将浓度为3.5mmol/L、浓度为10mmol/L的所述MMP9小分子探针的阴性对照小分子注射到所述表面修饰有-N=C=S基团的金膜芯片表面，通过SPR仪观察，当其反应前后的SPR共振角变化明显小于所述步骤ⅱ中MMP9小分子配体固定后的共振角变化，即排除了非特异性吸附的存在；
ⅳSPR法检测溶液中的MMP9蛋白：
以10~100μL/min的恒定流速，将浓度为100ng/mL的MMP9注射到所述固定有小分子探针的金膜芯片表面，当动力学曲线不再随MMP9蛋白浓度的升高而变化，此时金膜芯片表面的MMP9蛋白覆盖率已基本饱和，即100ng/mL为MMP9蛋白检测的最低浓度；
ⅴMMP9非特异性蛋白吸附的排除：
在与所述步骤ⅳ实验条件一致的情况下，将浓度为100ng/mL的白蛋白注射到所述固定有小分子探针的金膜芯片表面，通过SPR仪观察，当其反应前后的SPR共振角变化明显小于所述步骤ⅳMMP9固定后的共振角变化，即排除了非特异性吸附的存在。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
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