CN103931563A - 转基因抗虫水稻对捕食性天敌草间钻头蛛安全性评价方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及转基因抗虫水稻对捕食性天敌草间钻头蛛安全性评价方法,由三级营养试验，蛋白传递规律，捕食功能反应以及种群密度与种群动态比较4个部分组成。通过草间钻头蛛的食物链评价转Bt基因抗虫水稻对草间钻头蛛的影响；采用ELISA检测手段鉴定草间钻头蛛暴露于Bt蛋白的途径和程度；评价转Bt基因抗虫水稻对该非靶标生物捕食功能的影响；通过比较转Bt基因抗虫水稻与非转基因亲本对照，评价对草间钻头蛛种群的影响。最终，根据4方面数据综合评价转基因作物的种植对该非靶标生物产生的生态后果。本发明建立了一套系统、科学的评价方法，对完善转基因作物对非靶标生物的影响研究以及确定转基因作物种植的生态安全性具有重要意义。

Description

转基因抗虫水稻对捕食性天敌草间钻头蛛安全性评价方法

技术领域

本发明属于转基因作物生态风险评价技术领域,具体涉及一种转基因抗虫水稻对捕食性天敌草间钻头蛛安全性评价方法。

背景技术

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，全世界有30多亿人口以稻米为食。同时水稻又是虫害最多的粮食作物之一，每年由于稻纵卷叶螟、钻蛀性螟虫等鳞翅目昆虫的为害，造成重大的产量损失（Cheng，1996；Nathan，2006）。在生产实际中，鳞翅目害虫的防治长期依赖于化学农药，化学农药的滥用不但增加了水稻的生产成本，而且污染环境，还容易使害虫产生抗性，降低农药的药效（Su et al，2003）。因此，高抗鳞翅目的抗性品种是一种经济、有效、环保的防治手段。然而，在水稻及野生稻中，难以找到高抗鳞翅目昆虫的抗源。要培育高抗鳞翅目害虫的水稻品种，需借助于外源抗虫基因。Bacillus thuringiensis(Bt)杀虫蛋白被用作生物源杀虫剂已经有五十多年的历史，对鳞翅目害虫有稳定的防治效果。目前，转Bt基因抗虫水稻是控制鳞翅目害虫的主要抗虫水稻。

然而，抗虫转基因植物的利用给人类带来利益的同时，也存在一定潜在的生态风险。转基因抗虫植物的生态安全性评价集中在：对靶标害虫的抗性治理、对非靶标生物和生物多样性的影响、基因漂移问题和对土壤微生物的影响等。转基因抗虫植物对非靶标生物的潜在影响是有关转基因作物环境风险评价的重要部分。目前，国际上的风险评价工作者以及转基因植物相关管理部门广泛采用“分层次评价体系”开展转基因植物对非靶标生物影响方面的研究工作（Romeis et al.，2008；王圆圆等，2011）。该评价体系就是选择合适的受试生物，然后依次开展从实验室试验到半田间试验，再到田间试验分层次分阶段进行的系统评价。

褐飞虱Nilaparvata lugens是温带和热带水稻田间最主要的害虫之一，是转Bt基因水稻种植过程中重要的非靶标植食性昆虫。草间钻头蛛是稻田系统中十分常见的广谱性捕食者，是稻田蜘蛛的优势种之一。它能十分有效的控制飞虱和叶蝉，是褐飞虱最主要的捕食者，其通过捕食过程能够摄取到Bt杀虫蛋白，有存在生态风险的可能性，那么，建立一套系统评价转Bt基因抗虫水稻对草间钻头蛛是否安全的方法尤为重要。

发明内容

本发明的目的是针对上述现状，旨在提供一种安全有效、操作简便、成本低廉的转基因抗虫水稻对捕食性天敌草间钻头蛛安全性评价方法。

本发明目的的实现方式为，转基因抗虫水稻对捕食性天敌草间钻头蛛安全性评价方法，包括如下4个部分：

(1)三级营养试验：通过水稻—褐飞虱—草间钻头蛛的食物链评价转Bt基因抗虫水稻通过猎物介导对草间钻头蛛的安全性影响；

草间钻头蛛二龄幼蛛于指型管中单头饲养，管口塞以棉花，管底放一吸水海棉，分别以不同水稻材料稻苗饲养的褐飞虱若虫作为食物饲喂草间钻头蛛，发育前期用低龄若虫，发育后期用高龄若虫，每日提供充足的食物与水源，并观察蜘蛛的蜕皮与存活情况，直至死亡或发育为成蛛；待蜘蛛发育成熟，用万分之一电子天平称重，然后雌雄配对，记录其产卵前期及第一个卵袋的含卵量；每个水稻材料处理供试蜘蛛150头；

选择草间钻头蛛的幼蛛发育历期、产卵前期、成蛛体重以及第一个卵袋含卵量作为评价参数指标，并进行统计分析，评价由褐飞虱若虫介导的转Bt基因抗虫水稻对草间钻头蛛的安全性影响；

(2)蛋白传递规律：通过ELISA检测手段鉴定草间钻头蛛暴露于Bt蛋白的途径和程度；

于玻璃罐中分别放入15日龄不同水稻品种、系的稻苗，接入对应水稻材料饲养的褐飞虱若虫及草间钻头蛛雌成蛛，取食5天后，分别对水稻叶鞘，褐飞虱若虫，草间钻头蛛进行取样，叶鞘30±1mg，褐飞虱若虫30±1mg，草间钻头蛛10头；每个处理重复4～5次；

采用ELISA技术，分别对以上样品中Bt蛋白的含量进行检测，确定通过食物链草间钻头蛛暴露于Bt蛋白的程度；

(3)捕食功能反应：通过比较转Bt基因抗虫水稻与非转基因亲本对照品种稻田采集的草间钻头蛛捕食功能参数，评判转Bt基因抗虫水稻对该非靶标生物的影响；

于种植不同水稻材料的稻田分别采集25头大小相似的健康草间钻头蛛雌成蛛，试验之前只给草间钻头蛛雌成蛛提供水，不提供猎物，使其饥饿24小时；在玻璃管底部放置含水海棉，移入4根15日龄稻苗，按照5、10、20、30、40头/管的密度接入已在不同水稻材料上饲养的1～2龄褐飞虱若虫，再放入1头草间钻头蛛雌成蛛，每个密度处理重复5次，24小时后考察各玻璃管中的褐飞虱被捕食的情况；

选择草间钻头蛛的瞬时攻击率和处理猎物时间作为评价参数指标，并进行统计分析，评价转Bt基因抗虫水稻对草间钻头蛛捕食功能反应的影响；

(4)种群密度与种群动态比较：通过比较转Bt基因抗虫水稻与非转基因亲本对照稻田草间钻头蛛的发生动态，评价转Bt基因抗虫水稻的种植对该非靶标生物种群的影响；

采用对角线取样法，每小区面积为150m²，每次取5个样，每样0.25m²，6丛稻株；水稻移栽后30天开始用吸虫器取样，至水稻收割前10天，共取样5～7次；取样立即用75%的酒精保存，在体视镜下进行鉴定并计数，以统计草间钻头蛛种群密度及种群动态，并对不同水稻稻田之间参数的差异性进行统计分析，评价转Bt基因抗虫水稻对草间钻头蛛田间种群的安全性影响。

本发明通过水稻—褐飞虱—草间钻头蛛的食物链评价转Bt基因抗虫水稻通过猎物介导对草间钻头蛛的影响；采用ELISA检测手段鉴定草间钻头蛛暴露于Bt蛋白的途径和程度；通过对草间钻头蛛捕食功能参数的比较，评价转Bt基因抗虫水稻对该非靶标生物捕食功能是否产生不利影响；通过比较转Bt基因抗虫水稻与非转基因亲本对照稻田草间钻头蛛的发生动态，评价转Bt基因抗虫水稻对草间钻头蛛种群的影响。最终，根据4个方面的研究数据综合分析转Bt基因抗虫水稻的种植对该非靶标生物产生的生态后果。

本发明建立了一套系统、科学的评价方法，对完善转Bt基因抗虫水稻对非靶标生物的影响研究具有重要意义，对确定转Bt基因抗虫水稻种植的生态安全性具有重要意义。

附图说明

图1为分别以T2A-1与明恢63水稻饲养的褐飞虱若虫为猎物饲养的草间钻头蛛70天的存活曲线图，

图2、3分别为T2A-1水稻叶鞘组织，褐飞虱若虫及取食褐飞虱若虫的草间钻头蛛体内Cry2Aa蛋白含量图，

图4、5分别为T2A-1、明恢63稻田采集的草间钻头蛛的功能反应图，

图6、7、8、9、10分别为吸虫器法孝感2011年、2012年、2013年、随州2011年、2012年采集的转基因水稻与对照水稻田草间钻头蛛种群动态图。

具体实施方式

本发明的转Bt基因抗虫水稻选择转cry2Aa基因水稻T2A-1，其对鳞翅目害虫有很高的抗性，非转基因亲本选择对照明恢63水稻，转cry2Aa基因水稻T2A-1种子均由华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室提供。明恢63水稻、转cry2Aa基因水稻T2A-1于长×宽×高=25cm×20cm×3cm的栽培盘中以Yoshida营养液培育至大约15cm高后，用于评价试验。稻苗培育条件为温度（26±2℃），相对湿度（80%）。

本发明的供试褐飞虱采自湖北武汉稻田，并在室内分别于T2A-1与明恢63的稻苗建立种群，饲养10代以上。草间钻头蛛雌成蛛采自湖北孝感稻田，在室内用果蝇饲养产卵，下一代幼蛛用于试验。饲养条件为温度（28±1℃），相对湿度（70±5%），光暗比（L14h:D10h）。

本发明的评价方法由三级营养试验，蛋白传递规律，捕食功能反应以及种群密度与种群动态比较4个关键部分组成。下面分别进行详细说明。

(1)三级营养试验：通过水稻—褐飞虱—草间钻头蛛的食物链评价转基因抗虫水稻T2A-1通过猎物介导对草间钻头蛛的安全性影响。

草间钻头蛛二龄幼蛛于2cm×12cm指型管中单头饲养，管口塞以棉花，管底放一吸水海棉，以保持湿度与提供水源。分别以T2A-1与明恢63稻苗饲养的褐飞虱若虫作为食物饲喂草间钻头蛛，发育前期用低龄若虫，发育后期用高龄若虫，每日提供充足的食物与水源，并观察蜘蛛的蜕皮与存活情况，直至死亡或发育为成蛛；待蜘蛛发育成熟，用万分之一电子天平称重，然后雌雄配对，记录其产卵前期及第一个卵袋的含卵量；每个水稻材料处理供试蜘蛛150头。

选择草间钻头蛛的幼蛛发育历期、产卵前期、成蛛体重以及第一个卵袋含卵量作为评价参数指标，并进行统计分析，评价由褐飞虱若虫介导的转基因抗虫水稻T2A-1对草间钻头蛛的安全性影响。

以不同水稻材料饲养的褐飞虱若虫为猎物的草间钻头蛛生命表参数如表1所示，

表1

注：表中数据为平均数±标准误，括号中数字表示观测样本数。

同一行中，转Bt基因抗虫水稻T2A-1与对照水稻明恢63进行统计学比较，

^aU检验；^b学生t检验。

由表1可见，以不同水稻材料饲养的褐飞虱为猎物的草间钻头蛛其各项生命表参数均无显著性差异。Kaplan-Meier生存分析结果表明：以T2A-1饲养的褐飞虱若虫为猎物的草间钻头蛛与对照之间的生存曲线，无显著性差异(P=0.439)（图1）。

(2)蛋白传递规律：通过ELISA检测手段鉴定草间钻头蛛暴露于Cry2Aa蛋白的途径和程度。

于2L玻璃罐中分别放入15日龄不同水稻品种、系的稻苗，接入对应水稻材料饲养的褐飞虱若虫及草间钻头蛛雌成蛛，取食5天后，分别对15日龄水稻叶鞘，褐飞虱若虫以及草间钻头蛛进行取样，叶鞘30±1mg，褐飞虱若虫30±1mg，草间钻头蛛10头，采用ELISA技术，分别对以上样品中Cry2Aa蛋白的含量进行检测，确定通过食物链草间钻头蛛暴露于Cry2Aa蛋白的程度。ELISA检测前，要对蜘蛛体表用PBST缓冲液进行清洗，以除去体表吸附的Bt蛋白。

Cry2Aa蛋白在水稻—褐飞虱—草间钻头蛛食物链的传递规律如图2，图3所示，T2A-1叶鞘组织中Cry2Aa蛋白含量13.9±1.2μg/g鲜重，显著高于褐飞虱若虫（5.3±0.8ng/g）以及草间钻头蛛（0.9±0.2ng/g）体内的含量；而褐飞虱若虫体内Cry2Aa蛋白的含量又显著高于草间钻头蛛。对照品种明恢63的所有处理均未检测到Cry2Aa蛋白。

以上结果表明，Cry2Aa蛋白在食物链不同营养级中逐级递减。

(3)捕食功能反应：通过比较转基因抗虫水稻T2A-1与非转基因亲本对照品种明恢63稻田采集的草间钻头蛛捕食功能参数，评判T2A-1对该非靶标生物的影响。

于T2A-1和明恢63水稻材料的稻田分别采集25头大小相似的健康草间钻头蛛雌成蛛，试验之前只给草间钻头蛛雌成蛛提供水，不提供猎物，使其饥饿24小时；在2cm×12cm玻璃管底部放置含水海棉，移入4根15日龄稻苗，按照5、10、20、30、40头/管的密度接入已在T2A-1、明恢63水稻上饲养的1～2龄褐飞虱若虫，再放入1头草间钻头蛛雌成蛛，每个密度处理重复5次，24小时后考察各玻璃管中的褐飞虱被捕食的情况。

选择草间钻头蛛的瞬时攻击率和处理猎物时间作为评价参数指标，并进行统计分析，评价转基因抗虫水稻T2A-1对草间钻头蛛捕食功能反应的影响。

来自不同水稻材料的草间钻头蛛对褐飞虱若虫的功能反应均符合HollingⅡ型反应（见图4，图5）。对HollingⅡ型反应圆盘方程中2个参数的统计分析表明，来自转基因水稻T2A-1与对照品种水稻明恢63稻田的草间钻头蛛对褐飞虱捕食功能反应的参数，瞬时攻击率和处理猎物时间都无显著性差异（见表2）。

表2

注：a：瞬时攻击率；Th：处理猎物时间。相同参数比较采用学生t检验。

以上结果表明：转基因抗虫水稻T2A-1对草间钻头蛛捕食功能反应无显著性影响。

(4)转cry2Aa基因水稻对草间钻头蛛田间种群的影响

试验设计与田间管理：试验地点选择湖北省内稻作区具有代表意义的两个地点：孝感及随州，分别于2011～2013年进行田间试验，采用完全随机区组设计，每小区150m²（10m×15m），每个水稻材料重复4次。单本插秧，小区间留有1米宽的隔离带，整个试验区四周种留有保护行（0.5m）。肥水管理按常规操作，但整个水稻生育期不施用任何农药。

取样与物种鉴定：

吸虫器：利用华盛泰山背负式超低量喷雾机，仿照刘雨芳等（1999）改装而成，其中附加结构由进风口导罩、集虫网、两根软管（Ф60cm×100cm）、采样框（50×50×120cm）组成，集虫网为市售100目尼龙纱网，置于出风口。

调查方法：改装的吸虫器由两人进行操作，一人背负吸虫器，另一人卸装集虫网和安置采样框。采用对角线取样法，每小区面积150m²，每小区每次调查5个样，每样0.25m²，约6丛稻株。从水稻移栽后约30天开始调查，每10天左右取样1次，至水稻收割前10天左右，一般调查5～7次。

分类和鉴定：取样立即用75%的酒精保存，携回室内后，除去杂物，挑出的节肢动物再用80%酒精保存，然后在体视镜下进行鉴定并计数。在此基础上，统计草间钻头蛛种群密度及种群动态，并对两种水稻稻田之间参数的差异性进行统计分析，评价转基因抗虫水稻T2A-1对草间钻头蛛田间种群的安全性影响。

种群密度比较结果如表3所示，湖北稻区广谱性捕食性天敌草间钻头蛛不同地区发生量相差较大，相同地点相同年份两种水稻稻田种群密度差异均不显著（P>0.05）。从不同取样时段的种群发生动态也可以看出，草间钻头蛛在两种水稻稻田的发生趋势相似，所有取样时间点差异均不显著；Repeated measures ANOVA分析结果同样表明两种水稻稻田草间钻头蛛种群动态无显著性差异（图6.孝感2011年；图7.孝感2012年；图8.孝感2013年；图9.随州2011年；图10.随州2012年）。

可见，转基因抗虫水稻T2A-1的种植对田间草间钻头蛛种群无负面效应。

表3

注：表中数据为平均数±标准误。相同地点相同年份采用学生t检验。

种群密度即整个水稻生育期所采集草间钻头蛛数量的平均数。

综合三级营养生命表参数，蛋白传递规律，捕食功能反应以及田间调查结果分析，证明了转cry2Aa基因水稻T2A-1对草间钻头蛛的生态安全性。

Claims (4)

1.转基因抗虫水稻对捕食性天敌草间钻头蛛安全性评价方法，其特征在于包括如下4个部分：

(1)三级营养试验：通过水稻—褐飞虱—草间钻头蛛的食物链评价转Bt基因抗虫水稻通过猎物介导对草间钻头蛛的安全性影响；

草间钻头蛛二龄幼蛛于指型管中单头饲养，管口塞以棉花，管底放一吸水海棉，分别以不同水稻材料稻苗饲养的褐飞虱若虫作为食物饲喂草间钻头蛛，发育前期用低龄若虫，发育后期用高龄若虫，每日提供充足的食物与水源，并观察蜘蛛的蜕皮与存活情况，直至死亡或发育为成蛛；待蜘蛛发育成熟，用万分之一电子天平称重，然后雌雄配对，记录其产卵前期及第一个卵袋的含卵量；每个水稻材料处理供试蜘蛛150头；

选择草间钻头蛛的幼蛛发育历期、产卵前期、成蛛体重以及第一个卵袋含卵量作为评价参数指标，并进行统计分析，评价由褐飞虱若虫介导的转Bt基因抗虫水稻对草间钻头蛛的安全性影响；

(2)蛋白传递规律：通过ELISA检测手段鉴定草间钻头蛛暴露于Bt蛋白的途径和程度；

于玻璃罐中分别放入15日龄不同水稻品种、系的稻苗，接入对应水稻材料饲养的褐飞虱若虫及草间钻头蛛雌成蛛，取食5天后，分别对水稻叶鞘，褐飞虱若虫，草间钻头蛛进行取样，叶鞘30±1mg，褐飞虱若虫30±1mg，草间钻头蛛10头；每个处理重复4～5次；

采用ELISA技术，分别对以上样品中Bt蛋白的含量进行检测，确定通过食物链草间钻头蛛暴露于Bt蛋白的程度；

(3)捕食功能反应：通过比较转Bt基因抗虫水稻与非转基因亲本对照品种稻田采集的草间钻头蛛捕食功能参数，评判转Bt基因抗虫水稻对该非靶标生物的影响；

于种植不同水稻材料的稻田分别采集25头大小相似的健康草间钻头蛛雌成蛛，试验之前只给草间钻头蛛雌成蛛提供水，不提供猎物，使其饥饿24小时；在玻璃管底部放置含水海棉，移入4根15日龄稻苗，按照5、10、20、30、40头/管的密度接入已在不同水稻材料上饲养的1～2龄褐飞虱若虫，再放入1头草间钻头蛛雌成蛛，每个密度处理重复5次，24小时后考察各玻璃管中的褐飞虱被捕食的情况；

选择草间钻头蛛的瞬时攻击率和处理猎物时间作为评价参数指标，并进行统计分析，评价转Bt基因抗虫水稻对草间钻头蛛捕食功能反应的影响；

(4)种群密度与种群动态比较：通过比较转Bt基因抗虫水稻与非转基因亲本对照稻田草间钻头蛛的发生动态，评价转Bt基因抗虫水稻的种植对该非靶标生物种群的影响；

采用对角线取样法，每小区面积为150m²，每次取5个样，每样0.25m²，6丛稻株；水稻移栽后30天开始用吸虫器取样，至水稻收割前10天，共取样5～7次；取样立即用75%的酒精保存，在体视镜下进行鉴定并计数，以统计草间钻头蛛种群密度及种群动态，并对不同水稻稻田之间参数的差异性进行统计分析，评价转Bt基因抗虫水稻对草间钻头蛛田间种群的安全性影响。

2.根据权利要求1所述的转基因抗虫水稻对捕食性天敌草间钻头蛛安全性评价方法，其特征在于转Bt基因抗虫水稻选择转cry2Aa基因水稻T2A-1。

3.根据权利要求1或2所述的转基因抗虫水稻对捕食性天敌草间钻头蛛安全性评价方法，其特征在于转cry2Aa基因水稻T2A-1于长×宽×高=25cm×20cm×3cm的栽培盘中以Yoshida营养液培育至15cm高。

4.根据权利要求1所述的转基因抗虫水稻对捕食性天敌草间钻头蛛安全性评价方法，其特征在于草间钻头蛛二龄幼蛛于2cm×12cm指型管中单头饲养。