CN103930446A - 表面涂布假单胞菌菌毛蛋白肽的结构 - Google Patents

表面涂布假单胞菌菌毛蛋白肽的结构 Download PDF

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Abstract

本发明涉及方法和组合物，其中使D型或逆-倒位假单胞菌菌毛蛋白肽，任选具有共价连接到所述肽的聚乙二醇部分，结合到基底。所公开的方法和组合物可用于减少摩擦系数，抑制非假单胞菌的生物膜形成，用于减少针对材料的炎性反应，用于减少金属腐蚀，并可用于生物传感器应用中。

Description

表面涂布假单胞菌菌毛蛋白肽的结构
发明领域
本发明涉及采用D型或逆-倒位(retro-inverso)IV型铜绿假单胞菌(P. aeruginosa) (T4P)菌毛蛋白肽的材料涂层的领域，所述菌毛蛋白肽任选缀合到聚乙烯部分；并涉及其方法和应用。
背景
细菌的IV型菌毛是宿主群集(colonization)和毒力(对于许多革兰氏阴性菌而言)所必需的，并且还可能在一些革兰氏阳性菌的发病机理中起作用。IV型菌毛从细菌表面伸出并介导与生物和非生物表面的特异性附着。负责这种结合的菌毛结合结构域在位于该蛋白的C-末端区的12-17二硫环区(disulfide-loop)内编码，而仅含有该区的合成肽例如由来自铜绿假单胞菌IV型菌毛蛋白的残基128-144组成的二硫环肽已显示与生物和非生物表面结合。
本发明人和同事们最近已经证明，菌毛蛋白衍生的蛋白纳米管(PNT)以高亲和力结合到不锈钢，并且该结合事件显示出是C-末端端结合的(tip-associated)，通过对应于IV型菌毛蛋白肽结合结构域的合成肽竞争性抑制PNT结合来进行(Yu, B.等人, J. Bionanoscience, 1:73-83 (2007)。随后本发明人和同事们进一步证明，衍生自C-末端受体结合结构域的菌毛蛋白肽，当结合到非生物表面(例如不锈钢、锡、铝、钛、铬、塑料、玻璃、硅酸盐、陶瓷及其混合物)时，能够抑制该涂布的表面上细菌生物膜的形成(U.S. 20080287367)。
最近，本发明人已发现，含有衍生自IV型铜绿假单胞菌(T4P)菌毛蛋白C-末端受体结合蛋白的二硫环的合成菌毛蛋白肽与一些金属的结合显著增强金属的某些纯粹的表面性质，即，独立于生物膜形成的性质，且在一些金属中改变表面的电子性质，以一定方式使其可用于例如生物传感器应用中(USSN 12/899,958)。
发明概述
一方面，本发明包括处理管道以减少流过该管道的流体的摩擦拽力的方法，即通过向所述管道引入携带缀合物的液体的步骤，所述缀合物是以下的缀合物：(i)含有衍生自IV型铜绿假单胞菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受体结合蛋白的二硫环和含有位于所述环的N-末端侧或C-末端侧或这两末端侧的0-10个额外残基的D型或逆-倒位的合成菌毛蛋白肽和(ii)聚乙二醇部分，所述缀合物的量有效地通过使菌毛蛋白肽附着于管道壁而减少流过管道的流体的摩擦拽力。
所述菌毛蛋白肽缀合物可以是具有共价连接于所述肽的C-末端或N-末端的一端或两端的聚乙二醇部分的D型菌毛蛋白肽。所述肽缀合物中的聚乙二醇部分可具有介于0.2-500 kDal之间的分子量。所述菌毛蛋白肽可以具有确定为SEQ ID NO:10的序列，包括确定为SEQ ID NO: 3、4或9的示例性序列。
所述菌毛蛋白肽缀合物所附着的管道内表面可以是金属、聚合物、陶瓷或硅酸盐表面。示例性的金属包括不锈钢、碳钢、钛、铜、黄铜、锡、铁、银、和镁及其合金。
附着于管道内壁的菌毛蛋白肽缀合物的量或表面密度可足以降低可腐蚀的金属例如不锈钢的腐蚀速率，和/或足以减少流体的摩擦拽力，所述流体例如引入管道中的含砂浆液。
可通过在正常操作期间将所述肽缀合物定期加入到引入管道中的流体中，将菌毛蛋白肽缀合物引入管道中。
另一方面，本发明包括具有用缀合物涂布的一个或多个暴露的金属、聚合物、陶瓷或硅酸盐表面的制品，所述缀合物是以下的缀合物：(i)含有衍生自IV型铜绿假单胞菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受体结合蛋白的二硫环和含有位于所述环的N-末端侧或C-末端侧或这两末端侧的0-10个额外残基的D型或逆-倒位的合成菌毛蛋白肽和(ii)聚乙二醇部分，所述缀合物的量足以减少所述一个或多个暴露表面的摩擦系数。示例性的菌毛蛋白肽如上所述。
所述制品的一个或多个暴露表面可以是金属表面，例如不锈钢、碳钢、钛、铜、黄铜、锡、铁、银、和镁及其合金的表面，并且涂布所述表面的肽缀合物可以足以降低所述表面的腐蚀速率，和/或足以减少流过所述管道的流体的摩擦拽力的量存在。
在一个实施方案中，所述制品是宽度尺寸为100微米或更小的微流体通道，其内壁表面用肽缀合物涂布并且涂布该表面的肽缀合物以足以减少流体流过所述通道的摩擦拽力的量存在。
在第2个实施方案中，所述制品包括砂颗粒，其外表面用足量的所述肽缀合物涂布，以减少该涂布的颗粒浆液流过管道的摩擦拽力。
在第3个实施方案中，所述制品是具有活动件的机器，其涂布肽的表面是彼此移动接触的。
在第4个实施方案中，所述制品是具有用所述肽缀合物涂布的暴露的金属表面的电子器件或元件。
在第5个实施方案中，所述制品是具有不锈钢或钛表面的矫形植入器件，并且涂布该表面的所述肽缀合物以足以抑制该涂布表面上生物膜形成的量存在。
再一方面，本发明包括一种制品，所述制品包括(i)具有暴露的表面的元件，所述表面可在普通使用条件下被非假单胞菌细菌用作生物膜形成的基底，和(ii)与所述表面结合的D型或逆-倒位的合成菌毛蛋白肽，所述合成菌毛蛋白肽含有衍生自IV型铜绿假单胞菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受体结合蛋白的二硫环和含有位于所述环的N-末端侧或C-末端侧或这两末端侧的0-10个额外残基，和任选共价连接于所述肽的聚乙二醇部分，所述肽的量有效地抑制这类非假单胞菌细菌的生物膜形成。示例性的被抑制的细菌包括利斯特氏菌(Listeria)或葡萄球菌(Staphylococcus)。
再一方面，本发明包括在处理具有暴露的晶粒边界区的表面的金属材料的方法中为了降低所述材料的腐蚀速率的改进。所述改进包括：使所述材料中的暴露的表面边界区与D型或逆-倒位的合成菌毛蛋白肽接触，所述合成菌毛蛋白肽含有衍生自IV型铜绿假单胞菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受体结合蛋白的二硫环和含有位于所述环的N-末端侧或C-末端侧或这两末端侧的0-10个额外残基，和任选共价连接于所述肽的聚乙二醇部分，所述肽的量有效地抑制所述材料的腐蚀速率。示例性的金属包括不锈钢、碳钢、钛、铜、黄铜、锡、铁、银、和镁及其合金。示例性的菌毛蛋白肽和菌毛蛋白肽缀合物如上所述。
结合到所述金属的肽或肽缀合物的量可有效使暴露的晶粒边界区的电子功函变化至少0.3 eV EFW单位并使暴露的晶粒边界区的硬度增加至少20%，所述硬度通过用原子力显微镜的尖端以给定力冲击(striking)金属表面产生的纳米压痕来测定。当金属是不锈钢时，结合的肽或结合的肽缀合物的量可有效使涂布表面的腐蚀速率降低至少约30%，所述腐蚀速率通过穿过表面的腐蚀电流来测定。
当金属材料是多孔或网状的时，可实施接触步骤以使菌毛蛋白肽与由所述材料内的孔或网眼确定的内表面结合。当金属材料具有暴露的晶粒边界区时，接触步骤可有效使菌毛蛋白肽与所述晶粒边界区选择性地结合，由此通过优先保护在其晶粒边界区处的表面来增强金属表面的硬度和腐蚀抗性。
还公开的是抑制对设计成植入受试者内的医疗器件的炎性反应的方法。所述方法包括：在植入所述器件之前，用合成菌毛蛋白肽涂布所述器件的暴露的表面，所述合成菌毛蛋白肽含有(i)衍生自IV型铜绿假单胞菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受体结合蛋白的二硫环，(ii)位于所述环的N-末端侧或C-末端侧或这两个末端侧的0-10个额外残基，和(iii)由逆-倒位(RI)型的D-氨基酸组成，和任选具有共价连接于所述肽上的聚乙二醇部分。优选的肽和肽缀合物如上所述。
另一方面，本发明包括用于检测分析物的生物传感器器件。所述器件包括：(a)导电金属基底，其具有(i)生物传感器表面(ii)与所述基底表面结合的D型(RI)合成菌毛蛋白肽，所述合成菌毛蛋白肽含有衍生自IV型铜绿假单胞菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受体结合蛋白的二硫环和含有位于所述环的N-末端侧或C-末端侧或这两末端侧的0-10个额外残基，和任选具有共价连接于所述肽的聚乙二醇部分，和(iii)直接或间接地共价连接于所述菌毛蛋白肽的受体，和(b)用于检测响应分析物相关配体与表面结合的受体的结合的穿过基底表面的电学性质变化的检测器。
所述生物传感器基底可以由不锈钢形成，并且结合在其上的菌毛蛋白肽可以是D型菌毛蛋白肽，任选缀合到聚乙二醇部分。在一个实施方案中，可以使用菌毛蛋白肽的组合，例如，使用PEG-D-菌毛蛋白肽缀合物以减少与样品化合物的非特异性相互作用，和RI-菌毛蛋白肽(有或没有PEG部分)以将靶配体连接到生物传感器表面，或者直接通过配体与肽的共价连接或通过间接方式，如下所述。
所述受体可以通过卷曲螺旋E/K螺旋对而共价连接于菌毛蛋白肽，所述螺旋对中的一个共价连接于菌毛蛋白肽，而另一个则连接于受体上。
再一方面，本发明包括使化合物共价连接于由不锈钢、锡、铁或钛形成的基底的一个或多个暴露表面的方法，所述方法通过以下步骤：(a)使所述基底的一个或多个暴露表面与D型合成菌毛蛋白肽接触，所述合成菌毛蛋白肽含有衍生自IV型铜绿假单胞菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受体结合蛋白的二硫环和含有位于所述环的N-末端侧或C-末端侧或这两末端侧的0-10个额外残基，和任选具有共价连接于所述肽的聚乙二醇部分，由此使所述菌毛蛋白肽共价地结合到一个或多个暴露表面，和(b)在所述接触和结合之前或之后，使所述化合物共价连接于所述菌毛蛋白肽，或者，连接于PEG-菌毛蛋白-肽缀合物中的PEG部分。优选的菌毛蛋白肽和肽缀合物如上所述。
当基底表面具有暴露的晶粒边界区时，所述接触步骤有效使所述化合物优先定位在暴露的晶粒边界区处。当所述材料是多孔或网状的时，所述接触步骤可有效使所述菌毛蛋白肽与由所述材料内的孔或网眼确定的内表面结合。
还公开的是基底，其表面结合有(i) D型合成菌毛蛋白肽，所述合成菌毛蛋白肽含有衍生自IV型铜绿假单胞菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受体结合蛋白的二硫环和含有位于所述环的N-末端侧或C-末端侧或这两末端侧的0-10个额外残基，和任选具有共价连接于所述肽的聚乙二醇部分，和(ii)化合物，所述化合物直接或间接地共价连接于所述菌毛蛋白肽或连接于PEG-菌毛蛋白肽缀合物中的PEG部分。
所述基底可以是金属，例如不锈钢、碳钢、钛、铜、黄铜、锡、铁、银、和镁及其合金，并且可以用作生物传感器电响应元件，其中所述化合物是通过共价键直接连接于所述菌毛蛋白肽或通过K/E螺旋的/螺旋对间接连接于所述菌毛蛋白肽的分析物受体分子，其中所述螺旋中的一个共价连接于所述菌毛蛋白肽，而另一个螺旋共价连接于所述化合物。不锈钢基底可由于与其表面结合的菌毛蛋白肽而具有改变的电子功函。
当阅读以下详述以及附图时，本发明的这些和其它目标和特征将会更加显而易见。
附图简述
图1A-1D显示多个细菌属/种/菌株中IV型铜绿假单胞菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受体结合结构域的序列；
图2A和2B的图显示对未涂布的不锈钢或用L型K122-4(2A)和PAO (2B)菌毛蛋白肽涂布的不锈钢进行的粘合力(adhesive force)测量；
图3A和3B的图显示未涂布的不锈钢或用L型K122-4 (3A)和PAK (3B)菌毛蛋白肽涂布的不锈钢的电子功函(EWF)；
图4显示在两个月时期内得到的涂布和未涂布的不锈钢的EWF测量结果；
图5显示在800 nM负荷下涂布肽的和未涂布的不锈钢的力位移(force-displacement)曲线；
图6A和6B显示在20 μN (6A)和50 μN (6B)负荷下进行的纳米压痕试验的结果；
图7A和7B是在增加负荷下的涂布肽的(7A中是PAO，7B中是K122-4)和未涂布的不锈钢的位移测量图；
图8A和8B是未涂布的(8A)和涂布T4P17菌毛蛋白肽(8B)的不锈钢基底与AFM尖端之间的电流的导电率AFM表面图；
图9A-9B是涂布的和未涂布的不锈钢表面的腐蚀特性的测量，显示涂布菌毛蛋白的不锈钢的腐蚀电流(Icorr)显著小于未涂布的不锈钢的腐蚀电流(9A)，涂布菌毛蛋白的和未涂布的不锈钢的腐蚀电位(Ecorr)没有显著区别(9B)；
图10A和10B的图显示涂布菌毛蛋白的不锈钢的腐蚀速率显著低于未涂布的不锈钢(10A)，与未涂布的不锈钢相比，抗极化性显著更高(10B)；
图11显示，当菌毛蛋白肽与另一个肽(在此例子中，亮氨酸-拉链型E螺旋或E/K卷曲螺旋)缀合时，与金属表面结合的菌毛蛋白肽的腐蚀抑制作用可逆转；
图12A-12C的照片显示未涂布的(12A)、用菌毛蛋白肽涂布的(12B)或用具有连接于菌毛蛋白的螺旋-螺旋双链体的菌毛蛋白肽涂布的不锈钢样品上的腐蚀的视觉效应；
图13显示，在采用增加量的外源肽的竞争性结合分析中，已结合的菌毛蛋白肽没有被从不锈钢表面置换；
图14是未涂布的和涂布K-122-4菌毛蛋白肽的不锈钢样品的XPS图；
图15A和15B显示涂布L-型和D-型菌毛蛋白肽两者的不锈钢样品的粘合力测量结果(15A)和涂布相同的L-型和D-型菌毛蛋白肽的不锈钢样品的EWF力测量结果(15B)；
图16A和16B显示菌毛蛋白肽(D-型)与不锈钢支架(16A)和与玻璃表面(16B)紧密结合的能力；
图17A和17B的柱形图显示与不锈钢样品结合的L-氨基酸和D-氨基酸菌毛蛋白对蛋白酶消化的相对抗性；
图18A和18B的示意图显示根据本发明的一个实施方案构建的生物传感器器件的运行；
图19说明生物传感器中的分析物结合步骤，其中，分析物结合试剂R通过菌毛蛋白肽直接连接于生物传感器表面；
图20说明生物传感器中的分析物结合步骤，其中，分析物结合试剂R通过菌毛蛋白肽卷曲螺旋复合物连接于生物传感器表面；
图21显示本发明的生物传感器中的不同检测构型；
图22A和22B是结合分析物与受体结合之前和之后在生物传感器器件中记录的循环伏安法图，其中，22B是图22A中矩形面的放大图；
图23A和23B说明根据本发明的一个更一般性实施方案构建的分析物检测器件；
图24A-24D是柱形图，显示T4P17菌毛蛋白肽与不锈钢(24A)、冠状支架(24B)、Foley (乳胶)导管(24C)和中央静脉(硅酮)导管(24D)的结合；
图25A和25B是蛋白质印迹(25A)和柱形图(25B)，显示D-菌毛蛋白肽涂层对针对未涂布的和涂布菌毛蛋白的钛或不锈钢表面的PBMC免疫反应的影响；
图26A和26B显示蛋白质印迹(26A)和柱形图(26B)，显示D-菌毛蛋白肽涂层对针对未涂布的和涂布菌毛蛋白的钛或不锈钢表面的人巨噬细胞免疫反应的影响；
图27A-27D显示用多种形式的K122-4菌毛蛋白肽涂布的不锈钢的特征，K-122-4的borg sEWF，对于EWF (27A和27B)、纳米压痕(27C)和腐蚀速率(27D)；
图28A-28C是显示未涂布的钛或者涂布D型、逆-倒位或D型-PEG菌毛蛋白肽的钛的电子功函(EWF)的图；
图29显示在未涂布的或者涂布D型、逆-倒位或D型-PEG菌毛蛋白肽的钛表面上的表面显微压痕作用；
图30A-30E显示以指定的力水平在钛板上的大块(bulk)显微压痕作用；
图31A和图31B显示在钛板上测定的粘合力(图31A)，以及在不锈钢板上测定的腐蚀速率(31B)，这两者是对于未涂布的或涂布PEG-D型菌毛蛋白肽的板而言；
图32A-32E是未涂布的钛(31A)、涂布PEG-D型菌毛蛋白肽的钛(32B)、涂布逆-倒位型的菌毛蛋白肽的钛(32C)、涂布D型菌毛蛋白肽的钛(32D)、以及涂布逆-倒位和D型菌毛蛋白肽的组合的钛(32E)的代表性的摩擦系数图；
图33A-33F表示比较L-菌毛蛋白肽、RI-菌毛蛋白肽和D型肽与不同材料结合的数据，所述材料包括不锈钢(33A，部分1-9和28B)、钛(33C，部分A和B)、聚氨酯(33D)、聚砜(33E，部分A和B)和硅酮(33F)；
图34显示当施加50 mA电流达10分钟时，结合对照(bound control, Ig)肽、L型菌毛蛋白肽(L)、RI菌毛蛋白肽(RI)和D型菌毛蛋白肽从不锈钢表面的相对损失；
图35A-35D的图显示无害利斯特氏菌(Listeria innocua)的不同菌株(35A)和单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)的3个菌株(35B-35D)的细菌对涂布D型菌毛蛋白肽、RI菌毛蛋白肽或D+RI菌毛蛋白肽的不锈钢板、或未涂布的对照的生物膜抑制程度；
图36A-36F的图显示不同种的葡萄球菌(Staphylococcus)细菌对涂布D型菌毛蛋白肽、RI菌毛蛋白肽、或D+RI菌毛蛋白肽的不锈钢板、或未涂布对照的生物膜抑制程度；和
图37A-37C显示施加到不锈钢的非常小一滴PEG-D-菌毛蛋白肽的细菌抑制作用。
发明详述
I. 定义
“菌毛”是在许多细菌的表面上发现的毛状附器。
菌毛蛋白是用于菌毛的蛋白亚基的通称。
“IV型铜绿假单胞菌(T4P)菌毛蛋白”或“T4P菌毛蛋白肽”或“菌毛蛋白肽”是指铜绿假单胞菌细菌用于产生能动力的菌毛结构，通过使菌毛的末梢附着于生物的或非生物的表面并收缩菌毛以便拖动细菌向前来实现。所有IV型铜绿假单胞菌(T4P)菌毛都含有C-末端受体结合区，其氧化形式含有可归类为12-残基环或17-残基环的二硫环。图1显示其C-末端菌毛蛋白区已测序的多个细菌种的二硫环区。
“衍生自IV型铜绿假单胞菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受体结合蛋白的二硫环”是指其氨基酸序列对应于已知的细菌二硫环氨基酸序列的二硫环，所述已知的细菌二硫环氨基酸序列例如通过SEQ ID NO:4确定的铜绿假单胞菌菌株PAK序列，或者作为两个或更多个不同的细菌种和/或细菌菌株之间二硫环序列中的一个或多个氨基酸变化的置换形成的序列之一，例如SEQ ID NO: 10中含有的序列之一，其作为四个铜绿假单胞菌菌株PAK、PAO、PA82935和K-122-4的二硫环序列的组合形成。
“合成肽”指通过固相或重组肽合成而形成的肽。
“由不锈钢、锡、铁或钛形成的基底”意指由不锈钢、锡、铁或钛或这些金属中的两种或更多种的混合物形成的金属基底，或用不锈钢、锡、铁或钛或它们的混合物涂布的金属或非金属基底。基底可以含有小比例的其它金属，尤其是来自周期表第4-6行、第9-12列的过渡金属，包括钴、镍、铜、锌、钌、铑、钯、银、镉、锇、铂、金、铬(存在于不锈钢中)和汞。
“T4P菌毛蛋白肽与由不锈钢、锡、铁或钛形成的金属基底的共价连接”意指菌毛蛋白肽通过键连接于金属表面，其(i)抵抗被游离的菌毛蛋白肽置换，且(ii)具有变化的电子功函(EWF)，表明材料的表面电子轨道(e-orbital)发生变化。菌毛蛋白肽与此类金属基底的共价连接还可表征为：(i)表面粘合力的改变、(ii)表面硬度的改变、(iii)导电率的改变和/或(iv)结合能峰的改变(通过X-射线光电子光谱法(XPS)观察到的)。
“具有共价结合的化合物的金属基底”表示具有与基底表面共价结合的T4P菌毛蛋白肽，和与菌毛蛋白肽直接或间接共价结合的不是菌毛蛋白的蛋白质另一部分的化合物的不锈钢、锡、铁或钛基底。当化合物通过高亲和力结合对(例如卷曲螺旋亮氨酸-拉链对、生物素-抗生物素蛋白对，等等)与菌毛蛋白肽连接时，其中，所述对的一个成员与菌毛蛋白肽共价连接，而另一个成员与化合物共价连接；化合物与T4P菌毛蛋白肽间接共价结合。
金属基底的“暴露的晶粒边界区”指出现晶粒边界，即，形成基底的金属原子的两个多晶取向的界面处的基底的表面区。
“使菌毛蛋白肽优先定位于暴露的晶粒边界区”是指，菌毛蛋白肽和共价连接于菌毛蛋白肽的任意化合物在晶粒边界区比在晶粒边界区之间的暴露表面区具有更大的分子浓度和/或更大的表面涂层厚度。
“L型T4P菌毛蛋白肽”或“L型菌毛蛋白肽”是指由L-对映体的氨基酸残基(L-氨基酸残基)组成的T4P菌毛蛋白肽。
“D型T4P菌毛蛋白肽”或“D型菌毛蛋白肽”是指主要或排他地由D-对映体的氨基酸残基(D-氨基酸残基)组成的T4P菌毛蛋白肽。具体地讲，D型T4P菌毛蛋白肽含有大于50% D-氨基酸残基，和优选全为D-氨基酸，其中任何其余残基为L-氨基酸。D型T4P菌毛蛋白肽是抗蛋白酶的，并且该肽中的任何L-对映体的氨基酸应当位于菌毛蛋白肽序列内，使得它们不会显著损害该蛋白酶抗性。可如下确定这些位置：通过在各个可能的位置上形成具有单个L-氨基酸取代的一系列D型菌毛蛋白肽并测试单取代肽对于各种蛋白酶的抗性。
“逆-倒位T4P菌毛蛋白肽”或“逆-倒位菌毛蛋白肽”或“RI菌毛蛋白肽”是指具有D-对映体的氨基酸残基的倒转序列的T4P菌毛蛋白肽，其将该氨基酸侧链放置在正确的相对位置中，如下所述。逆-倒位T4P菌毛蛋白肽是抗蛋白酶的。
“聚乙二醇”或“PEG”是指线状或分支的乙二醇聚合物，并且可包括少至5个单体单元和至多数千个单元，分子量范围介于0.2 kD至500 kD之间或更高，其中所指定的大小是指PEG的平均分子量。“聚乙二醇部分”是指如上所述的菌毛蛋白肽和聚乙二醇的“缀合物”的聚乙二醇部分(portion或moiety)。所述缀合物通常是共价缀合物，其中聚乙二醇部分共价连接于菌毛蛋白肽的C-末端和/或N-末端氨基酸。
II. 菌毛蛋白肽
图1A-1D显示序列信息可获得的各种细菌属/种/菌株的含二硫环的C-末端菌毛蛋白肽区的序列。给出的序列包括二硫环序列(以半胱氨酸残基(C)开始和结束)并在一些情况下包括在所述环任意一侧的至多5个或更多个残基。单字母氨基酸命名根据标准惯例。在肽的正常氧化形式中，肽含有在半胱氨酸残基之间的二硫桥。
本发明中采用的合成肽包括或衍生自图1A-1D中显示的一个或多个序列。当序列包括所显示序列中的一个时，其可以包括单独的二硫环，或者所述环可以另外包括在环的N-末端侧或C-末端侧中任意一侧或这两侧的至多10个、优选5个或更少的残基，其中，附加的非环残基典型地包括或衍生自一个或多个相邻的非环序列。更一般地，环区和非环区的序列都可通过使这些序列(优选地在二硫环中具有相同或几乎相同数量的残基的序列)排成一行而衍生自两个或更多个序列。例如，在图1A中，对应于铜绿假单胞菌菌株PAO (SEQ ID NO: 3)、PAK (SEQ ID NO: 4)、PA82935 (SEQ ID NO: 7)和K122-4 (SEQ ID NO: 9)的四个肽含有14-聚体(mer)二硫环。通过使来自图1A中的四种铜绿假单胞菌菌株的二硫环序列排成一行，形成了组合的序列K/A/S/T-C-T/K/A-S/T-D/T/N-Q/V/A-D/E-E/IP/A/N-Q/M/K-F/Y-I/T/R/L-P-K/N-G/T--C-S/D/T/Q/N-K/N/D/T (SEQ ID NO:10)。该17-残基的肽(也一般称为T4P17)包括14个二硫环残基，单个上游(N-末端侧)非环残基和两个下游非环残基。该序列内的示例性序列包括衍生出SEQ ID NO: 10的实际4个不同的序列，即，对应于PAK (SEQ ID NO: 3)、 PAO (SEQ ID NO: 4)、PA82935 (SEQ ID NO: 7)和K-122-4 (SEQ ID NO: 9)的序列。
作为另一个实例，2个铜绿假单胞菌菌株G7-09 (SEQ ID NO:1)和PA110594 (SEQ ID NO:2)形成复合序列S/T-I-D-W-G/A-C-A/T-S-D/A-S-N-A-V/T-S/--S--G/A-T-D/A-R/Q-N/G-M/F-P/T-A/G-L/M-T/A-A-G-T/S-L/V-P-A/Q-R/E-F-A-P-S/A-E/Q-C-R (SEQ ID NO:21)。
一旦选择了菌毛蛋白肽序列，其可通过标准的重组合成法或固相合成法而合成。例如，由pRLD-E质粒重组表达E-螺旋(E-coil) PAK (128-144) ox，其中，利用合成的寡聚核苷酸符合读框的剪接PAK(128-144) ox DNA序列与E-螺旋并根据已知的技术在大肠杆菌(E. Coli)菌株BL-21中表达(参见例如Giltner等人，Mol. Microbiology (2006) 59 (4) :1083和其中引用的参考文献)。通过金属亲和色谱纯化所表达的肽，通过质谱法和N-末端蛋白测序证实纯度和二硫桥的形成。
在本发明的一个一般性实施方案中，菌毛蛋白肽包含D-氨基酸，并且如上所述，可含有一个或多个L-氨基酸，只要L-氨基酸是少数部分(少于50%残基)并且不会明显损害肽的蛋白酶抗性。在菌毛蛋白肽中包括D-氨基酸的一个目的是增加肽对于由肽可能接触到的一种或多种蛋白酶导致的蛋白水解的抗性。例如，假单胞菌属细菌具有一系列蛋白酶，包括弹性蛋白酶、金属蛋白酶和典型的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，在肽裂解中需要其靶向赖氨酸和/或精氨酸残基。因此，可合成菌毛蛋白肽以含有D-赖氨酸，例如在K122-4菌毛蛋白肽中的K136和K140处。优选地，在制备对尽可能多的蛋白酶具有抗性的肽中，菌毛蛋白肽应该完全由D-氨基酸形成。可通过常规的固相法，在合成中利用活化的D-或L-型氨基酸试剂形成全部由D-氨基酸组成或由D-和L-氨基酸的混合物组成的菌毛蛋白肽。(参见例如Guichard, G., 等人, Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 第91卷, 第9765-9769页, 1994年10月)。
正如以下将会看到的，与L型菌毛蛋白肽相比，D型菌毛蛋白肽在作为表面涂布剂时具有重要优势。首先，尽管L型T4P菌毛蛋白肽有效抑制假单胞菌所导致的生物膜形成，但是D型菌毛蛋白肽对于假单胞菌所导致的生物膜形成提供更优良的抑制，并对于非假单胞菌(例如利斯特氏菌和葡萄球菌)所致的生物膜形成提供显著更强的抑制。其次，尽管L型T4P菌毛蛋白肽以高亲和力有效结合各种材料，包括多种金属、聚合物、硅酸盐和陶瓷，但是当将材料暴露于蛋白酶时，和在导电材料的情况下当将电流施加到材料时，D型肽通常提供显著更稳定的结合。
在另一个一般性实施方案中，菌毛蛋白肽包含以逆序列方向、即羧基端至胺端方向合成的D-氨基酸，以产生所谓的逆-倒位(RI)菌毛蛋白肽。逆-倒位(RI)型菌毛蛋白肽还具有更强的蛋白酶抗性的优点，并因此在本文中所述的应用中是有利的，在所述应用中涂布菌毛蛋白的材料暴露于蛋白酶，例如在生物环境中或在经受细菌生长的环境中。合成RI型肽的方法在例如以下文献中有详述：Fletcher, M.D.和Campbell, M.M., Partially Modified Retro-inverso Peptides: Development, Synthesis, and Conformational Behavior, Chem Rev, 1998, 98:763-795，其通过引用结合到本文中。
正如以下将会看到的，与L型菌毛蛋白肽相比，逆-倒位菌毛蛋白肽作为表面涂布剂也具有重要优势。首先，它们对于假单胞菌所导致的生物膜形成提供更优良的抑制，并对于非假单胞菌(例如利斯特氏菌和葡萄球菌)所致的生物膜形成提供显著更强的抑制，尽管一般而言，与RI肽相比，D型菌毛蛋白肽对生物膜形成产生更强的抑制作用。其次，尽管L型T4P菌毛蛋白肽以高亲和力有效结合不锈钢(通过表征为增加的电子功函(EWF)、更大的硬度和腐蚀抗性的共价-样键)，但是已经发现逆-倒位菌毛蛋白肽产生显著更高的钢EWF(高于L型肽所产生的)，并且还显著增加了材料硬度，亦表明腐蚀抗性更大(相对于用L型肽所观察到的)。
在再一个实施方案中，将菌毛蛋白肽、和优选D型或逆-倒位型的菌毛蛋白肽，缀合到聚乙二醇聚合物线状或分支链，通常通过共价连接聚乙二醇线状或分支聚合物的末端与肽的N-末端胺和/或C-末端酸基团，使用常规的肽偶联方法，例如用于在肽和PEG部分之间形成酰胺键、酯键、醚键或二硫键，或者含有活化基团的键。用于与蛋白质缀合的PEG或具有合适反应基团的PEG是市售可得到的，例如来自PEGTech, Analytical Ventura和Thermo Scientific (分支PEG)并且活化基团可以是例如马来酰亚胺(通常用于与以下基团反应：肽巯基、乙烯基砜、丙醛、吡啶二砜、NHS酯或碘乙酰胺)；可通过已知的偶联反应，将具有末端胺、酸、羟基或巯基反应基团的PEG偶联到肽的胺、酸、羟基或硫基团。PEG通常在一端具有惰性基团，例如甲氧基，在另一端具有活化基团或反应基团。聚合物试剂的典型平均分子量的选择大小范围介于5kDa至40kDa，相当于在聚合物中有100-1,000个重复单元，尽管更小或更大的PEG也是合适的。按照标准PEG偶联方法，通过活化PEG试剂对蛋白质进行PEG化。
PEG-D-菌毛蛋白肽或PEG-RI-菌毛蛋白肽的优势在下文将会见到。一般而言，PEG化形式的D型或RI菌毛蛋白肽提供了上文对于非PEG化形式的D-或RI型肽所提及的优势，但额外优势为显著减少摩擦系数和更大地抑制在已涂布表面上的生物膜形成。
III. 处理金属表面
一方面，本发明包括处理表面具有暴露的晶粒边界区的不锈钢、锡、铁或钛金属材料的改进方法，以降低材料的腐蚀速率。该方法可单独地或与多种其它抗腐蚀方法中的一种(例如钝化)组合使用。金属材料可具有单个暴露表面(其具有晶粒边界区)或多个待处理的外表面，或含有自材料外表面可及的孔或内部网眼。可以理解，该方法适合对经受化学腐蚀的任意不锈钢、锡、铁或钛金属材料的任何处理，所述化学腐蚀例如在氧化的气氛中或通过与腐蚀性液体(例如碱性或酸性液体)接触。
在实施该方法中，可首先洗涤金属材料一次或多次，例如在乙醇浴中，以除去污染物。然后，在有效使菌毛蛋白与材料的暴露表面共价结合的条件下使材料与菌毛蛋白溶液接触。在一个典型的处理方法中，将材料放置于肽或缀合物浓度为2 μg/mL至50 μg/mL菌毛蛋白(例如10 μg/mL)的菌毛蛋白肽或PEG-菌毛蛋白-肽缀合物在接近中性pH (例如pH 7)的水性缓冲液(例如磷酸缓冲盐水)中的溶液中，并使材料与该溶液接触一段时间(例如5-120分钟)直到合适的菌毛蛋白肽涂层已形成。
或者，可以用菌毛蛋白溶液喷雾待涂布的材料，且使其与喷雾溶液在高湿度环境中接触需要的接触时间(例如5-120分钟)。
在再一个实施方案中，将菌毛蛋白涂料施加于金属表面的所选区域，例如在微制造(microfabrication)操作中，或选择性地将肽施加于材料上暴露的晶粒边界区。在该实施方案中，以区域特异性方式(例如通过喷墨打印机或类似手段)将肽溶液递送至材料的暴露表面。
IIIA. 处理方法和金属表面性质的改变
本部分描述了处理金属表面以增强其腐蚀抗性的示例性方法和在支持本发明而进行的研究，所述研究证明，除了增强的腐蚀抗性以外，(i)经处理表面的粘合力降低，(ii)经处理表面的电子功函改变，(iii)经处理表面的硬度增加，(iv)导电率减小，和(v)在至少两个月的时期内涂层稳定。除非另有说明，否则在本部分和在部分IIIB和IIIC中报告的研究是用L型菌毛蛋白肽进行的。在部分IIID中报告的研究和结果是用D型和逆-倒位菌毛蛋白肽以及D-和RI菌毛蛋白肽的PEG-缀合物进行的。
样品制备 将商品级304 2B光泽表面(finish plate)(20规格)不锈钢板(1 mm厚)切割成尺寸为1 cm x 1 cm的样品。样品在1140℃、于空气中退火1小时并在空气中冷却。使用120、240、320、400、600和800#粒度的砂纸抛光表面，随后用1200#粒度砂纸进行最终抛光。
使用上述的抛光方案抛光尺寸为1 cm x 1 cm x 1 cm的铝和不锈钢样品。这些样品在抛光之前都没有进行退火。
用肽或单体菌毛蛋白涂布样品 使用市售洗碟皂将不锈钢和铝样品洗涤1分钟，随后用蒸馏水冲洗。然后伴随温和搅拌将样品浸入95%乙醇中15分钟，用蒸馏水冲洗，再浸入试剂级丙酮中1分钟。用蒸馏水冲洗样品5次，随后使其风干。将样品浸入含有10 μg/mL肽或肽缀合物或单体菌毛蛋白的磷酸缓冲盐水(PBS)溶液中并伴随温和搅拌于室温(RT)温育1小时。除去溶液，用蒸馏水洗涤样品6次并使样品风干。
使用上述方案清洁碳钢样品，但在丙酮洗涤步骤之后代替地用100%甲醇冲洗样品并立即将样品浸入100%甲醇中以防止当暴露于水时导致的快速的空气腐蚀。将肽或肽缀合物溶解在100%甲醇中，10 μg/mL的最终浓度用于浸没碳钢样品。伴随温和搅拌于RT将样品温育1小时。用100%甲醇洗涤样品6次并使其风干。
粘合力测量 使用原子力显微镜(AFM)测量尖端半径为50-70 nm的标准的涂布Au的AFM氮化硅尖端和涂布肽的表面之间的粘合力。为了确定AFM尖端和涂布的表面之间的粘合力，以“接触”模式使用AFM。使尖端接近表面，使它们接触，测量将尖端拉离表面时悬臂(cantilever)的偏转(deflection)。通过激光束检测偏转的总量，其反映粘合力。如果悬臂的弹簧常数是已知的，可根据光束偏转(beam deflection)而定量测定粘合力。在该研究中，悬臂弹簧常数是0.06 N/m。对每个实验，每个样品获得20至50个粘合力测量结果。
涂布K122-4或PAO菌毛蛋白肽的不锈钢样品的粘合力研究的结果分别绘制在图2A和2B中。如图2A所示，涂布的金属的粘合力集中在约5-40 nN(纳牛顿)的范围内，平均值约20 nN，相较于未涂布的样品，其粘合力集中在约40-75 nN，平均值约60 nN。用PAO菌毛蛋白涂层获得类似的结果。由于粘合力是电子活性(例如范德华(Van de Walls)相互作用)的反映，可推断出肽涂层起到掩蔽金属表面电子层的作用。
对涂布肽的铝板的类似的粘合力测量显示，涂布的和未涂布的板之间的粘合力几乎没有区别。
功函测量 用SKP370扫描开尔文探针(Scanning Kelvin Probe)照惯例测量涂布的和未涂布的不锈钢样品的电子功函(EWF)。使用振动电容探针并通过扫频“隔板”电位(swept backing potential)操作该技术,测量扫描探针参考尖端和样品表面之间的功函差。被研究的样品是如同粘合研究中使用的那些，不同之处在于还检验了用PAK菌毛蛋白肽涂布的样品。
研究结果绘制在图3A中(关于未涂布的和涂布K122-4菌毛蛋白肽的样品)和图3B中(关于未涂布的和涂布PAO-和PAK菌毛蛋白肽的样品)。对于所有三种涂层，菌毛蛋白肽涂层使表面EWF提高了至少约0.5 eV，达到约5eV的最终值。
对涂布肽的铝板的类似的EWF测量显示，涂布的和未涂布的板之间的EWF几乎没有区别。
肽涂层的稳定性 图4显示对涂布后2个月的时间期限内获取的涂布K122-4菌毛蛋白肽的样品的测量结果。在这2个月的研究时期内观察到涂布的样品相对于未涂布的片具有更高的EFW，表明至少两个月的涂层稳定性。
纳米压痕/硬度 使用triboscope (Hysitron,Minneapolis, USA)检验涂布肽的样品的机械性能的改变。triboscope是纳米机械探针和AFM的组合。该探针是金刚石锥体形维氏硬度计压头，具有150nm的标称半径、100 nN的力灵敏度(force sensitivity)和0.2nm的位移分辨率。在纳米压痕过程中，对于每次压痕获取力-深度曲线，从该曲线获得尖端进入样品表面的总深度位移。使用50至800 μN的力进行纳米压痕试验。对每个力负荷获取五条力-深度曲线。
图5中显示涂布肽的(深色)和未涂布的(浅色)不锈钢在50至800 μN的负荷范围下的力-位移曲线。在800μΝ负荷下的总位移显示在图的顶部，对于涂布的片，该值在45-55nm范围内，对于未涂布的片，该值在约90-95nm。基于该试验，涂布的片的硬度几乎是未涂布的片的两倍。更一般地，涂层有效地使不锈钢、锡、铁或钛金属表面的硬度增加至少约20%，优选至少约30%，至多50%或更高。
图6A和6B绘制涂布的和未涂布的片在20 μN (6A)和 50 μN (6B)下产生的纳米压痕的位移。与来自图5的数据一致，涂布的片的硬度比未涂布的片高约20%-100%。
相同类型的研究绘制在图7A和7B中，图(7A)针对涂布PAO的且在50-800 μN的力范围内，图(7B)针对涂布K122-4的且在50-400μN的力范围内，结果基本上相同。在这两种情况中，涂布菌毛蛋白肽几乎使金属样品的表面硬度翻倍。
对涂布肽的铝板的类似的纳米压痕试验显示，涂布的和未涂布的板之间的表面硬度几乎没有改变。
增加的导电率 导电率是材料传导电流的能力的量度。测量表面导电率的一个标准方法使用原子力显微镜(AFM)来测量在规定的低电压电位偏压(potential bias)下从表面上的特定位置流至AFM尖端的电流。AFM将表面和尖端之间的电流(以PA计)定量显示为特定颜色，并且对于未涂布的和涂布菌毛蛋白的不锈钢板，分别用图8A和8B中不同的灰色阴影表示。通常，较深至较浅的阴影表示较大至较小的电流(28.0至24.5pA)。从这两幅图中观察到，图8A中的未涂布的不锈钢样品的表面区在样品表面上变化很大且具有表示较高电流的主导的深色阴影，而图8B中涂布菌毛蛋白的样品的表面区主要是低导电率的且导电率图显著更加均匀。这些结果与来自图3A和3B的EWF数据一致，表明涂布菌毛蛋白的材料具有显著更高的金属功函(提取表面电子所需的功的量度)。
腐蚀抗性 有多种技术可用于研究材料表面的腐蚀抗性或易腐蚀性。一种方法是测量固定的电位下穿过金属板的电流。测得的电流反映表面电子在氧化还原形式之间往复，更大的电流表明更大的腐蚀潜力。图9A中的图显示对如上制备的304 2B光泽表面(20规格)不锈钢板(未涂布的或涂布K-122-4菌毛蛋白肽的)测得的电流(Icorr)。结果显示涂布的板的Icorr显著更低，表明腐蚀抗性更高。
可能被问及，以上研究中观察到的Icorr差异是否与电流首先开始流经金属表面时的电位(Ecorr)有关。通过观察金属中的电流首先开始流动时的电位(Ecorr)来研究这个问题。研究结果(显示在图9B中)表明，涂布的和未涂布的金属样品两者具有类似的Ecorr值，表明图9A中看到的Icorr值差异不是由两个样品之间电压电位响应的差异造成的。
图10A中绘制了涂布K-122-4的和未涂布样品的腐蚀速率测量结果(以密耳(毫英寸)/年(mpy)测量)。结果与图9A中看到的Icorr的差异一致。具体地，当比较平均速率时，菌毛蛋白肽涂层显示使腐蚀速率降低了超过三倍。
腐蚀监测中另一个广泛使用的技术是抗极化性，定义为自由腐蚀电位下的电位电流密度曲线的斜率，得到可通过已知的数学关系与腐蚀电流相关的阻抗值Rp。图10B绘制涂布的和未涂布的不锈钢的Rp值，显示肽涂层显著提高作为腐蚀抗性的量度的Rp。
令人感兴趣的是，当菌毛蛋白与具有强偶极和/或高电荷密度的另一种肽缀合时，在此例子中，所述另一种肽是亮氨酸拉链型E螺旋或相同的E螺旋(其已结合E螺旋/K螺旋对中的相反电荷的K螺旋)，菌毛蛋白肽在抑制腐蚀中的作用可逆转。如图11所示，未涂布的不锈钢样品的腐蚀速率显著低于具有结合的菌毛蛋白-E或E/K螺旋形式的菌毛蛋白的样品。
对以上讨论的各种不锈钢样品的腐蚀测试的视觉效果参见图12A-12C。在该研究中，样品或者是未涂布的(12B)或者用菌毛蛋白肽(12A)或与E/K卷曲螺旋对缀合的菌毛蛋白肽涂布的。在每种情况下，样品在稀盐溶液中经历上述的腐蚀测试。与未涂布的板相比，涂布菌毛蛋白的板显示极小的表面腐蚀，而菌毛蛋白-缀合物涂层看起来显著加强腐蚀。
总之，用合成菌毛蛋白肽涂布金属例如不锈钢、锡、铁或钛，有效地增加金属表面的硬度和腐蚀抗性，所述合成菌毛蛋白肽含有衍生自IV型铜绿假单胞菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受体结合蛋白的二硫环并含有位于所述环的N-末端侧或C-末端侧或这两末端侧的0-10个、优选地0-5个额外残基。增加的腐蚀抗性通过改变，例如金属表面的电子功函增加至少0.2 EFW单位以及上述Icorr、腐蚀速率和Rp值的改变来证明。提高的硬度通过纳米压痕减小了至少20%来证明，所述纳米压痕通过用原子力显微镜的尖端以给定力冲击金属表面而产生。
所述方法中考虑的其它金属是元素周期表第4-6行、第9-12列的过渡金属，包括钴、镍、铜、锌、钌、铑、钯、银、镉、锇、铂、金和汞，它们的混合物和合金、准金属硅和锗和它们的氧化物。
减少的摩擦系数
按照已知方法，例如2007 J. Phys.: Conf Ser 61 51中所报道的，使用原子力显微镜(AFM)测量摩擦系数。简而言之，以给定力(例如500 mN)将AFM的悬臂梁(cantilever beam)施加到表面，并跨越测试表面而移动。梁的偏转量就提供了梁所经历的摩擦力的度量，较低的摩擦系数产生较低的偏转。梁在表面上的整个移动路线的偏转概况就提供了摩擦系数的度量，小而更均匀的偏转表示低系数，而更高且更不规则的概况则表示更高的梁偏转。
IIIB.  菌毛蛋白肽与经处理金属共价结合的额外证据
涂布的金属的电子功函改变和腐蚀抗性增强表明，菌毛蛋白肽已改变了涂布的表面的电子性质，暗示肽与金属之间共价键的形成，其改变了金属的自由电子轨道。这一发现的额外支持来自本分部中报道的肽置换分析和X-射线光电子光谱法(XPS)研究。
肽/菌毛蛋白置换分析 化合物和基底之间的共价相互作用的一个指示是在溶质形式的化合物存在下温育复合物时不能从基底上置换化合物。在此，研究外源性菌毛蛋白肽置换与不锈钢表面结合的菌毛蛋白肽的能力。如上所述地清洁1 mm厚的商品级304 2B光泽表面(20规格)不锈钢板。这些板不进行退火或抛光。将这些板装配到96孔Schleicher和Schuell Minifold TM System (Mandel Scientific)中。将五十微升含有10 μg/mL生物素化的PAK肽或生物素化的纯化的菌毛蛋白的溶液加入孔(5个平行测定)中并在RT下伴随温和搅拌将该集合管(manifold)温育1小时。用1x PBS洗涤孔六次。向平行测定孔中加入增加量(0至10 μg/mL)的未标记的PAK肽并在RT下伴随温和搅拌将该钢集合管温育1小时。随后用PBS洗涤孔六次。使用链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶(HRP)评估结合的生物素化的肽或菌毛蛋白的置换。将链霉抗生物素蛋白-HRP(Sigma)1/500稀释，每孔加入100 μL并在RT下将该集合管温育1小时。每孔加入150微升显影缓冲液(含有1 mM 2,2'-连氮基-双-(3-乙基苄基噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS) (Sigma)和0.03% (v/v)过氧化氢的0.01 M柠檬酸钠缓冲液，pH 4.2)。在RT下伴随温和搅拌将该集合管温育10分钟。将反应溶液转移至96孔平底微量滴定板(Corning)中，使用FLUOstar OPTIMA读板仪(BMG LABTECH)测定在405 nm处的吸光度。
如图13中绘制的数据所示，即使在较高浓度的可溶性菌毛蛋白肽时，也没有自金属表面的可测量的结合菌毛蛋白肽的损失，证明结合的菌毛蛋白肽与未结合的肽相平衡，表明肽和金属表面之间的共价键连接。肽与金属表面的共价结合的其它证据由以下的腐蚀抗性研究提供。
XPS特征X-射线光电子光谱法(XPS)是测量元素组成和材料内存在的元素的电子状态的定量光谱学技术。通过用X-射线束照射材料同时测量从被分析材料的顶部1至10 nm逃逸的电子的动能和数量来获得XPS光谱。XPS需要超高真空(UHV)条件。
使用Axis-165光谱仪(Kratos Analytical)检验来自未涂布的和涂布菌毛蛋白的样品的光发射的电子。从这两种样品发射的电子的光谱见图14。如所示的，涂布菌毛蛋白的样品含有结合能约为100和150eV的两个独特的峰，它们在未涂布的样品中不存在。一个可能性是这两个峰代表由于缀合的电子结合而显著红移的硫-金属键。没有N或O与金属结合的证据，表明菌毛蛋白与金属之间可能的共价(共享电子)键相互作用是与菌毛蛋白肽中两个硫原子中的一个或两个。
IIIC. 晶粒边界效应
晶粒边界是多晶材料中两个晶粒或微晶之间的界面。晶粒边界是晶体结构中的缺陷，且易于降低材料的电和热传导率。大多数晶粒边界中的高界面能和较弱的结合经常使它们成为腐蚀开始和从固体沉淀出新的相的优先位点。
由于晶粒边界可作为腐蚀的起始点，所以，确定菌毛蛋白肽与金属表面结合是否优先发生在晶粒边界位点是令人感兴趣的。为了研究这个问题，将使用涂布菌毛蛋白-肽的AFM尖端的上述粘合力研究进一步精细化为研究晶粒内和晶粒边界处的粘合力作用。该研究中的“试验”和“对照”表面是用PAO菌毛蛋白肽或用具有乱序的(scrambled) PAO氨基酸序列的肽涂布的不锈钢板。对于各样品，测量晶粒内和晶粒边界处的粘合力。
如下表1中给出的结果所示，在晶粒边界内，菌毛蛋白肽的粘合力比具有乱序的序列的相同材料的粘合力小约20 nN，而在晶粒边界处，粘合力小约43 nN。该结果表明，或者菌毛蛋白肽优先定位于晶粒边界处，即，肽在晶粒边界处具有更大的涂层厚度，或者相同水平的菌毛蛋白结合在晶粒边界处产生更大的粘合力作用。在任何一种情况下，该数据可解释通过使菌毛蛋白肽与金属表面结合所观察到的抗腐蚀作用的大小。
表1: 晶粒边界区对粘合力的作用
AF M尖端 竞争者 晶粒内的粘合力(nN) 晶粒边界处的粘合力(nN) 晶粒边界处的增加倍数
卷曲螺旋-PAK (128-144)ox PAO(128-144)ox 39.5 ± 9.4 44.5 ± 11.6 1.13
卷曲螺旋-PAK (128-144)ox PAO(128-144)ox_乱序的 59.7 ± 8.4 87.5 ± 14.2 1.47
可归因于 PAK(128-144)ox   20.2 ± 17.9 43.0 ± 25.8 2.12
IIID.通过D-和RI-型菌毛蛋白进行菌毛蛋白肽结合
为了检验D-和RI-型菌毛蛋白肽与多种材料，包括多种金属包括(不锈钢)和聚合物结合的能力，以及涂布菌毛蛋白的材料的特性，合成D-和RI-型K122-4菌毛蛋白肽并相对L-型的相同的菌毛蛋白肽进行测试。
在一项研究中，用L-型菌毛蛋白肽(三个不同批次)、D-型菌毛蛋白或RI-型菌毛蛋白涂布不锈钢板，一个板不涂布。首先检验所述板的粘合力的改变，类似于以上针对图2A和2B所报道的研究。如图15A所示，对所有三种形式的菌毛蛋白肽，都看到粘合力相对于未涂布的板显著减小。
将对相同的六个样品的EWF测量结果(如以上针对图3A-3B所述地进行)绘制在图15B中。令人感兴趣的是，D-氨基酸形式给出比其他五个板中任意一个(包括未涂布的板)显著低的EWF，而RI菌毛蛋白肽显著增加了钢的EWF，高于具有结合的L-型菌毛蛋白肽的不锈钢所观察到的EWF。这些结果也见于图27A中，该图显示了对于用L型K122-4菌毛蛋白肽涂布的(称为borg-K122SS)、或用D型K122-4菌毛蛋白肽涂布的(称为borg-K122SS-D-氨基)、或用逆-倒位K122-4菌毛蛋白肽涂布的(称为borg-K122SS逆-倒位)不锈钢(Borg, Grade 304不锈钢)所测量的EWF值。正如所预期的，逆-倒位菌毛蛋白肽耐胰蛋白酶消化(都见图27B)并且还显著增加钢的硬度(图27C)。由于EWF是表面电子的能量水平和这些电子与其它材料反应的能力的度量，所以升高的EWF通常反映了腐蚀抗性的增加。图27D所示的研究证实了这一点，证明borg-K122SS逆-倒位的抗腐蚀速率是未涂布的不锈钢的约50%。
结果表明D-和RI-型菌毛蛋白肽都能以改变金属表面的电子性质的方式与不锈钢板相互作用，其中逆-倒位型给出比L型菌毛蛋白肽显著高的EWF，并且给出比D型菌毛蛋白肽高很多的EWF。
通过比较肽与未涂布的、或者用生物素化的对照肽(乱序的菌毛蛋白序列或菌毛蛋白序列的非结合区)涂布的、或者用生物素化的D-型菌毛蛋白肽涂布的不锈钢支架的结合，研究D-型菌毛蛋白与不锈钢紧密结合的能力。通过首先于37oC用3% SDS溶液洗涤表面，随后在PBS中进行另外的数次洗涤，测量与各支架表面结合的肽的量。将洗涤的表面与链霉抗生物素蛋白-HRP (辣根过氧化物酶)一起温育，然后暴露于ABTS基底，读取405nm处的吸光度。如图16A所示，与不锈钢支架结合的D-型菌毛蛋白肽约为对照肽的两倍。
为了研究与金属结合的D-型菌毛蛋白肽相对于与金属结合的L-型菌毛蛋白肽的酶蛋白水解抗性，用L-型肽、D-型肽和对照(乱序的菌毛蛋白序列)一式两份涂布不锈钢板。然后使来自每二份的一个样品与0.25%浓度的胰蛋白酶、EDTA 1 mM、pH 7.4在37oC一起温育60分钟。之后，通过上述HRT分析法分析样品的结合蛋白。
图17A显示在暴露于胰蛋白酶之前和之后的L-型菌毛蛋白的结合肽水平。正如所看到的，通过蛋白酶处理而除去超过一半的菌毛蛋白肽。相比之下，结合的D-型菌毛蛋白肽的量基本上不受蛋白酶消化的影响(图17B)。该结果证明(i) L-型肽与不锈钢的共价结合并未赋予抗蛋白酶消化的防护作用，和(ii)结合的D-型菌毛蛋白肽基本上得到防护而免于酶蛋白水解。
为支持本发明而进行的额外研究证明了以下方面的显著优势：D型和逆-倒位菌毛蛋白肽提供比L型菌毛蛋白肽更高的结合亲和力和蛋白水解抗性。这些优势对于D型菌毛蛋白肽而言特别突出，正如即将见到的那样。
图28A-28C显示不同的D和RI型菌毛蛋白肽和肽-PEG缀合物对未抛光的(图28A)和用600粒度抛光的钛表面的作用(图28B和28C)。正如所看到的，D-和RI型的K122菌毛蛋白肽都可测量地增加了金属表面EWF，其中D型对于这两种钛表面都得到最大EWF增加。PEG-D-菌毛蛋白肽(图28C)增加了EWF，但程度低于非PEG化的D型肽。
对用不同的D-和Ri型菌毛蛋白肽(包括PEG-D-菌毛蛋白肽)涂布的钛表面的纳米压痕测量见图29。与未涂布的钛相比，RI和D型肽(包括PEG缀合的D型肽)都显示出显著的表面硬化。PAO-K1301肽是在残基位置130 (按照PilA蛋白的编号方案)具有氨基酸突变的L型菌毛蛋白肽，其中天然赖氨酸残基被异亮氨酸残基置换。
为了证明图29所示的表面硬度作用限制于表面，例如不是大块金属效应(bulk-metal effect)，对用与图29相同的菌毛蛋白肽涂布的钢表面进行显微压痕测量，但是如图30A-30E所示以更高冲击力。正如所看到的，以较高力时硬度未见变化。
图31A显示PEG-D-菌毛蛋白肽涂层对在钛板上的粘合力的作用(图31A)和对钢板的腐蚀速率的作用(图31B)。PEG化的D型肽对表面粘合几乎没有作用，但能显著降低钢板的腐蚀速率。
为了证明PEG化的菌毛蛋白肽显著降低涂布的金属(在此例中，钛板)的摩擦系数，对未涂布的钛表面和用不同菌毛蛋白肽涂布的钛进行AFM摩擦系数测量，如上所述，结果见图32A-32E。各图是每种涂层产生的6个不同的图中选取的代表性图。未涂布的钛表面给出高的和不规则的位移，如图32A的图所示。在用PEG-D-肽涂布的钛板中观察到最低摩擦系数，见图32B的图。该图的特征在于在所研究的表面线(surface line)上的小而相当均匀的位移。尽管非-PEG化的RI型的肽(图32C)和D型(32D)显著减少了摩擦系数，但这两幅图并没有显示出与PEG-D-肽相当的摩擦系数的减少。当应用D和RI型的非-PEG化的肽两者时，观察到某些改进(图32E)，表明D-和RI型结合到金属表面上的不同部位。然而，组合的非-PEG化的肽仍然给出比单独的PEG-D-肽更高和更不规则的位移。
图33A中的框2-9是不锈钢支架的荧光显微图(在框1中以20X显示)，其表面已经涂布对照肽(框2和3)、L-肽(框4和5)、RI菌毛蛋白肽(框6和7)和D型菌毛蛋白肽(框8和9)。正如所看到的，D-肽在与全血一起温育之后保留了最强荧光，表示出最大的蛋白水解抗性。图33B显示用链霉抗生物素-辣根过氧化物酶(与生物素化的肽/蛋白连接)检测到的肽/蛋白的点。在不锈钢上，仅有D型和Ri菌毛蛋白肽抵抗蛋白酶K处理。与L型菌毛蛋白肽相比，这两种菌毛蛋白肽也可更有效地结合到不锈钢基底。当L型、D型和RI菌毛蛋白肽结合到钛时，观察到类似结果(33C)，其中右图A显示当结合到钛基底时，D型肽具有最大的蛋白酶K抗性。对于D型和RI菌毛蛋白肽与聚氨酯基底的结合，可观察到类似结果，如图33D所示，其显示出与对照肽相比，D型和RI菌毛蛋白肽与基底的结合水平。尽管此处未显示，但是L型肽显示出与聚氨酯相对弱的结合。
当这3种菌毛蛋白肽形式结合到聚砜透析膜并随后暴露给不同的破坏处理时，得到类似结果。见图33E框A，观察到D型和RI菌毛蛋白肽比L型肽的胰蛋白酶消化抗性显著更大。图33E框B显示在用SDS、蛋白酶K处理和煮沸10分钟之后的结合肽的相对量。在各种情况下，D型肽当结合到膜上时是最稳定的，L型是最不稳定的，RI肽显示出中间的稳定性。对于结合到硅酮基底的这3种肽而言，也可观察到该模式(图33F)。
有兴趣的是研究这3种菌毛蛋白肽形式的相对稳定性，当它们所结合的不锈钢基底经历温和电流时。在一项研究中，其结果见图34，施加18V, 50 mA电流通过不锈钢基底达10分钟，导致对照肽、L型肽和RI肽实际消耗，但D型肽显示出结合肽损失很少或没有损失。在较低电流(30和40 mA，在相同时间期限内)时得到类似结果(数据未显示)。这些结果对如下所述的多种分析形式特别恰当，其中结合配体的受体分子通过菌毛蛋白肽结合到金属基底。当使基底暴露于温和电流时D型菌毛蛋白肽保留其结合的能力，允许基底清除掉非特异性结合的材料，通过施加中等电流通过基底，不会显著损失分析物与受体结合相关的信号，所述受体通过D型菌毛蛋白肽而锚定在基底上。
IIIE. 相关应用
根据本发明的另一个方面，还可利用菌毛蛋白肽结合而增加涂布材料的硬度的能力，以表面硬化其他材料例如板玻璃或汽车安全玻璃。在该应用中，使清洁的玻璃表面与菌毛蛋白肽在一定条件下接触,所述条件有效地使表面涂布有菌毛蛋白层。使用HRP分析如上测量与基底结合的蛋白质的量。如图16B所示，D-型肽与玻璃表面紧密结合，抵抗即使通过SDS处理的除去作用，并且与不锈钢支架结合的菌毛蛋白肽是对照肽的约两倍。
在另一个应用中，表面处理用于增强机器中相互移动接触的涂布的金属表面的润滑性。在此，目标机器组件通过在形成共价连接的菌毛蛋白涂层的条件下如上使部件暴露于菌毛蛋白肽来预处理以增强表面润滑性。或者，在操作期间或在暂时的关机期间可将菌毛蛋白肽的溶液施加于机器的接触表面，以便在机器操作过程中维持机器组件的更大的润滑性。
IV.　涂布的金属基底和生物传感器器件
本部分考虑本发明应用于诊断器件，其中，使分析物-特异性目标化合物(例如受体)通过本发明的菌毛蛋白肽或肽缀合物附着于检测表面。当检测表面是与菌毛蛋白肽共价结合(通过与金属表面的电子相互作用)的金属时，所述器件可以电子生物传感器模式起作用，如下所述。
IVA.　具有共价结合的化合物的金属基底
本发明的该方面包括金属基底，化合物(例如受体)通过以下方式在基底表面与所述金属基底共价连接，(i)如上详述，菌毛蛋白肽与基底的共价连接，且化合物与菌毛蛋白的直接或间接共价连接，即，通过菌毛蛋白-化合物缀合物，或者与PEG部分直接连接。如下形成涂布的基底：通过首先使未缀合的菌毛蛋白肽或缀合物与金属表面附着、随后使化合物与结合的菌毛蛋白或PEG共价连接，或者通过首先形成菌毛蛋白-化合物缀合物或PEG-菌毛蛋白-化合物缀合物、随后使该缀合物与金属表面结合(如上针对未缀合的菌毛蛋白肽所述的)。使化合物与菌毛蛋白肽共价连接的方法，例如通过经胺或羧基直接化学偶联或者使用双功能偶联试剂，是众所周知的。当化合物本身是肽时，可通过重组合成法或固相合成法作为融合蛋白形成菌毛蛋白-化合物缀合物。由于菌毛蛋白与金属表面的结合，涂布的基底已改变表面电子性质，并且支持本发明而进行的研究(下面详细叙述)显示，通过分析物相关分子和与表面结合的化合物的结合而调节通过基底表面的电流，使可能通过穿过基底的电流改变来记录此类结合事件。正如以下将会看到的，还可以使化合物间接地共价连接于基底，例如通过E/K卷曲螺旋复合物。正如可从图33A-33F中的数据所了解的，D型菌毛蛋白肽在该应用中是优选的，考虑到它对各种基底材料的更稳定的结合特性。
IVB. 具有与菌毛蛋白结合的基底的生物传感器器件
图18A和18B说明根据本发明的一个实施方案构建的生物传感器分析器件32。该器件利用通过金属检测板34上的菌毛蛋白-肽涂层观察到的改变的电子性质。即，板34由当涂布菌毛蛋白肽时具有改变的电子表面性质的金属(例如不锈钢、锡、铁或钛)形成。如上，通过使板表面暴露于以上的菌毛蛋白肽36和分析物-结合部分38的缀合物，或通过使化合物与已结合的未缀合的菌毛蛋白肽连接，形成菌毛蛋白涂层。板本身形成浅的生物传感器反应容器41的下表面，所述容器的侧部由该器件中的壁40形成，容器中部分填充水性导电介质42。附着于生物传感器表面的菌毛蛋白肽可包括PEG-菌毛蛋白肽缀合物(例如PEG-D-菌毛蛋白，其作用是减少样品材料与板的非特异性结合)和第二肽缀合物(例如RI-化合物缀合物，其作用是使所述化合物共价连接在表面上)的组合。
该器件中的生物传感器电路包括伸入容器中的电极44、电压源46和电流表48，其中，相反的电路连接位于检测板的下面。
图19和20说明生物传感器的两种表面构型。在图19中，受体(配体-结合)分子(R)共价连接于菌毛蛋白肽(钩形部分)，菌毛蛋白肽继而与生物传感器表面共价偶联。通过(i)菌毛蛋白肽与基底表面的结合相互作用，和(ii)受体R对导电性的影响，确定穿过生物传感器基底的导电率。当配体L(例如分析物)与受体结合时，表面上的电子性质进一步受到调节，造成所观察的生物传感器电流的改变。图21所示的电流改变是在配体与受体结合后从较大的电流变为较小的电流。
在图20中，通过菌毛蛋白/K螺旋缀合物与基底表面的共价结合，随后与受体-E螺旋缀合物的卷曲螺旋相互作用，受体R间接地与基底表面偶联。在该实施方案中，形成生物传感器表面涂层的缀合物是菌毛蛋白肽和K螺旋、与受体R和可与R结合的配体L缀合的E螺旋的三-组分缀合物。在该实施方案中，生物传感器首先与分析物反应，使分析物与涂层结合，掩蔽表面的K螺旋位点。该反应可作为因K-螺旋的掩蔽造成的电流改变而被直接读取，或者可在此阶段加入E-螺旋试剂以便与E-螺旋结合，所述E螺旋与分析物反应后仍未掩蔽的K-螺旋的量成比例。
图22A和22B是生物传感器相互作用的伏特计循环曲线(voltameter cycle curve)，其中，His部分(受体)通过图20所示的卷曲螺旋构型与基底表面结合。图22A显示与E-螺旋复合的K-螺旋上展示的His部分的完整的循环伏安曲线(cyclic voltalmetry curve)，所述E-螺旋在加入特异性针对His部分的抗His抗体后通过菌毛蛋白构建体本身与不锈钢共价连接。图22B显示循环伏安曲线的左手部分的放大图，证明不仅在正偏压下而且在负偏压中通过抗体与His部分的结合改变了电流。抗His抗体与His受体的结合产生最低的电流循环，证明电流随“分析物”与生物传感器表面的结合而下降。当His受体通过菌毛蛋白肽直接与生物传感器表面结合时，获得类似的结果，所采用的分析物是抗His抗体。
为了理解传感器的运转，考虑来自下表2的腐蚀抗性数据是有用的，表2显示以下各项的Icorr、Ecorr、腐蚀速率和Rp数据：(i)未涂布的不锈钢板(未改性的)，(ii)用与E-螺旋(带负电荷的亮氨酸拉链)肽缀合的菌毛蛋白肽(E-PAK)涂布的不锈钢板，(iii)用已经与带相反电荷的K-螺旋肽结合的相同的缀合物(即，肽与E-螺旋/K-螺旋异二聚体缀合)(K-E-PAK)涂布的第三不锈钢板。考虑Icorr栏，该数据显示E-PAK与板结合显著增加其Icorr值，与对用单独的PAK菌毛蛋白所观察到的作用相反(见表9A)。当缀合物被中和(K-E-PAK)时，Icorr值显著小于未涂布的金属，类似于针对未缀合的肽观察到的作用。从该数据观察到对Ecorr、腐蚀速率和Rp值的类似作用，即，通过与带相反电荷的K螺旋的结合来中和E-螺旋的作用显著改变E-PAK菌毛蛋白结合所产生的表面作用。
表2.菌毛蛋白缀合物对不锈钢的腐蚀抗性数据
从以上的说明可理解生物传感器的各种优势。首先，因为使分析物结合受体与生物传感器表面直接共价连接的菌毛蛋白肽影响生物传感器表面的电子活性，所以，通过配体结合改变表面复合物的大小和电荷产生直接的作用，例如电流减小。第二，分子与金属表面的相互作用从根本上不同于与塑料的相互作用，由于金属表面电子与分子直接相互作用的电子活性或能力决定相互作用的程度和力。不形成氧化物层的金属(例如金)具有非常活跃的表面电子(由于晶体的边缘效应)并容易将材料吸收至它们的表面。这些材料易于从样品基质非特异性吸附蛋白质和其他分子并因此不可用作生物传感器平台。金属(例如不锈钢)经历表面氧化以形成钝化的氧化物层(钝化的)，最大程度减少非特异性结合事件并且不容易使材料与它们的表面结合(因此它们可广泛用于医药和食品行业)。在生物传感器的应用中，使用T4P17肽容易地使特异性肽/蛋白质组分与钝化的不锈钢结合的能力对改善检测配体-受体相互作用中的信噪比赋予明显优势。如上所述，T4P17与不锈钢结合介导电子转移并可在暴露于偏压时起到生物传感器的作用。以上报道的研究证明了响应配体与结合于金属表面的菌毛蛋白-受体缀合物的结合来调节通过生物传感器表面的电子流的能力。
RI型肽和D型肽在生物传感器应用中提供竞争优势。因为RI肽对EWF产生更强的电子效应，表明更强的离域效应，所以当分析物或分析物-相关分子与通过菌毛蛋白肽锚定于基底的受体结合时，RI肽可提供增强的电子响应。另一方面，D型肽可能提供更稳定的受体连接，并且还通过向基底施加中等电流而允许除去非特异性结合的样品材料，如上所述。如上所述，传感器表面可以用两种肽(其中之一或两者同时具有PEG部分)的组合来涂布。
IVE.具有与菌毛蛋白结合的基底的一般分析器件
图23A和23B显示分析物-检测器件16，其具有板18，板18的上检测表面用菌毛蛋白肽20和分析物-特异性靶分子22的缀合物涂布。虽然该板可以由与菌毛蛋白肽结合的各种材料形成。但是，其优选是与菌毛蛋白共价结合的金属例如不锈钢、锡、铁和钛表面。这种共价结合在易于生产、蛋白质稳定性和涂层稳定性方面提供多种优势。所述器件中还包括用于照射检测表面(如25处所示)的光束源24 (例如UV源)和光检测器26。肽缀合物还可额外地包括PEG部分，其可起到减少表面非特异性结合的作用。
在操作中，检测板的表面覆盖含有目标分析物的流体样品，在图12B中显示为可溶性的分析物分子30，并且使这些与检测表面上的分析物-特异性分子22反应。在显示的荧光检测器中，反应混合物可以含有荧光标记的抗体或能特异性地与结合于检测表面的分析物反应的其他结合试剂。然后，洗涤检测表面以除去未结合的组分。现在分析反应表面的结合的荧光的存在和水平(如图12B中所示，在27处显示发射的荧光)来完成分析。
可以理解，方便的荧光分析可以并入该器件中。例如，菌毛蛋白肽可以含有荧光部分且分析物-结合部分可以包括有效地淬灭来自菌毛蛋白荧光部分的荧光的荧光淬灭剂。在该实施方案中，分析物与分析物结合部分的结合有效地掩蔽淬灭剂的作用，在分析物与分析物结合部分的结合存在时产生更强的荧光。
在一个备选的实施方案中，菌毛蛋白肽和分析物结合部分可分别包括第一和第二荧光物类，当在给定的激发波长下激发时，它们有效地产生荧光共振能量转移。在该构型中，分析物与分析物结合物类的结合有效地抑制此类能量转移，减少所观察到的荧光。
如上所述，D型肽在该应用中提供两个明显优势：与基底的更稳定的结合和通过所施加的电流而除去非特异性结合材料的能力。
V.　具有涂布的金属表面的医疗器件
以上报道的关于肽与某些金属表面(例如不锈钢、锡、铁和钛表面)结合的研究证明，菌毛蛋白肽的结合改变金属的表面电子性质，表明肽和金属之间共价(电子共享)键的形成。这一发现提供了使生物活性分子(例如肽、脂质、核酸、代谢物或药物分子)共价连接于不锈钢、锡、铁和钛表面的新的方法，和具有通过菌毛蛋白肽使生物活性化合物共价连接于暴露的器件金属表面的新的医疗器件。
所述方法中考虑的其他金属是元素周期表第4-6行、第9-12列的过渡金属，包括钴、镍、铜、锌、钌、铑、钯、银、镉、锇、铂、金和汞，它们的混合物和合金、准金属硅和锗以及它们的氧化物。
在该方法中，使金属表面与合成的菌毛蛋白肽或PEG-菌毛蛋白肽缀合物接触，所述合成的菌毛蛋白肽或PEG-菌毛蛋白肽缀合物含有衍生自IV型铜绿假单胞菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受体结合蛋白的二硫环并含有位于所述环的N-末端侧或C-末端侧或这两末端侧的0-10个、优选地0-5个额外残基。
如果事先已经制备菌毛蛋白肽或缀合物以包括共价连接的生物活性分子，单独的接触步骤导致生物活性分子共价连接于金属表面。制备肽(在该例子中是菌毛蛋白肽)与生物活性分子的缀合物的方法是众所周知的，包括形成肽与肽生物活性分子的融合蛋白，和使用特定的化学改性反应以提供使生物活性分子与肽共价连接的反应位点。例如，菌毛蛋白肽的固相合成法中的最后步骤可以包括加入可用于与生物活性分子共价反应的反应基团(例如醛)。
或者，可在肽连接于金属表面之后使生物活性分子与菌毛蛋白肽或PEG缀合物反应，再次采用常规的双功能试剂或特异性的化学基团反应化学以便使生物活性分子与金属表面上结合的菌毛蛋白共价偶联。
另一个应用(用于产生和纯化目标多肽)通过首先合成含有上述类型菌毛蛋白肽与目标多肽的融合蛋白(例如通过重组多肽合成法)来实施。然后，使该融合蛋白(其可通过添加PEG基团而被进一步改性)与由不锈钢、锡、铁、钛、铬、塑料、玻璃、硅酸盐、陶瓷或它们的混合物形成的固体载体接触，由此通过菌毛蛋白肽部分与载体的连接使融合蛋白连接于载体上。
在洗涤载体以除去未结合的材料之后，用能从结合的菌毛蛋白肽上特异性地切割目标多肽的试剂处理载体。这可以包括用能特异性地切割融合蛋白中确定序列的接头的蛋白水解酶处理载体，或用能特异性切割融合蛋白中的接头的化学的或辐射能源处理载体。然后，以基本纯化的形式从载体上洗脱或洗涤释放的目标多肽。
结合法的另一个应用是制备具有期需的表面性质或在其表面上携带期需的生物活性分子的可植入器件。例如，根据本发明的骨植入物包括不锈钢或钛植入结构，该结构的一部分适于放置于骨区内或对着骨区。为了促进骨与植入物的连接，用上述类型的PEG缀合物的合成菌毛蛋白肽与骨形态形成因子(例如RGD或骨形态形成因子BMP2-BMP7)的缀合物涂布该部分。
在相关的应用中，将菌毛蛋白肽或PEG缀合物施加于金属或聚合物支架的表面，产生具有改善的表面性质(例如较小的促进表面反应的倾向)的本发明的支架，所述表面反应可导致血管内植入位点处的非期需的凝血或瘢痕化。涂层可替代地由菌毛蛋白肽或PEG-菌毛蛋白肽缀合物与生物活性分子的缀合物形成，例如具有生物可释放接头(例如菌毛蛋白和药物之间的酯接头)的菌毛蛋白-Iimus药物缀合物。
正如以下将会看到的，涂布的金属表面显著减少了身体可针对器件而达到(amount)的炎性反应。
VI.　具有减少的生物膜形成和减少的炎性反应的医疗器件
除了由感染或细胞损伤/应激介导的炎症以外，大量的医源性炎症是由医疗器械引起的。人体组织、细胞和蛋白质暴露于非生物相容性医疗器件引发功能失调性宿主反应，其临床效应被大大低估。实例包括医疗假体(包括血管移植物(vascular graft)、人造关节和其它可植入器件)插入后的组织反应和功能失调性伤口愈合。类似地，白细胞和凝血系统的激活导致定期暴露于体外循环(例如心肺旁路和血液透析)的垂危患者的高发病率。这些事件进一步影响急性和慢性疾病患者的愈合、再生和康复。
根据本发明的另一个方面，已发现对医疗器件中使用的某些金属(例如钛)的炎性反应，通过用由D-氨基酸、D-和L-氨基酸的混合物和逆-倒位(RI)型的D-氨基酸形成的菌毛蛋白肽涂布金属表面，其中所有肽形式可进一步与PEG缀合。
在一项研究中，使人外周血单核细胞(PBMC)在标准的细胞培养条件下单独或在钛或钢板(其未涂布或用D-型菌毛蛋白肽涂布)的存在下温育。于37oC在RPMI培养基中温育24小时后，分析培养基的细胞因子IL-1β，其是PBMC中炎性反应的指示物。分析作为管家对照的微管蛋白。图25A显示对五个样品中每一个测定的IL-1β和微管蛋白的蛋白质印迹。如看到的，D-型菌毛蛋白肽涂层有效地抑制不锈钢和钛样品两者中的炎性反应。在图25B所示的柱形图中可定量看到针对钛样品的这种作用。
进行类似的研究以测试人THP-1巨噬细胞对相同样品的炎性反应，但是包括由不锈钢或钛形成的额外样品，其用代表非结合的菌毛蛋白肽序列的对照肽1或2涂布。随后，于37oC在RPMI培养基中使涂布和未涂布的样品与THP-1巨噬细胞温育72小时。随后，分析培养基和细胞裂解物的细胞因子IL-1β和管家蛋白微管蛋白。在图26A中的两种蛋白质印迹给出了结果。如看到的，单独的钛激发强炎性反应，其被D-型菌毛蛋白涂层显著减少。图26B中给出的针对不锈钢样品的量化程度更高的图显示，虽然对未涂布的不锈钢的炎性反应相当小，但是，D-肽涂层抑制了该作用。从两个对照肽样品(其显示中等的和强的反应)可明显看出，D-型菌毛蛋白涂层的作用是相当特异性的。
一方面，本发明包括具有当植入身体中时暴露于炎性反应细胞的表面的医疗器件，其中，这些表面用合成的菌毛蛋白肽涂布，所述合成的菌毛蛋白肽含有(i)衍生自IV型铜绿假单胞菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受体结合蛋白的二硫环，和(ii)位于所述环的N-末端侧或C-末端侧的0-10个、优选地0-5个额外残基，且(iii)由D-氨基酸、D-和L-氨基酸的混合物或逆-倒位(RI)型的D-氨基酸组成的。所述肽可以任选地与PEG部分缀合。
图24A-24D中的结合研究证明了D-型菌毛蛋白肽与各种医疗器件和器件表面(包括不锈钢(图24A)、铬钴支架(图24B)、乳胶导管(图24C)和硅酮静脉导管(图24D))的强结合。在各例子中，样品为未涂布的(图24中的空白柱)、涂布了对照乱序的菌毛蛋白序列(阴影柱)或D-型菌毛蛋白肽。随后，洗涤样品并通过上述HRT分析法分析样品的结合的蛋白质。对所有样品，结合的菌毛蛋白肽的水平显著高于对照的水平，不锈钢显示形成结合程度最高的涂层。本发明包括植入或暂时植入受试者身体的其它医疗器件，包括金属和非金属的支架两者、由各种可弯曲的材料形成的导管、在导管末端支承的器具、以及心脏瓣膜和其它血管瓣膜，其中，所述器件包括暴露于体内的炎性反应的表面并且涂布了D-型或RI型菌毛蛋白肽，所述肽任选地与PEG缀合。
在一个相关的方面，本发明还包括通过在植入器件之前用合成的菌毛蛋白肽涂布器件的暴露表面来抑制对植入受试者内的医疗器件的炎性反应的方法，所述合成的菌毛蛋白肽含有(i)衍生自IV型铜绿假单胞菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受体结合蛋白的二硫环，(ii)位于所述环的N-末端侧或C-末端侧或这两末端侧的0-10个、优选地0-5个额外残基，且(iii)由D-氨基酸、D-和L-氨基酸的混合物或逆-倒位(RI)型的D-氨基酸组成，其中所述菌毛蛋白肽可以任选与PEG部分缀合。
再一方面，本发明包括通过将D型或逆-倒位的合成的菌毛蛋白肽施加到制品表面而阻止或抑制非假单胞菌细菌在该制品表面上的生物膜形成的方法，所述合成的菌毛蛋白肽含有衍生自IV型铜绿假单胞菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受体结合蛋白的二硫环和含有位于所述环的N-末端侧或C-末端侧或这两末端侧的0-10个额外残基，和任选缀合其上的PEG部分，所述肽的量有效地抑制这类非假单胞菌细菌的生物膜形成。优选的菌毛蛋白肽是D型肽，优选的肽序列含有确定为SEQ ID NO:10的序列，例如确定为SEQ ID NO: 3、4或9的序列所例示的。
所述制品可以是例如非医疗器件(例如金属管道、或聚合的透析膜，其在正常使用期间经历生物膜形成)或医疗器件(例如聚合的导管、金属或聚合物支架、心脏瓣膜或者金属或陶瓷的骨假体或骨植入物)。更一般地，制品中的涂布的表面可以是金属(例如不锈钢、锡、铁或钛)、聚合物、陶瓷或硅酸盐的表面。
在具体的实例中，所述方法可用于抑制利斯特氏菌或葡萄球菌的生物膜形成，其中施加到制品表面的菌毛蛋白肽的量分别有效地抑制利斯特氏菌或葡萄球菌的生物膜形成。
在以下报道的研究中，检查了D型或RI T4P菌毛蛋白肽阻断非假单胞菌细菌与涂布的不锈钢板的细菌结合的能力。在实验上，使不锈钢板(未涂布的对照或者是用D型、RI或D型+RI T4P菌毛蛋白肽(K-122-4)涂布的)，与1 X 105 CFU/ml细菌在10 mM PBS pH 7.2中的细菌培养物在室温温育1小时，同时振摇。然后各板用10 mM PBS pH 7.2洗涤5次，5 ml/洗涤，在室温下用1mM含水吖啶橙染色2分钟，用水洗涤并随后风干。然后通过落射荧光显微镜术(epifluorescence microscopy)检查各板，并对600 40X视野进行摄影，测定每个视野的结合的细菌数目。这些条件检查生物膜形成的初始期，其是建立成熟生物膜的能力的预测。
图35A显示无害利斯特氏菌结合到板上的结果，并且证明D型和RI菌毛蛋白肽都有效地抑制无害利斯特氏菌与涂布的板的结合。对于单核细胞增生利斯特氏菌菌株H8、19和J10 (分别是图35B、35C和35D)，D型肽提供了针对所有3种菌株的结合的显著防护，而RI型仅提供了适度的抑制性结合作用。
用多种葡萄球菌得到类似结果，正如图36A-36F中的数据所示，其中D型肽通常(但并非总是)是两种菌毛蛋白肽中更具抑制性的。
用单核细胞增生利斯特氏菌和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的较早研究没能确定与未涂布的板或用L型菌毛蛋白肽涂布的板的细菌结合中的任何差异，尽管已知L型菌毛蛋白肽有效地阻断假单胞菌细菌与涂布的板的结合。总之，结果表明，尽管L型T4P菌毛蛋白肽有效地抑制假单胞菌的生物膜形成，但当涂布表面时，通过D型和或RI T4P菌毛蛋白肽也可实现对非假单胞菌细菌的生物膜形成的抑制，其中D型肽通常更具抑制性。
图37A-37C显示PEG-D-菌毛蛋白肽对不锈钢表面上的生物膜形成的作用。在每个框中，涂布PEG-D-肽的区域显示出很少或没有生物膜形成，相比之下，在金属表面的未涂布的区域中则有很明显的生物膜生长。抑制适用于铜绿假单胞菌菌株(图37A)和金黄色葡萄球菌两者。在支持本发明而进行的研究表明PEG-D-菌毛蛋白肽涂层对各种其它细菌病原体的抑制作用。这些观察结果与已发表的文献报道是一致的，所述文献报道表明通过加入PEG对表面的改性有效地限制生物膜形成，但是其中对所述方法的商业化的局限是稳定而长效的PEG表面处理的构建。本发明通过将PEG经由菌毛蛋白肽共价连接于金属表面而解决了这一难题，本发明人已经证明所述菌毛蛋白肽本身能抑制涂布肽的表面上的生物膜形成。
VII.　涂布的管道和方法
D-和RI型菌毛蛋白肽的PEG缀合物在涂布的表面处减少摩擦拽力、以及增加硬度和减少腐蚀的能力，在钻井和管道工业(drilling and pipe industry)中具有重要应用，用于减少流体流过管道的摩擦拽力，同时增加硬度和腐蚀抗性。
在油气勘探中，通常在压力下将液体泵入基岩构造，以使岩层裂开并释放所埋藏的天然气，此过程称为压裂(fracking)。压裂液(fracking fluid)通常是水、支撑剂(例如砂)和化学添加剂的浆液。通过用PEG-D或RI型菌毛蛋白肽缀合物涂布管道内表面，泵入该管道的浆液的摩擦拽力可被显著降低，降低成本和提高泵操作效率。同样，对于长距离运送油或天然气产品的管线，用具有内表面涂层的管道实现输送成本和效率的显著改进。
在实施处理管道以减少流过该管道的流体的摩擦拽力的方法中，将缀合物引入该管道，所述缀合物是以下的缀合物：(i)含有衍生自IV型铜绿假单胞菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受体结合蛋白的二硫环和含有位于所述环的N-末端侧或C-末端侧或这两末端侧的0-10个额外残基的D型或逆-倒位的合成的菌毛蛋白肽和(ii)聚乙二醇部分，所述缀合物的量有效地通过使所述菌毛蛋白肽连接于管道壁而减少流过管道的流体的摩擦拽力。可在缀合物的单独涂层溶液或悬液中将缀合物引入管道，或者可通过将肽缀合物定期加入到通常通过管道运送的流体(例如压裂浆液)中将缀合物引入管道。例如，可将缀合物定期加入到压裂浆液中至终溶液为1-10克/千升，用于起始涂布和定期恢复涂层。可以理解，浆液中的砂颗粒应当用PEG-菌毛蛋白缀合物预涂布，如下所述，以防止颗粒结合到大部分的旨在用于涂布管道内表面而加入的缀合物和除去该大部分的缀合物。
优选的菌毛蛋白肽是具有共价连接于所述肽的C-末端或N-末端的一端或两端的聚乙二醇部分的D型菌毛蛋白肽，其中所述肽缀合物中的聚乙二醇部分的分子量介于0.2-500 kDal之间。
菌毛蛋白肽缀合物所连接的管道内表面可以是金属、聚合物、陶瓷或硅酸盐表面。示例性的金属包括不锈钢、碳钢、钛、铜、黄铜、锡、铁、银、和镁及其合金。当管道具有不锈钢内表面时，通过引入而连接于管道内表面的菌毛蛋白肽缀合物的量足以减少所述内表面的腐蚀。
本发明的一个相关方面是具有用缀合物涂布的一个或多个暴露的金属、聚合物、陶瓷或硅酸盐的表面的制品，所述缀合物是以下的缀合物：(i)含有衍生自IV型铜绿假单胞菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受体结合蛋白的二硫环和含有位于所述环的N-末端侧或C-末端侧或这两末端侧的0-10个额外残基的D型或逆-倒位的合成的菌毛蛋白肽和(ii)聚乙二醇部分，所述缀合物的量足以减少一个或多个暴露表面的摩擦系数。涂布的制品具有降低的摩擦系数，并且在金属制品的情况下，具有更大的腐蚀抗性。示例性的菌毛蛋白肽例如D型肽，以及PEG部分如上所述。
通过暴露制品的一个或多个表面以用PEG-菌毛蛋白缀合物的溶液或悬液来涂布，以制造所述制品，如上文对于非糖基化的菌毛蛋白肽涂层所述。
当制品是其内壁表面用肽缀合物涂布的管道时，涂布表面的肽缀合物以足以减少流过管道的流体的摩擦拽力的量存在。
当制品是宽度尺寸为100微米或更小的微流体通道时，通道内壁表面用肽缀合物涂布，所述肽缀合物的量足以减少流体流过通道的摩擦拽力，例如，通过钻杆(drilling pipe)的砂浆的摩擦拽力。
在另一个实施方案中，机器的活动部件(例如相互咬合的齿轮(interdigitating gear)或往复运动的元件)用肽缀合物涂布以减少摩擦拽力和对部件的磨损。
在再一个实施方案中，所述制品具有表面，例如金属铅或电极，其被涂布以便在开始装配或置换期间防护铅免于腐蚀或对铅的磨损(wear placed on the leads)。
在另一个实施方案中，涂布的制品是浆液颗粒，例如砂，其如下涂布：通过将PEG-D-或RI型菌毛蛋白缀合物加入到所述颗粒的悬液中，或通过使缀合物溶液通过颗粒床，或简单地通过将缀合物加入到浆液中。颗粒的减少的摩擦拽力，对于颗粒-颗粒间的相互作用和对于颗粒与管道内壁间的相互作用两者，相对于仅通过仅涂布管道内部而达到的，进一步降低了浆液通过管道的流动阻力。
虽然已经对于具体的实施方案和应用描述了本发明，但是，应当理解，在不偏离本发明的情况下可做出各种修改。

Claims (64)

1. 处理管道以减少流过管道的流体的摩擦拽力的方法，所述方法包括：
向所述管道引入携带缀合物的液体，所述缀合物是以下的缀合物：(i)含有衍生自IV型铜绿假单胞菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受体结合蛋白的二硫环和含有位于所述环的N-末端侧或C-末端侧或这两末端侧的0-10个额外残基的D型或逆-倒位的合成的菌毛蛋白肽和(ii)聚乙二醇部分，所述缀合物的量有效通过使所述菌毛蛋白肽附着于管壁而减少流过所述管道的流体的摩擦拽力。
2. 权利要求1的方法，其中所述菌毛蛋白肽缀合物是具有共价连接于所述肽的C-末端或N-末端的一端或两端的聚乙二醇部分的D型菌毛蛋白肽。
3. 权利要求1或2的方法，其中所述肽缀合物中的聚乙二醇部分的分子量介于0.2-500 kDal之间。
4. 权利要求1-3的方法，其中引入管道的所述缀合物中的菌毛蛋白肽含有确定为SEQ ID NO: 10的序列。
5. 权利要求4的方法，其中引入管道的所述缀合物中的菌毛蛋白肽含有确定为SEQ ID NO: 3、4或9的序列。
6. 权利要求1-5的方法，其中所述菌毛蛋白肽缀合物所附着的管道内表面选自金属、聚合物、陶瓷或硅酸盐表面。
7. 权利要求1-6的方法，其中施加菌毛蛋白肽的的管道内表面是选自不锈钢、碳钢、钛、铜、黄铜、锡、铁、银、和镁及其合金的金属表面。
8. 权利要求1-7的方法，其中所述管道具有不锈钢内表面并且通过所述引入而附着于管道内表面的菌毛蛋白肽缀合物的量足以减少所述内表面的腐蚀。
9. 权利要求1-8的方法，其中通过所述引入而附着于管道内壁的菌毛蛋白肽缀合物的量足以减少引入管道中的含砂浆液的摩擦拽力。
10. 权利要求1-9的方法，其中所述引入包括在正常操作期间将所述肽缀合物定期加入到引入管道中的流体中。
11. 具有用缀合物涂布的一个或多个暴露的金属、聚合物、陶瓷或硅酸盐表面的制品，所述缀合物是以下的缀合物：(i)含有衍生自IV型铜绿假单胞菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受体结合蛋白的二硫环和含有位于所述环的N-末端侧或C-末端侧或这两末端侧的0-10个额外残基的D型或逆-倒位的合成的菌毛蛋白肽和(ii)聚乙二醇部分，所述缀合物的量足以减少所述一个或多个暴露的表面的摩擦系数。
12. 权利要求11的制品，其中所述菌毛蛋白肽缀合物是具有共价连接于所述肽的C-末端或N-末端的一端或两端的聚乙二醇部分的D型菌毛蛋白肽。
13. 权利要求11或12的制品，其中所述缀合物中的聚乙二醇部分的分子量介于0.2-500 kDal之间。
14. 权利要求11-13的制品，其中所述缀合物中的菌毛蛋白肽含有确定为SEQ ID NO: 10的序列。
15. 权利要求14的制品，其中引入管道的所述缀合物中的菌毛蛋白肽含有确定为SEQ ID NO: 3、4或9的序列。
16. 权利要求11-15的制品，其中所述制品的一个或多个暴露的表面是金属表面。
17. 权利要求11-16的制品，其中所述制品的一个或多个暴露的表面是不锈钢表面，并且涂布所述表面的所述肽缀合物以足以降低所述表面的腐蚀速率的量存在。
18. 权利要求11-17的制品，所述制品是其内壁表面用所述肽缀合物涂布的管道，并且涂布所述表面的所述肽缀合物以足以减少流过所述管道的流体的摩擦拽力的量存在。
19. 权利要求11-17的制品，所述制品是宽度尺寸为100微米或更小的微流体通道，其内壁表面用所述肽缀合物涂布并且涂布所述表面的所述肽缀合物以足以减少流体流过所述通道的摩擦拽力的量存在。
20. 权利要求11-17的制品，所述制品包括砂颗粒，其外表面用足量的所述肽缀合物涂布，以减少所述涂布的颗粒浆液流过管道的摩擦拽力。
21. 权利要求11-17的制品，所述制品是具有活动部件的机器，其涂布肽的表面是彼此移动接触的。
22. 权利要求11-17的制品，所述制品是具有用所述肽缀合物涂布的暴露的金属表面的电子器件。
23. 权利要求11-17的制品，所述制品是具有不锈钢或钛表面的矫形植入器件，并且涂布所述表面的所述肽缀合物以足以抑制涂布的表面上生物膜形成的量存在。
24. 一种制品，所述制品包括：
(i) 具有暴露的表面的元件，其可在普通使用条件下被非假单胞菌细菌用作生物膜形成的基底，和
(ii) 与所述表面结合的D型或逆-倒位的合成的菌毛蛋白肽，所述合成的菌毛蛋白肽含有衍生自IV型铜绿假单胞菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受体结合蛋白的二硫环和含有位于所述环的N-末端侧或C-末端侧或这两末端侧的0-10个额外残基，和任选共价连接于所述肽的聚乙二醇部分，所述肽的量有效地抑制这类非假单胞菌细菌的生物膜形成。
25. 权利要求24的制品，所述制品是旨在植入或驻留体内的医疗器件，其中结合到所述制品表面的所述菌毛蛋白肽是缀合到聚乙二醇部分的D型菌毛蛋白肽。
26. 权利要求24-25的制品，其中所述肽缀合物中的聚乙二醇部分的分子量介于0.2-500 kDal之间。
27. 权利要求24-26的制品，其中所述菌毛蛋白肽含有确定为SEQ ID NO: 10的序列。
28. 权利要求24-27的制品，其中所述菌毛蛋白肽含有确定为SEQ ID NO: 3、4或9的序列。
29. 权利要求24-28的制品，与所述合成的菌毛蛋白肽结合的所述制品的表面选自金属、聚合物、陶瓷或硅酸盐表面。
30. 权利要求24-29的制品，其中与所述合成的菌毛蛋白肽结合的所述制品的表面是选自不锈钢、碳钢、钛、铜、黄铜、锡、铁、银、和镁及其合金的金属表面。
31. 权利要求24-30的制品，其中与所述合成的菌毛蛋白肽结合的所述制品的表面是不锈钢表面，和所述菌毛蛋白肽与所述表面共价结合。
32. 权利要求24-30的制品，所述制品用于抑制利斯特氏菌或葡萄球菌的生物膜形成，其中所施加的菌毛蛋白肽的量分别有效地抑制利斯特氏菌或葡萄球菌的生物膜形成。
33. 在处理具有暴露的晶粒边界区的表面的金属材料的方法中为了降低所述材料的腐蚀速率的改进，所述改进包括：
使所述材料中的暴露的表面边界区与D型或逆-倒位的合成的菌毛蛋白肽接触，所述合成的菌毛蛋白肽含有衍生自IV型铜绿假单胞菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受体结合蛋白的二硫环和含有位于所述环的N-末端侧或C-末端侧或这两末端侧的0-10个额外残基，和任选共价连接于所述肽的聚乙二醇部分，所述肽的量有效地抑制所述材料的腐蚀速率。
34. 权利要求33的改进，其中所述菌毛蛋白肽缀合物是具有共价连接于所述肽的C-末端或N-末端的一端或两端的聚乙二醇部分的D型菌毛蛋白肽。
35. 权利要求33-34的改进，其中连接于所述肽的聚乙二醇部分的分子量介于0.2-500 kDal之间。
36. 权利要求33-35的改进，其中所述菌毛蛋白肽含有确定为SEQ ID NO: 10的序列。
37. 权利要求33-36的改进，其中引入管道的所述缀合物中的菌毛蛋白肽含有确定为SEQ ID NO: 3、4或9的序列。
38. 权利要求33-37的改进，其中所述接触有效地使暴露的晶粒边界区的电子功函变化至少0.3 eV EFW单位并使暴露的晶粒边界区的硬度增加至少20%，所述硬度通过用原子力显微镜的尖端以给定力冲击金属表面产生的纳米压痕来测定。
39. 权利要求33-38的改进，其中所述金属选自不锈钢、碳钢、钛、铜、黄铜、锡、铁、银、和镁及其合金。
40. 权利要求33-39的改进，其中所述金属材料是不锈钢，和所述接触步骤使涂布表面的腐蚀速率降低至少30%，所述腐蚀速率通过穿过所述表面的腐蚀电流来测定。
41. 权利要求33-40的改进，其中所述金属材料是多孔的或网状的，和实施所述接触步骤以使所述菌毛蛋白肽与由所述材料内的孔或网眼确定的内表面结合。
42. 权利要求33-40的改进，其中所述金属材料具有暴露的晶粒边界区，和所述接触步骤有效地使所述菌毛蛋白肽与所述晶粒边界区选择性地结合，由此通过优先保护在其晶粒边界区处的表面来增强金属表面的硬度和腐蚀抗性。
43. 一种抑制对设计成植入受试者内的医疗器件的炎性反应的方法，所述方法包括：
在植入所述器件之前，用合成的菌毛蛋白肽涂布所述器件的暴露的表面，所述合成的菌毛蛋白肽含有(i)衍生自IV型铜绿假单胞菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受体结合蛋白的二硫环，(ii)位于所述环的N-末端侧或C-末端侧或这两个末端侧的0-10个额外残基，和(iii)包含逆-倒位(RI)型的D-氨基酸，和任选具有共价连接于所述肽的聚乙二醇部分。
44. 权利要求43的方法，其中所述菌毛蛋白肽是具有共价连接于所述肽的C-末端或N-末端的一端或两端的聚乙二醇部分的D型菌毛蛋白肽。
45. 权利要求43-44的方法，其中连接于所述肽的聚乙二醇部分的分子量介于0.2-500 kDal之间。
46. 权利要求43-45的方法，其中所述菌毛蛋白肽含有确定为SEQ ID NO: 10的序列。
47. 权利要求43-46的方法，其中引入管道的所述缀合物中的菌毛蛋白肽含有确定为SEQ ID NO: 3、4或9的序列。
48. 一种用于检测分析物的生物传感器器件，所述器件包括：
(a) 导电金属基底，其具有(i)生物传感器表面(ii)与所述基底表面结合的D型(RI)合成的菌毛蛋白肽，所述合成的菌毛蛋白肽含有衍生自IV型铜绿假单胞菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受体结合蛋白的二硫环和含有位于所述环的N-末端侧或C-末端侧或这两末端侧的0-10个额外残基，和任选具有共价连接于所述肽的聚乙二醇部分，和(iii)直接或间接地共价连接于所述菌毛蛋白肽的受体，和
(b) 用于检测响应分析物相关配体与表面结合的受体的结合的穿过基底表面的电学性质变化的检测器。
49. 权利要求48的生物传感器器件，其中所述生物传感器基底由不锈钢形成，并且结合在其上的菌毛蛋白肽是D型菌毛蛋白肽。
50. 权利要求48-49的生物传感器器件，其中所述受体通过卷曲螺旋E/K螺旋对而共价连接于菌毛蛋白肽，所述螺旋对中的一个共价连接于菌毛蛋白肽，而另一个则连接于受体上。
51. 使化合物共价连接于由不锈钢、锡、铁或钛形成的基底的一个或多个暴露的表面的方法，所述方法包括：
使所述基底的一个或多个暴露的表面与D型合成的菌毛蛋白肽接触，所述合成的菌毛蛋白肽含有衍生自IV型铜绿假单胞菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受体结合蛋白的二硫环和含有位于所述环的N-末端侧或C-末端侧或这两末端侧的0-10个额外残基，和任选具有共价连接于所述肽的聚乙二醇部分，由此使所述菌毛蛋白肽共价地结合到一个或多个暴露的表面，和
在所述接触和结合之前或之后，使所述化合物共价连接于所述菌毛蛋白肽。
52. 权利要求51的方法，其中所述基底表面具有暴露的晶粒边界区，并且所述接触步骤有效地使所述化合物优先定位在暴露的晶粒边界区处。
53. 权利要求51-52的方法，其中所述菌毛蛋白肽是具有共价连接于所述肽的C-末端或N-末端的一端或两端的聚乙二醇部分的D型菌毛蛋白肽。
54. 权利要求51-53的方法，其中连接于所述肽的聚乙二醇部分的分子量介于0.2-500 kDal之间。
55. 权利要求51-54的方法，其中所述菌毛蛋白肽含有确定为SEQ ID NO: 10的序列。
56. 权利要求51-55的方法，其中所述化合物选自肽、寡糖、脂质、核酸和有机小分子。
57. 权利要求51-56的方法，其中所述材料是多孔的或网状的，并且所述接触有效地使所述菌毛蛋白肽与由所述材料内的孔或网眼确定的内表面结合。
58. 一种基底，其表面结合有(i) D型合成的菌毛蛋白肽，所述合成的菌毛蛋白肽含有衍生自IV型铜绿假单胞菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受体结合蛋白的二硫环和含有位于所述环的N-末端侧或C-末端侧或这两末端侧的0-10个额外残基，和任选具有共价连接于所述肽的聚乙二醇部分，和(ii)化合物，所述化合物直接或间接地共价连接于所述菌毛蛋白肽。
59. 权利要求58的基底，所述基底由选自不锈钢、碳钢、钛、铜、黄铜、锡、铁、银、和镁及其合金的金属形成，并且所述基底用作生物传感器电响应元件，其中所述化合物是通过共价键直接连接于所述菌毛蛋白肽或通过K/E螺旋的/螺旋对间接连接于所述菌毛蛋白肽的分析物受体分子，其中所述螺旋中的一个共价连接于所述菌毛蛋白肽，而另一个螺旋共价连接于所述化合物。
60. 权利要求58-59的基底，其中所述菌毛蛋白肽是具有共价连接于所述肽的C-末端或N-末端的一端或两端的聚乙二醇部分的D型菌毛蛋白肽。
61. 权利要求58-60的基底，其中连接于所述肽的聚乙二醇部分的分子量介于0.2-500 kDal之间。
62. 权利要求58-61的基底，其中所述菌毛蛋白肽含有确定为SEQ ID NO: 10的序列。
63. 权利要求58-62的基底，其中引入管道的所述缀合物中的菌毛蛋白肽含有确定为SEQ ID NO: 3、4或9的序列。
64. 权利要求58-63的基底，所述基底由不锈钢形成，并且所述基底可因所述菌毛蛋白肽结合在其表面而具有改变的电子功函。
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