CN103911454B - 基于苝激基缔合物的甲基化酶活性的检测方法及其甲基化酶抑制剂的筛选方法 - Google Patents

基于苝激基缔合物的甲基化酶活性的检测方法及其甲基化酶抑制剂的筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供基于苝激基缔合物的甲基化酶活性的检测方法及其甲基化酶抑制剂的筛选方法，属于生物技术领域。该方法先制备双链DNA，然后将双链DNA与S-腺苷甲硫氨酸、限制性内切酶和不同浓度的甲基化酶反应，得到混合溶液；将末端脱氧核苷酸转移酶、脱氧核糖核苷三磷酸和TdT反应缓冲液与混合溶液反应，得到反应溶液；最后将苝衍生物探针与聚阳离子的混合溶液和反应溶液反应，对甲基化酶的活性进行荧光检测。本发明还提供一种甲基化酶抑制剂的筛选方法。本发明利用小分子探针单体与激基缔合物荧光强度比值的变化来检测甲基化酶和抑制剂的活性，测试给出的是两个荧光信号的比值，比起单纯荧光增强或减弱的信号，不易受到干扰，灵敏度更高。

Description

基于苝激基缔合物的甲基化酶活性的检测方法及其甲基化酶抑制剂的筛选方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及基于苝激基缔合物的甲基化酶活性的检测方法及其甲基化酶抑制剂的筛选方法。
背景技术
激基缔合物（excimer）是指两个同种分子和原子的聚集体，在激发态时两个分子或原子的作用较强，产生新的能级，发射光谱不同于单个物种，无精细结构。而在基态时作用较弱或无作用。激基缔合物（excimer）荧光具有其较大的stokes位移和较长的荧光寿命，在生物分析和传感中已经有不少应用。许多具有平面芳环结构的分子都具有激基缔合物荧光。苝衍生物是一类稠环共轭化合物，它有大的π-π共轭电子结构，具有优良的荧光量子效率和光，热稳定性。通过化学修饰，可以使它带上一个亲水的基团R，它可以为带负电荷的磺酸基团，羧酸基团，或是带正电荷的季铵盐。
现目前，越来越多的人体疾病被发现与异常的DNA甲基化有关系，在S-腺苷甲硫氨酸（SAM）存在的情况下，DNA甲基化酶能够催化DNA的甲基化过程。因此，对DNA甲基化酶活性及其抑制剂的筛选对于基础的生物学研究，药物发现，基因疾病诊断治疗具有重要的意义。
许多传统的方法如电泳，高效液相色谱，聚合酶链式反应，酶联免疫吸附测定等已经被用作甲基化酶活性的检测。近些年来，越来越多的基于电化学，比色，荧光的方法已经被报道。如2007年TanWeihong等人设计了一种带有5’-G-A-T-C-3’识别位点的分子信标，用来检测甲基化酶（Anal.Chem.2007,79,1050–1056）。分子信标的5’端和3’端分别修饰了荧光集团和猝灭集团。在甲基化酶和限制性内切酶的存在下，Dam甲基化酶可以催化5’-G-A-T-C-3’序列中的A碱基甲基化，限制性内切酶切割了5’-G-Am-T-C-3’序列，导致分子信标的荧光恢复。然而由于荧光集团和猝灭集团的修饰，使得方法有过程繁琐，耗时，且成本高等缺陷。2011年，一种利用氧化石墨烯猝灭荧光的性质来检测甲基化酶的方法被报道（Anal.Chem.2011,83,8906–8912），该方法设计了作为酶切底物的DNA（图3）,其中单链的部分是用来与氧化石墨烯结合的，双链的部分带有甲基化酶和限制性内切酶的识别位点。同时在双链的末端修饰了荧光集团，由于单链与石墨烯结合，石墨烯能够猝灭荧光集团的荧光，当有限制性内切酶存在时，识别位点被切割，荧光恢复。但是，当甲基化酶和限制性内切酶同时存在时，甲基化酶催化识别位点甲基化，识别位点序列被甲基化后阻碍了内切酶的切割，此时，荧光不能恢复。此方法也有一些不足之处，首先纳米材料的制备过程同样繁琐且成本高，需要耗费相当的时间和资金；其次荧光集团的共价修饰也是过程繁琐成本高；另外给出的是淬灭的荧光信号，相比于荧光增强更容易受到干扰信号的影响。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有的甲基化酶活性的检测方法和甲基化酶抑制剂的筛选方法耗时、成本高且灵敏度低的问题，而提供一种基于苝激基缔合物的甲基化酶活性的检测方法及其甲基化酶抑制剂的筛选方法。
本发明首先提供一种基于苝激基缔合物的甲基化酶活性的检测方法，包括如下：
步骤一：制备双链DNA；
步骤二：将步骤一得到的双链DNA与S-腺苷甲硫氨酸、限制性内切酶和不同浓度的甲基化酶反应，得到混合溶液；
步骤三：将末端脱氧核苷酸转移酶、脱氧核糖核苷三磷酸和末端脱氧核苷酸转移酶反应缓冲液与步骤二得到的混合溶液反应，得到反应溶液；
步骤四：将苝衍生物探针与聚阳离子的混合溶液和步骤三得到的反应溶液反应，对甲基化酶的活性进行荧光检测。
优选的是，所述的甲基化酶为Dam、HpaII或M.SssI。
优选的是，所述的甲基化酶的浓度范围为0-80U/mL。
优选的是，所述的步骤四中的聚阳离子的结构式为：
优选的是，所述的步骤四的反应温度为37℃，反应时间为5min。
本发明还提供一种基于苝激基缔合物的甲基化酶抑制剂的筛选方法，包括如下：
步骤一：制备双链DNA；
步骤二：将步骤一得到的双链DNA与S-腺苷甲硫氨酸、限制性内切酶、甲基化酶和不同浓度的甲基化酶抑制剂反应，得到混合溶液；
步骤三：将末端脱氧核苷酸转移酶、脱氧核糖核苷三磷酸和末端脱氧核苷酸转移酶反应缓冲液与步骤二得到的混合溶液反应，得到反应溶液；
步骤四：将苝衍生物探针与聚阳离子的混合溶液和步骤三得到的反应溶液反应，对甲基化酶抑制剂用荧光的方法进行筛选。
优选的是，所述的甲基化酶抑制剂为庆大霉素、5-氟尿嘧啶、卞青霉素或丝裂霉素。
优选的是，所述的甲基化酶抑制剂的浓度范围为0-1μM。
优选的是，所述的步骤四中的聚阳离子的结构式为：
优选的是，所述的步骤四的反应温度为37℃，反应时间为5min。
本发明的原理
本发明提供一种基于苝激基缔合物的甲基化酶活性的检测方法及其甲基化酶抑制剂的筛选方法，该方法先制备双链DNA，当加入被测甲基化酶或甲基化酶抑制剂和对应的限制性内切酶时，双链核酸被切割为两部分，并且核酸链长度得到延伸；另一方面，将带负电荷的苝衍生物探针和带正电荷的聚合物混合，通过静电吸引作用诱导探针集聚，从而探针的单体荧光淬灭，并生成了激基缔合物荧光，延伸后的核酸加入到探针与聚阳离子的混合液中，核酸能够与聚阳离子结合，将被聚阳离子诱导集聚的探针分子释放，单体荧光恢复，激基缔合物荧光下降，通过这种方法对甲基化酶活性进行检测或对甲基化酶抑制剂进行筛选。
本发明的有益效果
本发明首先提供一种基于苝激基缔合物的甲基化酶活性的检测方法，该方法先制备双链DNA，然后将双链DNA与S-腺苷甲硫氨酸、限制性内切酶和不同浓度的甲基化酶反应，得到混合溶液；将末端脱氧核苷酸转移酶、脱氧核糖核苷三磷酸和TdT反应缓冲液与混合溶液反应，得到反应溶液；最后将苝衍生物探针与聚阳离子的混合溶液和反应溶液反应，对甲基化酶的活性进行荧光检测。本发明的检测方法首次将将苝探针激基缔合物荧光用于甲基化酶活性的检测，缔合物荧光具有大的斯托克斯位移和较长的荧光寿命，降低背景荧光干扰，和现有技术相比，本发明利用小分子探针单体与激基缔合物荧光强度比值（IM/IE）的变化来检测甲基化酶的活性，测试给出的是两个荧光信号的比值，比起单纯荧光增强或减弱的信号，不易受到干扰，灵敏度更高；同时，本发明的方法简单、测试成本低，且本发明的方法是免标记的，不需要共价修饰。
本发明还提供一种基于苝激基缔合物的甲基化酶抑制剂的筛选方法，该方法先制备双链DNA；然后将双链DNA与S-腺苷甲硫氨酸、限制性内切酶、甲基化酶和不同浓度的甲基化酶抑制剂反应，得到混合溶液；将末端脱氧核苷酸转移酶、脱氧核糖核苷三磷酸和TdT反应缓冲液与混合溶液反应，得到反应溶液；最后将苝衍生物探针与聚阳离子的混合溶液和反应溶液反应，对甲基化酶抑制剂用荧光的方法进行筛选。本发明的检测方法首次将将苝探针激基缔合物荧光用于甲基化酶抑制剂的筛选，缔合物荧光具有大的斯托克斯位移和较长的荧光寿命，降低背景荧光干扰，和现有技术相比，本发明利用小分子探针单体与激基缔合物荧光强度比值（IM/IE）的变化来筛选甲基化酶抑制剂，测试给出的是两个荧光信号的比值，比起单纯荧光增强或减弱的信号，不易受到干扰，灵敏度更高；同时，本发明的方法简单、测试成本低。
附图说明
图1分别为苝衍生物探针和实施例1得到的苝衍生物探针与聚阳离子的混合溶液的荧光光谱图。
图2为本发明实施例1将混合溶液与苝衍生物探针与聚阳离子的混合溶液混合前后，探针荧光光谱的曲线图。
图3为本发明实施例1甲基化酶浓度随着探针IM/IE的变化曲线图。
图4为本发明实施例1甲基化酶浓度的对数值随着探针IM/IE的变化曲线图；
图5为本发明实施例4甲基化酶Dam的相对活性随庆大霉素浓度的变化曲线。
具体实施方式
本发明首先提供一种基于苝激基缔合物的甲基化酶活性的检测方法，包括如下：
步骤一：制备双链DNA；
步骤二：将步骤一得到的双链DNA与S-腺苷甲硫氨酸、限制性内切酶和不同浓度的甲基化酶反应，得到混合溶液；
步骤三：将末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）、脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）和TdT反应缓冲液与步骤二得到的混合溶液反应，得到反应溶液；
步骤四：将苝衍生物探针与聚阳离子的混合溶液和步骤三得到的反应溶液反应，对甲基化酶的活性进行荧光检测。
按照本发明，步骤一所述的制备双链DNA方法是现有技术常用的方法，没有特殊限制，优选为：将含有甲基化酶特定识别序列的两条互补的核酸链等量混合于缓冲溶液中，在90℃水浴锅中10min，然后冷却至室温，即获得双链DNA。所述的甲基化酶特定识别序列的两条互补的核酸链根据甲基化酶种类的不同，识别序列是不同的。所述的缓冲溶液优选包括：2mMTris-HAc，5mMKAc，1mMMg(Ac)2，pH7.9。
按照本发明，将制备得到的双链DNA与S-腺苷甲硫氨酸（SAM）、限制性内切酶和不同浓度的甲基化酶反应，得到混合溶液；所述的甲基化酶优选为Dam、HpaII或M.SssI，所述的甲基化酶的浓度范围优选为0-80U/mL。所述的限制性内切酶根据甲基化酶种类的不同而不同，优选为DpnI、HpaII、或BstUI,其中DpnI是能够选择性的切割被甲基化酶甲基化后的核酸序列的限制性内切酶，而HpaII和BstUI则是选择性的切割没有被甲基化的核酸序列的限制性内切酶。所述的步骤二的酶反应体系优选为：50μL总体系，包括浓度为400nM双链DNA、2.5μL反应缓冲液[10×buffer:200mMTris-HAc,500mMKAc,100mMMg(Ac)2,10mMDTT,pH7.9],浓度为160μMS-腺苷甲硫氨酸（SAM），浓度为200U/mL限制性内切酶和浓度范围为0-80U/mL甲基化酶，余量为去离子水。所述的反应优选条件为：先在37℃下反应2个小时，后置于90℃水浴锅中10min，使甲基化酶和限制性内切酶失活，最后冷却至室温，得到混合溶液。
按照本发明，步骤三所述的缓冲溶液优选包括：5μL,10×buffer:125mMTris-HAc,1MK2CO3，1mMCoCl2,0.05%(v/v)TritonX-100,pH7.2。所述的末端脱氧核苷酸转移酶的浓度优选为8U，脱氧核糖核苷三磷酸的浓度优选为200μM。反应条件优选为：先在37℃下反应4个小时，后置于90℃水浴锅中10min，使TdT失活，最后冷却至室温，得到反应溶液。
按照本发明，步骤四所述的苝衍生物探针与聚阳离子的混合溶液是将苝衍生物探针与聚阳离子聚合物混合得到的，所述的带有负电荷的苝衍生物的荧光探针在水溶液中主要以单体形式存在，当加入带有正电荷的聚合物,聚合物能通过正负电荷吸引作用诱导探针集聚，导致探针的单体荧光猝灭。当探针的浓度越来越大时，伴随单体荧光猝灭的同时，在更长的波段出现一个新的发射峰，即苝分子的激基缔合物荧光。
所述的苝衍生物探针的浓度优选为10μM，聚阳离子聚合物的浓度优选为30或18μM，所述的苝衍生物探针的结构式为：
所述的步骤四中的聚阳离子聚合物的结构式优选为：
按照本发明，将苝衍生物探针与聚阳离子的混合溶液和反应溶液反应，带有负电荷的荧光探针在聚阳离子的诱导下集聚，当在溶液中加入带有单链核酸时，由于核酸是一种聚阴离子，它能与聚阳离子结合形成双链结构，导致探针分子被释放，单体荧光恢复，同时缔合物荧光下降，甲基化酶浓度与探针的单体与激基缔合物荧光强度的比值（IM/IE）存在线型关系，通过这种方法对甲基化酶进行定量分析。所述的反应温度优选为37℃，反应时间为5min。所述的荧光检测的条件为：荧光激发波长为470nm，激发和发射所用的狭缝宽均为7nm，荧光比色皿光程为10mm。
本发明还提供一种基于苝激基缔合物的甲基化酶抑制剂的筛选方法，包括如下：
步骤一：制备双链DNA；
步骤二：将步骤一得到的双链DNA与S-腺苷甲硫氨酸、限制性内切酶、甲基化酶和不同浓度的甲基化酶抑制剂反应，得到混合溶液；
步骤三：将末端脱氧核苷酸转移酶、脱氧核糖核苷三磷酸和末端脱氧核苷酸转移酶反应缓冲液与步骤二得到的混合溶液反应，得到反应溶液；
步骤四：将苝衍生物探针与聚阳离子的混合溶液和步骤三得到的反应溶液反应，对甲基化酶抑制剂用荧光方法进行筛选。
按照本发明，步骤一所述的制备双链DNA方法是现有技术常用的方法，没有特殊限制，优选为：将含有甲基化酶特定识别序列的两条互补的核酸链等量混合于缓冲溶液中，在90℃水浴锅中10min，然后冷却至室温，即获得双链DNA。所述的甲基化酶特定识别序列的两条互补的核酸链根据甲基化酶种类的不同，识别序列是不同的。所述的缓冲溶液优选包括：2mMTris-HAc，5mMKAc，1mMMg(Ac)2，pH7.9。
按照本发明，将制备得到的双链DNA与S-腺苷甲硫氨酸、限制性内切酶、甲基化酶和不同浓度的甲基化酶抑制剂反应，得到混合溶液；所述的甲基化酶抑制剂优选为庆大霉素、5-氟尿嘧啶、卞青霉素或丝裂霉素。所述的甲基化酶抑制剂的浓度范围优选为0-1μM。所述的限制性内切酶根据甲基化酶种类的不同而不同，优选为DpnI、HpaII、或BstUI,其中DpnI是能够选择性的切割被甲基化酶甲基化后的核酸序列的限制性内切酶，而HpaII和BstUI则是选择性的切割没有被甲基化的核酸序列的限制性内切酶。所述的步骤二的酶反应体系优选为：50μL总体系，包括浓度为400nM双链DNA、2.5μL反应缓冲液[10×buffer:200mMTris-HAc,500mMKAc,100mMMg(Ac)2,10mMDTT,pH7.9],浓度为160μMS-腺苷甲硫氨酸（SAM），浓度为200U/mL限制性内切酶、浓度为20U/mL的甲基化酶和浓度范围为0-1μM甲基化酶抑制剂，余量为去离子水。所述的反应优选条件为：先在37℃下反应2个小时，后置于90℃水浴锅中10min，使甲基化酶和限制性内切酶失活，最后冷却至室温，得到混合溶液。
按照本发明，步骤三所述的缓冲溶液优选包括：5μL,10×buffer:125mMTris-HAc,1MK2CO3，1mMCoCl2,0.05%(v/v)TritonX-100,pH7.2。所述的末端脱氧核苷酸转移酶的浓度优选为8U，脱氧核糖核苷三磷酸的浓度优选为200μM。反应条件优选为：先在37℃下反应4个小时，后置于90℃水浴锅中10min，使TdT失活，最后冷却至室温，得到反应溶液。
按照本发明，步骤四所述的苝衍生物探针与聚阳离子的混合溶液是将苝衍生物探针与聚阳离子聚合物混合得到的，所述的带有负电荷的苝衍生物的荧光探针在水溶液中主要以单体形式存在，当加入带有正电荷的聚合物,聚合物能通过正负电荷吸引作用诱导探针集聚，导致探针的单体荧光猝灭。当探针的浓度越来越大时，伴随单体荧光猝灭的同时，在更长的波段出现一个新的发射峰，即苝分子的激基缔合物荧光。
所述的苝衍生物探针的浓度优选为10μM，聚阳离子聚合物的浓度优选为30或18μM，所述的苝衍生物探针的结构式为：
所述的步骤四中的聚阳离子聚合物的结构式优选为：
按照本发明，将苝衍生物探针与聚阳离子的混合溶液和反应溶液反应，带有负电荷的荧光探针在聚阳离子的诱导下集聚，当在溶液中加入带有单链核酸时，由于核酸是一种聚阴离子，它能与聚阳离子结合形成双链结构，导致探针分子被释放，单体荧光恢复，同时缔合物荧光下降。随着甲基化酶抑制剂浓度的增加，探针的单体与激基缔合物荧光强度的比值（IM/IE）逐渐变小，说明此方法能够成功用于甲基化酶抑制剂的筛选。所述的反应温度优选为37℃，反应时间为5min。所述的荧光检测的条件为：荧光激发波长为470nm，激发和发射所用的狭缝宽均为7nm，荧光比色皿光程为10mm。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的描述
实施例1
将等量的核酸链DNA-a（5’-GTTGGGATCGAGAAGddC-3’）和DNA-b（5’-CTTCTCGATCCCAACddC-3’）混合于缓冲溶液[2mMTris-HAc,5mMKAc,1mMMg(Ac)2,pH7.9]中，在90℃水浴锅中10min，然后冷却至室温，即可获得双链DNA（dsDNA-1）；
在50μL的酶反应体系中，将400nMdsDNA-1、2.5μL反应缓冲液[10×buffer:200mMTris-HAc,500mMKAc,100mMMg(Ac)2,10mMDTT,pH7.9]、160μMS-腺苷甲硫氨酸（SAM）,200U/mL限制性内切酶（DpnI）和不同浓度的甲基化酶Dam（浓度分别为0、0.2、0.5、1、2、2.5、10、20、40和80U/mL），置于37℃下2个小时，后置于90℃水浴锅中10min，使甲基化酶和限制性内切酶失活，最后冷却至室温，得到混合溶液；
向混合溶液中加入8U末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）、200μM脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）和5μLTdT反应缓冲液[5μL,10×buffer:125mMTris-HAc,1MK2CO3，1mMCoCl2,0.05%(v/v)TritonX-100,pH7.2]，置于37℃下4个小时，后置于90℃水浴锅中10min使TdT失活，得到反应溶液；
将上述反应溶液加入到含有10μM苝衍生物探针和18μM聚阳离子的混合液中，最终加水至体系为500μL，置于37℃下5min后进行荧光检测。
所述的聚阳离子聚合物的结构式为：
图1分别为苝衍生物探针（曲线1）和实施例1得到的苝衍生物探针与聚阳离子的混合溶液（曲线2）的荧光光谱图。从图1可以看出，随着聚阳离子的加入，探针的单体荧光被淬灭，同时在680nm处出现了一个新的吸收峰，说明聚阳离子能够诱导探针集聚，从而形成苝的激基缔合物荧光。
图2为本发明实施例1将混合溶液与苝衍生物探针与聚阳离子的混合溶液混合前后，探针荧光光谱的曲线图。图中的曲线1是没加入混合溶液前，苝衍生物探针与聚阳离子的混合溶液的荧光光谱图；图中的曲线2是加入混合溶液后，苝衍生物探针与聚阳离子的混合溶液的荧光光谱图；从图2可以看出，当核酸加入到苝衍生物探针与聚阳离子的混合溶液时，探针IM/IE值升高，说明了带有负电荷的核酸能够与聚阳离子结合，导致探针分子被释放。
图3为本发明实施例1甲基化酶浓度随着探针IM/IE的变化曲线图；从图3可以看出，随着Dam酶浓度的增加，探针IM/IE值逐渐升高，说明我们的方法能够用于甲基化酶Dam的定量检测。
图4为本发明实施例1甲基化酶浓度的对数值随着探针IM/IE的变化曲线图；从图4可以看出，在酶浓度为0.2,0.5,1,2,2.5,10U/mL范围内探针IM/IE值随着Dam酶浓度的对数值线性增加，说明在一定酶浓度范围内Dam酶浓度与IM/IE值成线性关系。
实施例2
将等量的核酸链DNA-a（5’-GTTGGCCGGGAGAAGddC-3’）和DNA-b（5’-CTTCTCCCGGCCAACddC-3’）混合于缓冲溶液[2mMTris-HAc,5mMKAc,1mMMg(Ac)2,pH7.9]中，在90℃水浴锅中10min，然后冷却至室温，即可获得双链DNA（dsDNA-1）；
在50μL的酶反应体系中，将400nMdsDNA-1、2.5μL反应缓冲液[10×buffer:200mMTris-HAc,500mMKAc,100mMMg(Ac)2,10mMDTT,pH7.9]、160μMS-腺苷甲硫氨酸（SAM）,200U/mL限制性内切酶（HpaII）和不同浓度的甲基化酶HpaII（浓度分别为0、0.2、0.5、1、2、2.5、10、20、40和80U/mL），置于37℃下2个小时，后置于90℃水浴锅中10min，使甲基化酶和限制性内切酶失活，最后冷却至室温，得到混合溶液；
向混合溶液中加入8U末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）、200μM脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）和5μLTdT反应缓冲液[5μL,10×buffer:125mMTris-HAc,1MK2CO3，1mMCoCl2,0.05%(v/v)TritonX-100,pH7.2]，置于37℃下4个小时，后置于90℃水浴锅中10min使TdT失活，得到反应溶液；
将上述反应溶液加入到含有10μM苝衍生物探针和30μM聚阳离子的混合液中，最终加水至体系为500μL，置于37℃下5min后进行荧光检测。
所述的聚阳离子聚合物的结构式为：
实施例3
将等量的核酸链DNA-a（5’-GTTGGCGGAGAAGddC-3’）和DNA-b（5’-CTTCTCCGCCAACddC-3’）混合于缓冲溶液[2mMTris-HAc,5mMKAc,1mMMg(Ac)2,pH7.9]中，在90℃水浴锅中10min，然后冷却至室温，即可获得双链DNA（dsDNA-1）；
在50μL的酶反应体系中，将400nMdsDNA-1、2.5μL反应缓冲液[10×buffer:200mMTris-HAc,500mMKAc,100mMMg(Ac)2,10mMDTT,pH7.9]、160μMS-腺苷甲硫氨酸（SAM）,200U/mL限制性内切酶（BstUI）和不同浓度的甲基化酶M.SssI（浓度分别为0、0.2、0.5、1、2、2.5、10、20、40和80U/mL），置于37℃下2个小时，后置于90℃水浴锅中10min，使甲基化酶和限制性内切酶失活，最后冷却至室温，得到混合溶液；
向混合溶液中加入8U末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）、200μM脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）和5μLTdT反应缓冲液[5μL,10×buffer:125mMTris-HAc,1MK2CO3，1mMCoCl2,0.05%(v/v)TritonX-100,pH7.2]，置于37℃下4个小时，后置于90℃水浴锅中10min使TdT失活，得到反应溶液；
将上述反应溶液加入到含有10μM苝衍生物探针和18μM聚阳离子的混合液中，最终加水至体系为500μL，置于37℃下5min后进行荧光检测。
所述的聚阳离子聚合物的结构式为：
实施例4
将等量的核酸链DNA-a（5’-GTTGGGATCGAGAAGddC-3’）和DNA-b（5’-CTTCTCGATCCCAACddC-3’）混合于缓冲溶液[2mMTris-HAc,5mMKAc,1mMMg(Ac)2,pH7.9]中，在90℃水浴锅中10min，然后冷却至室温，即可获得双链DNA（dsDNA-1）；
在50μL的酶反应体系中，将400nMdsDNA-1、2.5μL反应缓冲液[10×buffer:200mMTris-HAc,500mMKAc,100mMMg(Ac)2,10mMDTT,pH7.9]、160μMS-腺苷甲硫氨酸（SAM）,20U/mL的甲基化酶（Dam），200U/mL限制性内切酶（DpnI）和不同浓度的庆大霉素（浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8和1μM），置于37℃下2个小时，后置于90℃水浴锅中10min，使甲基化酶和限制性内切酶失活，最后冷却至室温，得到混合溶液；
向混合溶液中加入8U末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）、200μM脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）和5μLTdT反应缓冲液[5μL,10×buffer:125mMTris-HAc,1MK2CO3，1mMCoCl2,0.05%(v/v)TritonX-100,pH7.2]，置于37℃下4个小时，后置于90℃水浴锅中10min使TdT失活，得到反应溶液；
将上述反应溶液加入到含有10μM苝衍生物探针和18μM聚阳离子的混合液中，最终加水至体系为500μL，置于37℃下5min后进行荧光检测。
所述的聚阳离子聚合物的结构式为：
图5为本发明实施例4甲基化酶Dam的相对活性随庆大霉素浓度的变化曲线。从图5可以看出，随着庆大霉素浓度的增加，酶相对活性值逐渐降低，说明庆大霉素能够抑制甲基化酶的活性，同时也说明此方法能够用于抑制剂庆大霉素的检测。
实施例5
将等量的核酸链DNA-a（5’-GTTGGGATCGAGAAGddC-3’）和DNA-b（5’-CTTCTCGATCCCAACddC-3’）混合于缓冲溶液[2mMTris-HAc,5mMKAc,1mMMg(Ac)2,pH7.9]中，在90℃水浴锅中10min，然后冷却至室温，即可获得双链DNA（dsDNA-1）；
在50μL的酶反应体系中，将400nMdsDNA-1、2.5μL反应缓冲液[10×buffer:200mMTris-HAc,500mMKAc,100mMMg(Ac)2,10mMDTT,pH7.9]、160μMS-腺苷甲硫氨酸（SAM）,20U/mL的甲基化酶（Dam），200U/mL限制性内切酶（DpnI）和不同浓度的5-氟尿嘧啶（浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8和1μM），置于37℃下2个小时，后置于90℃水浴锅中10min，使甲基化酶和限制性内切酶失活，最后冷却至室温，得到混合溶液；
向混合溶液中加入8U末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）、200μM脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）和5μLTdT反应缓冲液[5μL,10×buffer:125mMTris-HAc,1MK2CO3，1mMCoCl2,0.05%(v/v)TritonX-100,pH7.2]，置于37℃下4个小时，后置于90℃水浴锅中10min使TdT失活，得到反应溶液；
将上述反应溶液加入到含有10μM苝衍生物探针和18μM聚阳离子的混合液中，最终加水至体系为500μL，置于37℃下5min后进行荧光检测。
所述的聚阳离子聚合物的结构式为：
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种基于苝激基缔合物的甲基化酶活性的检测方法，其特征在于，包括如下：
步骤一：制备双链DNA；
步骤二：将步骤一得到的双链DNA与S-腺苷甲硫氨酸、限制性内切酶和不同浓度的甲基化酶反应，得到混合溶液；
步骤三：将末端脱氧核苷酸转移酶、脱氧核糖核苷三磷酸和末端脱氧核苷酸转移酶反应缓冲液与步骤二得到的混合溶液反应，得到反应溶液；
步骤四：将苝衍生物探针与聚阳离子的混合溶液和步骤三得到的反应溶液反应，对甲基化酶的活性进行荧光检测，同时记录荧光光谱的IM/IE值，IM/IE值随着甲基化酶浓度的对数值线性增加，以此检测甲基化酶的活性；IM为探针单体的荧光强度，IE为激基缔合物的荧光强度。
2.根据权利要求1所述的一种基于苝激基缔合物的甲基化酶活性的检测方法，其特征在于，所述的甲基化酶为Dam或M.SssI。
3.根据权利要求1所述的一种基于苝激基缔合物的甲基化酶活性的检测方法，其特征在于，所述的甲基化酶的浓度范围为0.2-80U/mL。
4.根据权利要求1所述的一种基于苝激基缔合物的甲基化酶活性的检测方法，其特征在于，所述的步骤四中的聚阳离子的结构式为：
5.根据权利要求1所述的一种基于苝激基缔合物的甲基化酶活性的检测方法，其特征在于，所述的步骤四的反应温度为37℃，反应时间为5min。
6.一种基于苝激基缔合物的甲基化酶抑制剂的筛选方法，其特征在于，包括如下：
步骤一：制备双链DNA；
步骤二：将步骤一得到的双链DNA与S-腺苷甲硫氨酸、限制性内切酶、甲基化酶和不同浓度的甲基化酶抑制剂反应，得到混合溶液；
步骤三：将末端脱氧核苷酸转移酶、脱氧核糖核苷三磷酸和末端脱氧核苷酸转移酶反应缓冲液与步骤二得到的混合溶液反应，得到反应溶液；
步骤四：将苝衍生物探针与聚阳离子的混合溶液和步骤三得到的反应溶液反应，随着甲基化酶抑制剂的浓度增加，甲基化酶相对活性值逐渐降低，以此对甲基化酶抑制剂进行筛选。
7.根据权利要求6所述的一种基于苝激基缔合物的甲基化酶抑制剂的筛选方法，其特征在于，所述的甲基化酶抑制剂为庆大霉素、5-氟尿嘧啶、卞青霉素或丝裂霉素。
8.根据权利要求6所述的一种基于苝激基缔合物的甲基化酶抑制剂的筛选方法，其特征在于，所述的甲基化酶抑制剂的浓度范围为0.2-1μM。
9.根据权利要求6所述的一种基于苝激基缔合物的甲基化酶抑制剂的筛选方法，其特征在于，所述的步骤四中的聚阳离子的结构式为：
10.根据权利要求6所述的一种基于苝激基缔合物的甲基化酶抑制剂的筛选方法，其特征在于，所述的步骤四的反应温度为37℃，反应时间为5min。
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