CN103908703A - 一种抗细胞衰老的骨组织工程支架材料及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种抗细胞衰老的骨组织工程支架材料及其制备方法与应用，以PCL-PLA支架为基础材料，采用CNT和IGF-1成功制备IGF-CNT-PCL-PLA骨组织工程支架材料，通过实验证明，细胞在本发明所制得的抗细胞衰老的骨组织工程支架材料上具有较强的生长活性，同时支架材料具有较好的抗细胞衰老效果。本发明所述抗细胞衰老的骨组织工程支架材料的制备方法简单易行，成本低廉，在骨组织工程支架材料或骨替代材料领域具有很好的应用前景，也利于日后的规模化生产。
Description
技术领域
本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种抗细胞衰老的骨组织工程支架材料及其制备方法与应用。
背景技术
骨组织的重要性和骨相关疾病带来的危害，加速了骨组织工程的发展。在此大背景下，骨组织工程因具有治疗骨相关损伤或疾病的巨大潜力，而成为修复损伤器官的新的前沿的方法。通常而言，骨组织工程的研究包含了三大元素：支架、细胞和生长因子。
上述三者中，对支架的研究是目前研究较为活跃的领域之一。近年来，许多研究者开发出了多种生物可降解材料，以应用于支架的构建。如聚乳酸（PLA）、聚乙醇酸（PGA）、共聚合乳酸乙醇酸（PLGA）和聚己内酯（PCL）等，在组织工程支架构建上显示出了良好的生物适应性。然而，随着骨组织工程的发展，单一的材料并不能满足其需要。目前，骨组织工程要求所用支架既是理想的骨替代物，又同时具有能够诱导骨细胞形成矿化组织的性能。因此，作为关键因素之一，构建和修饰支架同样值得我们关注。
尽管目前已开发出多种修饰骨组织工程支架的方案，但开发出最接近理想的技术仍然是一种挑战。近期研究表明，碳纳米管（CNT）具有优良的性能，使其覆盖材料表面以后，可以加速细胞的生长。但是，因为CNT缺乏良好的分散性而引起的体内毒性，所以，CNT的毒性和生物相容性缺陷同样存在。
在组织工程领域，生长因子是三要素之一，而在骨组织工程中，胰岛素类生长因子-1（IGF-1）等生长因子被认为是有效地加速骨相关细胞生长的生长因子，从而倍受重视。同时，细胞衰老是骨组织工程中值得关注的另一个问题。细胞衰老由许多原因引起，且许多蛋白关联到此过程中。
目前本领域当中尙未有相关碳纳米管光接枝胰岛素类生长因子制备抗细胞衰老的骨组织工程支架材料的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术在研究抗细胞衰老的骨组织工程支架材料方面的不足，提供一种抗细胞衰老的骨组织工程支架材料。
本发明的另一个目的是提供上述骨组织工程支架材料的应用。
本发明的上述目的通过如下技术方案予以实现：
一种抗细胞衰老的骨组织工程支架材料，通过如下步骤制备得到：
S1. 碳纳米管CNT功能化改性，所述功能化改性包括羧基化改性或羟基化改性；
S2. 将羧基化后的CNT与无水乙醇制成羧基化CNT悬浮液，浓度为0.1~0.3 mg/mL；将羟基化后的CNT与无水乙醇制成羟基化CNT悬浮液，浓度为0.1~0.3 mg/mL；
S3. 制备光活性胰岛素类生长因子-1（IGF-1），将IGF-1与N-琥珀酰亚胺酯按质量比为4~6：16~18混合反应、离心、干燥制得光活性IGF-1；
S4. 将光活性IGF-1溶于磷酸缓冲液PBS中，配制浓度为0.5~1.5 ng/μL的光活性IGF-1溶液；
S5. 将基础支架聚己内酯-聚乳酸PCL-PLA支架裁剪成合适大小，先采用过氧化氢溶液预处理，然后置于羟基化CNT悬浮液中震荡100~140 min，风干后再置于羧基化CNT悬浮液中静置10~14 h制得CNT支架（CNT-PCL-PLA）；
S6. 在CNT-PCL-PLA支架上滴加光活性IGF-1溶液、自然干燥、紫外灯照射后即得产品IGF-1、CNT共修饰型支架（IGF-CNT-PCL-PLA）。
作为一种实施方案，步骤S1中所述羧基化改性的具体步骤为将CNT分散于浓度为2.5 mol/L的硝酸溶液中，超声与搅拌交替处理48 h后将CNT离心分离、洗涤、干燥；然后再将干燥后的CNT分散于浓硝酸与浓硫酸体积比为1:3的混酸溶液中，超声与搅拌处理4 h 后将CNT离心分离、洗涤、干燥；最后将干燥后的CNT分散于质量分数为20%的过氧化氢水溶液，超声与搅拌交替处理2 h，洗涤、干燥后备用。优选地，所述羧基化改性的原料CNT为长1~2μm、直径60~100nm的短碳纳米管S-CNT。
优选地，所述硝酸溶液、混酸溶液或过氧化氢水溶液的用量为100 mL每1g CNT。
作为一种实施方案，步骤S1中所述羟基化改性的具体步骤为将CNT与KOH按质量比1：7~8混合，分散于无水乙醇中并超声与搅拌交替处理15h，洗涤、干燥后备用。优选地，所述羟基化改性的原料CNT为长5~15μm、直径10~20nm的长碳纳米管L-CNT。
优选地，所述无水乙醇的用量为100 mL每1g CNT。
步骤S3中所述IGF-1与N-琥珀酰亚胺酯混合的溶剂为二甲基甲酰胺与磷酸缓冲溶液的混合溶剂DMF/PBS，其中DMF与PBS的体积比为4：1，所述混合溶剂DMF/PBS的pH=7.4。
本发明所述IGF-1与N-琥珀酰亚胺酯反应的条件为冰浴及避光条件下搅拌反应48 h，避免反应物分解失活，保证反应顺利进行。
步骤S4中制得的光活性IGF-1溶液也需要避光低温保存，避免分解失活。
本发明所述磷酸缓冲液PBS中磷酸盐的浓度为0.010~0.015 M，pH=7.3~7.5。
步骤S5中所述过氧化氢溶液预处理的具体步骤为将PCL-PLA支架置于20%过氧化氢溶液中静置5 min。
步骤S6中，所述光活性IGF-1溶液的用量为60~80 μL每平方厘米的PCL-PLA支架。
本发明步骤S6中所述紫外灯照射采用本领域常规技术处理即可，作为一种实施方案，具体步骤为将干燥后的支架材料置于250 W紫外灯下10 cm处，紫外光处理15~25 min。
本发明所述聚己内酯-聚乳酸PCL-PLA支架为本领域常规支架材料，直接商业购买即可，通常该产品参数：PCL与 PLA的摩尔比值为8: 2，厚度0.1cm，孔隙直径100~150μm，孔隙率90%。
本发明所述抗细胞衰老的骨组织工程支架材料在抗细胞衰老制剂方面的应用。
发明人通过实验发现，支架材料加载碳纳米管时，采用L-S法的方式，即先在支架上加载长碳纳米管L-CNT再加载短碳纳米管S-CNT可以使得支架对CNT的加载量最大，而采用S-L法、单一的S-CNT或单一的L-CNT进行加载，支架对CNT的加载量均明显下降，这很可能是由于长碳纳米管具有更大比表面积且更长，这就使得其与支架间的作用力更强，被支架吸附的几率更大，最终也就使得其加载量大于短碳纳米管，此外，单独添加两种碳管都没有形成大范围的三维结构，这对进一步的修饰不利。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明以PCL-PLA支架为基础材料，采用CNT和IGF-1成功制备IGF-CNT-PCL-PLA骨组织工程支架材料，通过实验证明，细胞在本发明所制得的抗细胞衰老的骨组织工程支架材料上具有较强的生长活性，同时支架材料具有较好的抗细胞衰老效果。本发明所述抗细胞衰老的骨组织工程支架材料的制备方法简单易行，成本低廉，在骨组织工程支架材料或骨替代材料领域具有很好的应用前景，也利于日后的规模化生产。
附图说明
图1为纯碳纳米管、羧基化碳纳米管和羟基化碳纳米管的红外表征结果图；
图2为空白PCL-PLA支架和实施例1中的改性支架IGF-CNT-PCL-PLA、CNT-PCL-PLA、IGF-PCL-PLA的拉曼表征结果图；
图3为空白PCL-PLA支架和实施例1中的改性支架IGF-CNT-PCL-PLA、CNT-PCL-PLA、IGF-PCL-PLA的红外表征结果图；
图4为实施例1中IGF-CNT-PCL-PLA支架材料（L-S）及对比例2~4的支架材料的扫描电镜结果图；
图5为对比例1中IGF-PCL-PLA支架、实施例1中的改性支架CNT-PCL-PLA、IGF-CNT-PCL-PLA以及空白PCL-PLA支架的扫描电镜结果图；
图6为实施例1中IGF-CNT-PCL-PLA及对比例2~4改性支架的CNT加载量测试结果图；
图7为实施例1中IGF-CNT-PCL-PLA支架的CNT和IGF-1的加载总量测试结果图；
图8为对比例1中IGF-PCL-PLA支架、实施例1中的改性支架CNT-PCL-PLA、IGF-CNT-PCL-PLA以及空白PCL-PLA支架的碱性磷酸酶活性检测结果图；
图9和图10均为对比例1中IGF-PCL-PLA支架、实施例1中的改性支架CNT-PCL-PLA、IGF-CNT-PCL-PLA以及空白PCL-PLA支架的免疫荧光检测结果图；
图11为IGF-CNT-PCL-PLA支架修饰过程及其影响细胞抗衰老的机理示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的解释说明，但具体实施例并不对本发明作任何限定。除非特别说明，实施例中所涉及的试剂、方法均为本领域常用的试剂和方法。
实施例中使用的细胞株为人成骨样骨肉瘤细胞(MG-63细胞系)由中山大学医学院动物中心提供，经本实验室传代培养。
实施例中使用的主要原料试剂包括：
多壁碳纳米管(MWCNT)：分为粗短、细长两种类型，粗短型（以下简称短碳纳米管S-CNT）直径90~100nm、长1~2μm，细长型（以下简称长碳纳米管L-CNT）直径10~20nm、长10~20μm，购自深圳市纳米港有限公司；聚乳酸-聚己内酯（PCL-PLA）共聚物支架（ PCL与 PLA的摩尔比值为8:2，厚度0.1cm，孔隙直径100~150μm，孔隙率90%）购自济南岱罡生物工程有限公司；胰酶、低糖DMEM培养基均为GIBCOBRL公司产品；新生小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；24 孔聚苯乙烯组织培养基板为美国Corning康宁公司产品。
实施例1 抗细胞衰老的骨组织工程支架材料IGF-CNT-PCL-PLA的制备
（1）CNT羧基化改性：将0.2 g S-CNT超声分散于浓度为2.5 mol/L的硝酸中，超声与磁搅拌交替处理48 h后将CNT离心分离并用去离子水洗至中性后干燥。再将干燥后的CNT超声分散于混酸中(浓硝酸与浓硫酸体积比为1:3），并将CNT混酸分散液交替进行超声与磁搅拌处理4 h，处理后将CNT离心分离并用去离子水洗至中性后干燥，将干燥后的CNT超声分散于质量分数为20%的过氧化氢水溶液，超声与磁搅拌交替处理2 h，用去离子水洗至中性后干燥后备用。（以上过程均为每0.2 g碳纳米管分散于20 mL处理剂中)。
（2）CNT羟基化改性：将0.2 g L-CNT与1.5 g KOH混合，加入20 mL无水乙醇并超声分散制成分散液，将分散液超声与磁搅拌交替处理15 h，处理完成后将CNT离心分离并用去离子水洗涤至中性后干燥备用。
（3）光活性IGF-1的制备：取一带瓶盖的棕色小瓶分，将50 μg的IGF-1加入25 ml含170 μgN-琥珀酰亚胺酯的二甲基甲酰胺DMF/PBS（pH=7.4，体积比为4：1）溶液中，在4℃（冰浴、避光）的条件下搅拌反应48 h。合成结束后，分别用超滤离心管（Milipore Molecut Ⅱ，10KNa），在4000rpm/min的转速下，离心30min纯化合成产物，冷冻干燥备用。使用前，加入50 mL的PBS溶液溶解，并调整至所需浓度1 ng/μL，得光活性IGF-1溶液，避光、低温保存。
（4）CNT悬浮液的配制：将0.002 g改性后的CNT超声分散于10 ml无水乙醇中配制成悬浮液后备用。羧基化改性后的CNT配制成S型羧基化CNT悬浮液。羟基化改性后的CNT配制L型羟基化CNT悬浮液。
（5）将PCL-PLA共聚物支架裁剪成1 cm×1 cm大小的正方形，置于20%过氧化氢溶液中5 min后，从过氧化亲溶液中取出；置于L型羟基化CNT悬浮液中，摇床振荡120 min分别形成L型支架，将改性后支架自然风干。将风干后的L型支架置于S型羧基化CNT悬浮液中静置12 h，最终形成L-S型CNT修饰支架（CNT-PCL-PLA）。
（6）在CNT-PCL-PLA支架上滴加光活性IGF-1溶液70 μL，避光条件下自然干燥；干燥后支架置于250 W紫外灯下10 cm处，UV处理20 min，制得IGF-1、CNT共修饰型支架（IGF-CNT-PCL-PLA）。
实施例2 抗细胞衰老的骨组织工程支架材料IGF-CNT-PCL-PLA的制备
（1）CNT羧基化改性：步骤同实施例1。
（2）CNT羟基化改性：步骤同实施例1。
（3）光活性IGF-1的制备：将40 μg的IGF-1加入25 ml含160 μgN-琥珀酰亚胺酯的二甲基甲酰胺DMF/PBS（pH=7.4，体积比为4：1）溶液中，按照实施例1的步骤得光活性IGF-1，配制浓度为0.5 ng/μL的光活性IGF-1溶液，避光、低温保存。
（4）CNT悬浮液的配制：将0.003 g改性后的CNT超声分散于10 ml无水乙醇中配制成悬浮液后备用。羧基化改性后的CNT配制成S型羧基化CNT悬浮液。羟基化改性后的CNT配制L型羟基化CNT悬浮液。
（5）将PCL-PLA共聚物支架裁剪成1 cm×1 cm大小的正方形，置于20%过氧化氢溶液中5 min后，从过氧化亲溶液中取出；置于L型羟基化CNT悬浮液中，摇床振荡100 min分别形成L型支架，将改性后支架自然风干。将风干后的L型支架置于S型羧基化CNT悬浮液中静置10 h，最终形成L-S型CNT修饰支架（CNT-PCL-PLA）。
（6）在CNT-PCL-PLA支架上滴加光活性IGF-1溶液60 μL，避光条件下自然干燥；干燥后支架置于250 W紫外灯下10 cm处，UV处理15 min，制得IGF-1、CNT共修饰型支架（IGF-CNT-PCL-PLA）。
实施例3 抗细胞衰老的骨组织工程支架材料IGF-CNT-PCL-PLA的制备
（1）CNT羧基化改性：步骤同实施例1。
（2）CNT羟基化改性：步骤同实施例1。
（3）光活性IGF-1的制备：将60 μg的IGF-1加入25 ml含180 μgN-琥珀酰亚胺酯的二甲基甲酰胺DMF/PBS（pH=7.4，体积比为4：1）溶液中，按照实施例1的步骤得光活性IGF-1，配制浓度为1.5 ng/μL的光活性IGF-1溶液，避光、低温保存。
（4）CNT悬浮液的配制：将0.001 g改性后的CNT超声分散于10 ml无水乙醇中配制成悬浮液后备用。羧基化改性后的CNT配制成S型羧基化CNT悬浮液。羟基化改性后的CNT配制L型羟基化CNT悬浮液。
（5）将PCL-PLA共聚物支架裁剪成1 cm×1 cm大小的正方形，置于20%过氧化氢溶液中5 min后，从过氧化亲溶液中取出；置于L型羟基化CNT悬浮液中，摇床振荡140 min分别形成L型支架，将改性后支架自然风干。将风干后的L型支架置于S型羧基化CNT悬浮液中静置14 h，最终形成L-S型CNT修饰支架（CNT-PCL-PLA）。
（6）在CNT-PCL-PLA支架上滴加光活性IGF-1溶液80 μL，避光条件下自然干燥；干燥后支架置于250 W紫外灯下10 cm处，UV处理15 min，制得IGF-1、CNT共修饰型支架（IGF-CNT-PCL-PLA）。
对比例 1 支架材料IGF-PCL-PLA的制备
在未经CNT改性处理的空白PCL-PLA支架上滴加光活性IGF-1溶液70 μL，避光条件下自然干燥；干燥后支架置于250 W紫外灯下10 cm处，UV处理20 min，制得IGF-1修饰型支架（IGF-PCL-PLA）。
对比例 2 支架材料IGF-CNT-PCL-PLA（S-L）的制备
总体制备步骤参考实施例1，不同点在于步骤（5）中将PCL-PLA共聚物支架经过氧化氢溶液处理后，先置于S型羧基化CNT悬浮液中静置12 h形成S型支架，风干后的S型支架再置于L型羟基化CNT悬浮液中，摇床振荡120 min，最终形成S-L型CNT修饰支架。
对比例 3 支架材料S-CNT-PCL-PLA（S-CNT）的制备
总体制备步骤参考实施例1，不同点在于步骤（5）中将PCL-PLA共聚物支架经过氧化氢溶液处理后，仅置于S型羧基化CNT悬浮液中静置12 h形成S型CNT修饰支架。
对比例 4 支架材料L-CNT-PCL-PLA（L-CNT）的制备
总体制备步骤参考实施例1，不同点在于步骤（5）中将PCL-PLA共聚物支架经过氧化氢溶液处理后，仅置于L型羟基化CNT悬浮液中，摇床振荡120 min，形成L型CNT修饰支架。
性能检测：
一、红外、拉曼光谱检测
采用常规红外光谱和拉曼光谱的方法检测实施例1中纯碳纳米管（S-CNT、L-CNT）、羧基化碳纳米管（HOOC-S-CNT、HOOC-L-CNT）、羟基化碳纳米管（HO-S-CNT、HO-L-CNT）以及空白PCL-PLA支架和改性支架（IGF-CNT-PCL-PLA、CNT-PCL-PLA、IGF-PCL-PLA），具体步骤为将待测样品与纯KBr在干燥机中进行干燥处理，取1~2 mg待测样品与200 mg纯KBr混合并研磨均匀，并将混合物研磨到粒度小于2μm，以免散射光影响。将混合物置于模具中，在油压机上用5~10MPa压力将混合物压成透明薄片，上机待定；同时，将空白支架与经过修饰的支架进行干燥处理，上机测定。
纯碳纳米管、羧基化碳纳米管和羟基化碳纳米管的红外表征测试结果如图1所示，从图1中可以看到纯碳纳米管与经过化学改性处理的碳纳米管在3450cm-1、1570cm-1 两处有吸收峰，3450cm-1处峰与水的特征峰极为相似，所以碳纳米管有此峰与其受水的影响较大有关（碳纳米管易吸湿）。在1570cm-1位置出现较小的吸收峰是碳纳米管本身的碳-碳骨架振动。1400cm-1 左右的位置出现的小峰表明碳纳米管表面经过化学处理后碳纳米管表面获得了化学基团。此外在1000cm-1至500cm-1这一区域上化学处理之后的碳纳米管相较于普通碳纳米管吸收曲线变得平坦，这说明碳纳米管在功能化的同时也得到了纯化。但使用混酸处理的碳纳米管与使用KOH处理的碳纳米管的红外图谱之间并没有明显的差距，分析可能是因为碳纳米管本身化学性质稳定，混酸与KOH仅能对碳纳米管的表面缺陷位点产生作用，而经过处理这些位点获得了活性化学基团，因此变得容易被空气等外界因素氧化，这就使得二者的化学基团在氧化后趋于同化，最终使二者的红外图谱出峰位置相同。总而言之化学功能化之后的碳纳米管表面获得了化学基团，活性得到了提高，为之后的支架修饰工作铺平了道路。
空白PCL-PLA支架和改性支架的拉曼表征结果如图2所示，红外表征结果如图3所示，从图2可以看出，PCL-PLA在1763.08 cm-1处具有-C=O特征峰。进过CNT修饰后，1313.50 和1588.00 cm-1处出现两个较为明显的特征峰，是典型的CNT D膜震动峰，表明CNT存在于支架上。光接枝IGF-1后，IGF-PCL-PLA支架样本出现了两处略微弱小的双峰群，分别为506.05和559.07 cm-1处的-S-S-特征峰，以及1523.41和1615.32 cm-1处的酰胺键特征峰。相应的，IGF-CNT-PCL-PLA样品上，1298.58 cm-1和1570.78 cm-1处分别出现了CNT D膜震动峰和酰胺键特征峰。类似的，图3的红外图谱上也出现了相应的变化，如3440 cm-1处的-OH峰, 3504和3458 cm-1处的氨基峰, 2383, 2366, 2322和2320 cm-1处的叠氮峰, 1388 cm-1处的-CO3峰, 以及659 and 599 cm-1处的PO4 -3 特征峰。上述结果表明实施例1中改性支架制备成功。
二、扫描电镜检测
将空白PCL-PLA支架及改性支架进行自然风干，将风干后的支架样品黏贴固定于样品台上并做喷金处理，将样品置于扫描电镜样品室内，将样品室抽成真空，进行扫描电镜观察。
实施例1（L-S）及对比例2~4（S-L、S-CNT、L-CNT）的支架材料的扫描电镜结果如图4所示，从图4可以看出长碳管与短碳管的尺寸有明显的差异，确实有长短粗细的差别。此外长短碳管都分布较为均匀，这说明化学功能化的碳纳米管具有优良的分散能力。另外从电镜图上来看长碳管的加载量远大于短碳管，这很可能是由于长碳管具有更大比表面积且更长，这就使得其与支架间的作用力更强，被支架吸附的几率更大，最终也就使得其加载量大于短碳管。但单独添加两种碳管都没有形成大范围的三维结构，这对进一步的修饰不利。此外在高倍数的电镜视野下可以看到部分碳纳米管有融入支架内部的倾向，这说明碳纳米管与支架材料间的亲和性很高，同时也表明利用碳纳米管修饰支架表面这一方法具备一定的潜力。
此外，我们可以进一步发现L-S与S-L具有明显差异：首先在L-S中可以明显看到长碳管在下方短碳管在上方，这符合修饰过程中加入碳管的顺序，但在S-L中则没有明显的层次感，两种碳管似乎都直接与支架作用，这可能是由于长碳管不仅能与短碳管相互缠绕，也能附着于短碳管无法附着的支架位点，这也进一步证明了长碳管与支架间的亲和力远远大于短碳管。最终的结果是L-S的碳管总加载量远远大于S-L。此外由电镜的结果可以看出长短碳管间还是发生了很强的缠结作用，但长碳管对短碳管的吸附量还有待提高，两者的作用强度也有待于更进一步桥连化作用的加强。最终长短碳管间还是形成了很好的力学连接，形成了初具规模的三维结构，这是单种碳管修饰没有达到的效果。这一小范围的三维结构也弥补了三维支架材料在纳米尺寸上只能为细胞提供二维接触的弊端，为细胞的吸附及生长提供了良好的位点。
对比例1中IGF-PCL-PLA支架、实施例1中的CNT-PCL-PLA支架、IGF-CNT-PCL-PLA支架以及空白PCL-PLA支架的扫描电镜结果如图5所示，从图5可以看出，经过改造的支架拥有更加复杂的表面结构。单纯、未经修饰的PCL-PLA支架表面光滑而富有间隙，这并不利于细胞生长。一来，光滑的表面不利于细胞粘附；二来，过多的空隙减少了细胞生长必要的生存空间，这使得支架上细胞的生存、生长率大幅下降。在固定CNT之后，支架表面的情况已如前述；与此同时，光接枝的方法将IGF-1均匀的固定在细胞表面；而IGF-CNT-PCL-PLA支架上，IGF-1和CNT对支架的共同修饰使得支架拥有最复杂的表面/内部微环境，从而解决了PCL-PLA材料本身的缺陷。
三、CNT与IGF-1加载量的测定
分别将0、1、2、3、4、5 mg的L-CNT和S-CNT分散于3 ml的95%乙醇溶液中，用紫外分光光度计在波长252 nm处检测样品OD值，从而绘制标准曲线。同时，检测处理过支架后剩余的L/S-CNT分散液的OD值，比对标准曲线，得出CNT剩余量。用加载前总质量减去剩余量，即得支架上CNT加载量。同理，利用考马斯亮蓝染色法，在波长540 nm处测得IGF-1的加载量。
实施例1及对比例2~4改性支架的CNT加载量测试结果如图6所示，实施例1中IGF-CNT-PCL-PLA支架的CNT和IGF-1的加载总量测试结果如图7所示，结果表面，单一S-CNT或L-CNT的加载量分别为1.253 和1.255 mg，采用S-L法，单位支架上CNT总量可增加至2.347 mg，而L-S法使得单位支架上获得2.512 mg 的CNT。由此可见，定量结果和电镜结果显示出一致性，L-S法使得支架获得最大的CNT加载量。同时，光接枝的方法使得IGF-1 完全固定在支架上，达到了理想的修饰效果。
四、碱性磷酸酶（ALP）活性检测
人成骨样骨肉瘤细胞(MG-63细胞系)由中山大学医学院动物中心提供。24孔细胞培养板中分别放入四种类型的支架（对比例1中IGF-PCL-PLA支架、实施例1中的CNT-PCL-PLA支架、IGF-CNT-PCL-PLA支架以及空白PCL-PLA支架）1 cm×1 cm，细胞在在培养瓶中融合培养至80%后，以1.75×104/孔的密度接种至24孔板上，培养3,6,9天，以进行后续实验。其它细胞培养条件为：含10%新生牛血清的低糖DMEM培养基，37℃，5.0%CO2。提取3,6,9天培养后的细胞外液，用碧云天公司生产的ALP检测试剂盒检测培养液中ALP的活性。
成骨细胞的活性及成骨作用的变化与血清ALP的活力密切相关，成骨细胞的增殖将使血清中的ALP浓度升高。测试结果如图8所示，ALP实验结果表明，IGF-CNT-PCL-PLA支架明显有利于MG63细胞增长。首先，空白支架组中，ALP整体水平呈上升趋势，但整体水平较低，3天时为0.6×10-9DEA，而在第9天仅达到3.1×10-9DEA。IGF-PCL-PLA组和CNT-PCL-PLA组数据波动较为明显，特别是后者，虽在3天时达到了5×10-9DEA，但6天时明显下降。相比较而言，IGF-CNT-PCL-PLA组中，ALP水平较高，呈上升趋势，且较为稳定。由此可见，IGF-CNT-PCL-PLA支架促进了MG63细胞的生长，效果良好。
五、免疫荧光检测
参照上述步骤四中ALP活性检测前的细胞培养步骤培养细胞，在四种支架上24 孔板中的细胞培养后，PBS溶液摇床清洗3次，每次5 min后，采用4%多聚甲醛固定30 min，PBS清洗后，将实验组一分为二：直接进行染色或消化细胞后制成细胞涂片（涂片方法：胰酶浸泡样本4 min后，含血清培养液终止消化，滴管吹打支架，2500 rpm/min离心收集细胞，涂布于载破片上）。0.2 % Triton X-100透化20 min；PBS再次清洗后，避光孵育荧光抗体Rb-PE (IF8, SCBT) 和/或 p53-FITC (DO-7, SCBT)，2 h，DAPI染液孵育3 min。PBS清洗，镜检。
测试结果如图9~10所示，免疫荧光再次证明了ALP、细胞计数实验所得到的结果的真实性。单从DAPI染色的结果来看空白组与实验组的细胞皆生长状况良好，细胞核都没有发生异变。在不同视野下都可以发现培养三天后，IGF-CNT-PCL-PLA支架上的细胞量大于其他各组，这说明加载有CNT和IGF-1的支架会使其上的细胞增多。而且在IGF-CNT-PCL-PLA支架中可以发现细胞更倾向与集结成团生长，结合扫描电镜结果可以猜测，这与CNT在支架表面是点状分布有关，有大量CNT和IGF-1集结的区域对细胞有更强的吸附能力或促进增殖能力。
此外，衰老相关蛋白也有明显的变化。免疫荧光结果表明，培养三天后，PCL-PLA支架上的细胞呈现明显衰老的趋势，两个衰老相关蛋白-p53和Rb表达显著。在单独添加CNT或IGF-1的支架上，细胞也表达了p53和Rb两种蛋白，尽管表达量较低，荧光结果并不明显。而IGF-CNT-PCL-PLA支架上的细胞未发现衰老的迹象。IGF-CNT-PCL-PLA支架修饰过程及其影响细胞抗衰老的机理示意图如图11所示。
因此，IGF-CNT-PCL-PLA支架在促进MG63细胞生长的同时，很大程度上抑制了其衰老。这样该类型支架具有很好的应用潜力，可作为骨组织工程支架材料或骨替代材料进一步研究和开发。
Claims (10)
1.一种抗细胞衰老的骨组织工程支架材料，其特征在于，通过如下步骤制备得到：
S1. 碳纳米管CNT功能化改性，所述功能化改性包括羧基化改性或羟基化改性；
S2. 将羧基化后的CNT与无水乙醇制成羧基化CNT悬浮液，浓度为0.1~0.3 mg/mL；将羟基化后的CNT与无水乙醇制成羟基化CNT悬浮液，浓度为0.1~0.3 mg/mL；
S3. 制备光活性胰岛素类生长因子IGF-1，将IGF-1与N-琥珀酰亚胺酯按质量比为4~6：16~18混合反应、离心、干燥制得光活性IGF-1；
S4. 将光活性IGF-1溶于磷酸缓冲液PBS中，配制浓度为0.5~1.5 ng/μL的光活性IGF-1溶液；
S5. 将基础支架聚己内酯-聚乳酸PCL-PLA支架裁剪成合适大小，先采用过氧化氢溶液预处理，然后置于羟基化CNT悬浮液中震荡100~140 min，风干后再置于羧基化CNT悬浮液中静置10~14 h制得CNT支架CNT-PCL-PLA；
S6. 在CNT-PCL-PLA支架上滴加光活性IGF-1溶液、自然干燥、紫外灯照射后即得产品IGF-1、CNT共修饰型支架IGF-CNT-PCL-PLA。
2. 根据权利要求1所述骨组织工程支架材料，其特征在于，步骤S1中所述羧基化改性的具体步骤为将CNT分散于浓度为2.5 mol/L的硝酸溶液中，超声与搅拌交替处理48 h后将CNT离心分离、洗涤、干燥；然后再将干燥后的CNT分散于浓硝酸与浓硫酸体积比为1:3的混酸溶液中，超声与搅拌处理4 h 后将CNT离心分离、洗涤、干燥；最后将干燥后的CNT分散于质量分数为20%的过氧化氢水溶液，超声与搅拌交替处理2 h，洗涤、干燥后备用。
3. 根据权利要求2所述骨组织工程支架材料，其特征在于，所述羧基化改性的原料CNT为长1~2μm、直径60~100nm的短碳纳米管S-CNT。
4. 根据权利要求2所述骨组织工程支架材料，其特征在于，所述硝酸溶液、混酸溶液或过氧化氢水溶液的用量为100 mL每1g CNT。
5. 根据权利要求1所述骨组织工程支架材料，其特征在于，步骤S1中所述羟基化改性的具体步骤为将CNT与KOH按质量比1：7~8混合，分散于无水乙醇中并超声与搅拌交替处理15h，洗涤、干燥后备用。
6. 根据权利要求5所述骨组织工程支架材料，其特征在于，所述羟基化改性的原料CNT为长5~15μm、直径10~20nm的长碳纳米管L-CNT；所述无水乙醇的用量为100 mL每1g CNT。
7. 根据权利要求1所述骨组织工程支架材料，其特征在于，步骤S3中所述IGF-1与N-琥珀酰亚胺酯混合的溶剂为二甲基甲酰胺与磷酸缓冲溶液的混合溶剂DMF/PBS，其中DMF与PBS的体积比为4：1，所述混合溶剂DMF/PBS的pH=7.4。
8. 根据权利要求1所述骨组织工程支架材料，其特征在于，步骤S5中所述过氧化氢溶液预处理的具体步骤为将PCL-PLA支架置于20%过氧化氢溶液中静置5 min；步骤S6中，所述光活性IGF-1溶液的用量为60~80 μL每平方厘米的PCL-PLA支架。
9. 根据权利要求1至8任一项所述骨组织工程支架材料，其特征在于，所述磷酸缓冲液PBS中磷酸盐的浓度为0.010~0.015 M，pH=7.3~7.5。
10. 权利要求1至9任一项所述骨组织工程支架材料在抗细胞衰老制剂方面的应用。
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| CN110038160B (zh) * | 2019-04-04 | 2021-09-24 | 华南师范大学 | 一种具有延缓细胞衰老作用的支架材料及其应用 |
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