CN103893761B - 一种超声辅助基于光热剂的肿瘤细胞杀伤方法、系统和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种超声辅助基于光热剂的肿瘤细胞杀伤方法，包括：1）提供目标样品，将含光热剂的药用载体注射至目标样品内，其中，所述目标样品为组织或细胞悬液；2）取步骤1）处理后的目标样品，采用超声装置对目标样品进行超声处理，同时采用近红外激光照射肿瘤细胞至所述肿瘤细胞的温度超过43℃，控制超声波的输出功率与频率，使得所述正常细胞的温度不超过43℃。本发明提供的联合疗法综合了光热治疗的高效与超声热疗持续升温、穿透力强的特点，在同样的治疗效果下，可以使用更低剂量化疗药物及光热剂，大大降低药物对机体正常组织产生的毒副作用。本发明还提供了一种超声辅助基于光热剂的肿瘤细胞杀伤系统和应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药、肿瘤治疗领域，具体涉及一种超声辅助基于光热剂的肿瘤细胞杀伤方法、系统和应用。
背景技术
目前临床上主要采用手术、放疗和化疗方法治疗肿瘤。这些方法毒副作用较大，常给患者带来很大的痛苦。比如，化疗药物可引起骨髓抑制、消化道反应、心肌损害、肝肾功能减退、神经系统损害等。其中，蒽环类药物、烷化剂(比如环磷酰胺、顺铂等)、抗代谢药(如氟尿嘧啶、卡培他滨等)、紫杉醇可引起心脏损害；博来霉素会引起肺不良反应；铂类(比如奥沙利铂、顺铂等)、长春花碱类和紫杉醇类药物可引起神经系统不良反应。虽然这些药物引起机体不良反应的机制各有差异，但减少化疗药物使用、降低化疗药物在机体内类积累可有效降低不良反应病症，然而，化疗药物的有效浓度降低，肿瘤杀伤效果也会相应降低。
近来，由于纳米技术的发展，近红外光热疗引起了人们的广泛关注。吲哚菁绿(ICG)等光热试剂能够吸收近红外光，并将之转换为具有细胞毒性的热能，该疗法具有非侵入性、安全无毒和高效率等特点，使得近红外光热疗法成为肿瘤治疗的热点。
然而，近红外光在体内的穿透能力有限，导致光热治疗在皮下较深层难以达到理想温度，治疗效果不佳，且光热试剂对光热治疗有浓度依赖性。
因此，有必要提供一种不仅安全性高、效率高，而且对光热剂依赖性低、对较深层组织穿透力强的治疗方法。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种超声辅助基于光热剂的肿瘤细胞杀伤方法、系统和应用。本发明提供的方法联合应用了光热剂光热治疗的高效与超声热疗的穿透力强、可持续升温的特点，因此，本发明提供的联合疗法在相同的疗效下采用更少的药物剂量，具有毒副作用小、高效、杀伤穿透力更强、对光热剂依赖性低的特点，具有较好的临床应用前景。
如无特别说明，本发明所述近红外光照为近红外激光照射。
第一方面，本发明提供了一种超声辅助基于光热剂的肿瘤细胞杀伤方法，包括以下步骤：
1)提供目标样品，将含光热剂的药用载体注射至目标样品内，其中，所述目标样品为组织或细胞悬液，所述组织或细胞悬液包括肿瘤细胞和正常细胞；
2)取步骤1)处理后的目标样品，采用超声装置对目标样品进行超声处理，同时采用近红外激光照射所述目标样品至所述肿瘤细胞的温度超过43℃，控制超声波的输出功率与频率，使得所述正常细胞的温度不超过43℃。
本发明提供的超声热疗与近红外光热疗法的联合疗法，通过调控超声波的输出功率及治疗时间，使正常组织在超声热疗下不会受到损伤；并通过调控激光光源的输出能量密度和输出时间，能将近红外光能量集中在肿瘤区域，减少对正常机体的影响。
由于肿瘤组织散热慢、而光热剂浓度相对较高，因此近红外光照射该区域能使肿瘤区域热量的得到积累，但由于光热治疗虽然能在短时间内引发光热剂的光热效应，但一定浓度的光热剂条件下，该光热效应会有温度上限，不能持续升温。本发明提供的联合疗法利用超声热疗能持续升温的优势，突破光热治疗的温度上限，能提供持续的升温，具有协同作用，互相结合后可以使治疗区域的热量积累，始终保持较高的温度。
此外，由于超声热疗的穿透力强的特点，能使得较深层的肿瘤组织的光热治疗产生更强烈的光热效应，对肿瘤的杀伤力大大增强。
优选地，所述步骤(1)中，所述光热剂为吲哚菁绿、金纳米颗粒、金纳米管或碳纳米管。
具体地，所述吲哚菁绿为2,7-双[1,3-二氢-1,1-二甲基-3-(4-磺丁基)-1,3，5-庚三烯单钠盐。
进一步优选地，所述金纳米管为长约50nm、长径比为3.9的尺寸均一的、用于近红外热疗的金纳米棒。
所述金纳米棒具有两个表面等离子共振吸收峰，在该优选长径比条件下，其纵轴共振峰红移至近红外区，产生表面等离子共振吸收效应，通过一系列的非辐射性过程快速将光能转化成热能。
优选地，所述步骤(1)中，当所述目标样品为组织时，将含光热剂的药用载体注射至目标样品内至光热剂的终浓度为0.1～10mg/kg。
进一步优选地，所述步骤(1)中，当所述目标样品为组织时，将含光热剂的药用载体注射至目标样品内至光热剂的终浓度为5～10mg/kg。
优选地，所述步骤(1)中，当所述目标样品为细胞悬液时，将含光热剂的药用载体注射至目标样品内至光热剂的终浓度为10～500μg/mL。
进一步优选地，所述步骤(1)中，当所述目标样品为细胞悬液时，将含光热剂的药用载体注射至目标样品内至光热剂的终浓度为50～200μg/mL。
优选地，所述步骤(1)中，所述组织为人或动物的肿瘤区域。
在此优选条件下，所述将含光热剂的药用载体注射至目标样品内的优选方式为静脉注射或瘤内注射。
进一步优选地，所述人或动物的肿瘤区域包括但不限定为离体组织。
优选地，所述步骤(1)中，所述细胞悬液为包含肿瘤细胞和正常细胞的细胞培养液、PBS缓冲液或模拟人体内环境的水溶液。
在此优选条件下，所述将含光热剂的药用载体注射至目标样品内的优选方式为直接将所述含光热剂的药用载体注射至所述包含肿瘤细胞和正常细胞的细胞培养液中、所述PBS缓冲液中或所述模拟人体内环境的水溶液中。
优选地，所述肿瘤细胞选自B淋巴细胞肿瘤细胞、白血病细胞、肺癌细胞、胃癌细胞、结直肠癌细胞、肝癌细胞、食管癌细胞、乳腺癌细胞、胰腺癌细胞、膀胱癌细胞和甲状腺癌细胞中的一种。
优选地，所述步骤(1)中，所述药用载体还包括化疗试剂。
进一步优选地，所述化疗试剂为阿霉素、环磷酰胺、顺铂、紫杉醇、氟尿嘧啶、卡培他滨、博来霉素、或奥沙利铂。
具体地，所述阿霉素的结构式如下所示：
本发明采用的化疗试剂可以为蒽环类药物、烷化剂、抗代谢药物、博来霉素、铂类、长春花碱类和紫杉醇类药物等化疗试剂之一，阿霉素、环磷酰胺、顺铂、紫杉醇、氟尿嘧啶、卡培他滨、博来霉素、或奥沙利铂只是本发明更优选的化疗试剂，本发明可以根据肿瘤的不同类型选择不同的化疗试剂。
在此优选条件下，本发明的采用的包括化疗试剂的药用载体可以辅助超声热疗和光热治疗，进一步提高对肿瘤的杀伤力。相比普通的化疗需要大量的化疗试剂来杀伤肿瘤细胞，本发明可以采用更低剂量的化疗试剂，在大大降低化疗试剂对机体的毒副作用的同时，达到对肿瘤相同的杀伤效果，效果更佳。
优选地，所述药用载体为水、脂质体、阳离子聚合物或脂聚合物中的至少一种。
进一步优选地，所述脂质体为阳离子脂质体。
进一步优选地，所述阳离子聚合物为聚乙烯亚胺聚合物、聚酰胺-胺或聚赖氨酸。
进一步优选地，所述脂聚合物包括聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)、卵磷脂和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)。
在此优选条件下，DSPE-PEG的长链能使纳米给药载体系统有效的逃避网状内皮系统的吞噬，从而达到长循环的目的，并且取得了较好的治疗效果。可降解聚合物PLGA，在体内可以缓慢降解，可以使药物随材料的降解被缓慢释放出来，从而达到较长时间的治疗效果。
进一步优选地，所述脂聚合物为纳米给药载体系统。
进一步优选地，所述脂聚合物的直径为30～100nm。
更进一步优选地，所述脂聚合物的直径为50～100nm。
更进一步优选地，所述脂聚合物的直径为86nm。
在此优选条件下，由于正常组织周围的血管没有缝隙，而肿瘤组织周围的血管有100纳米左右的缝隙，所以纳米粒子就会从这些缝隙中渗透出来，并利用增强的渗透保留效应聚集于肿瘤部位，然后攻击癌细胞，但不会损害正常细胞，从而达到被动靶向的效果。
进一步优选地，所述含光热剂的药用载体的制备方法为：
a)取PLGA溶于乙腈中，浓度为2mg/mL，得到第一溶液；
b)180μg卵磷脂、120μg DSPE-PEG、750μg光热剂加入3mL 4％乙醇水溶液中，得到第二溶液；
c)将步骤a)所得1mL的第一溶液逐滴加入步骤b)所得的第二溶液中，期间采用超声波细胞破碎仪以20kHz的频率及130W的功率超声5min；
d)采用10kDa的超滤管离心超滤两次，即得所述含光热剂的药用载体。
在此优选条件下，可制得直径为30～100nm的包载光热剂的药用载体。
更进一步优选地，所述步骤b)中，还可加入750μg化疗试剂。
在此优选条件下，可制得直径为30～100nm的包载光热剂以及化疗试剂的药用载体。
本发明提供的包载光热剂的药用载体具备良好的生物相容性、体内长循环、被动靶向积累等特点。
优选地，所述步骤(2)中，所述超声波的输出功率范围为0.8～2.0W/cm2。
优选地，所述步骤(2)中，所述超声波的频率范围为1～10MHz。
优选地，所述步骤(2)中，采用超声装置对目标样品进行超声处理时，超声波探头与治疗区域相贴，中间填充超声耦合剂。
优选地，所述步骤(2)中，所述超声处理时间为180～600秒。
优选地，本发明联合疗法中采用的超声方式为可高能聚焦超声。
优选地，所述步骤(2)中，所述近红外激光的波长为650～900nm。
进一步优选地，所述步骤(2)中，所述近红外激光的波长为650～850nm。
进一步优选地，所述近红外激光的波长为808nm。
优选地，所述步骤(2)中，所述近红外激光的能量密度范围为0.5～1.5W/cm2。
进一步优选地，所述近红外激光的能量密度范围为0.75～1.0W/cm2。
优选地，所述步骤(2)中，所述近红外激光的照射时间为180～600秒。
优选地，所述步骤(2)中，所述同时对目标样品进行超声处理与近红外激光的照射之前，先采用超声装置对目标样品预超声处理。
即在此优选条件下，超声热疗和光热治疗虽然同时进行，但临床上宜先进行超声热疗，然后再加入光热治疗。
优选地，所述步骤(2)中，所述同时对目标样品进行超声处理与近红外激光的照射时，近红外激光从与超声处理相对立的侧面进行照射。
优选地，本发明可先对目标样品的肿瘤区域和正常区域进行区分，再对肿瘤区域集中进行联合疗法治疗，进一步减少对机体的损伤。
本发明提供的联合疗法比单独使用近红外激光照射的方法具有更强烈的光热效应，能更有效地提高肿瘤区域的温度，进而高效率地杀伤肿瘤细胞；此外，但对皮下较深层的肿瘤组织穿透力强，杀伤效果比单独使用超声热疗或近红外光热疗法更佳。
其次，在同样的治疗效果下，本发明提供的联合疗法可以使用更低剂量化疗药物及光热剂，从而产生更佳的治疗效果，大大降低化疗药物对机体正常组织产生的毒副作用。
总之，本发明提供的联合疗法能在相同的疗效下采用更少的药物剂量，具有毒副作用小、高效、杀伤穿透力更强的特点，有良好的临床应用前景。
第二方面，本发明提供了一种超声辅助基于光热剂的肿瘤细胞杀伤系统，其特征在于，包括含有光热剂的药用载体、注射装置、超声装置、近红外激光照射装置和温度监测装置，其中，所述注射装置用于将所述含有光热剂的药用载体注射至目标样品内，所述超声装置用于对目标样品进行超声处理，所述近红外激光照射装置用于对目标样品进行照射，所述温度监测装置用于监测目标样品的温度。
优选地，所述步骤(1)中，所述光热剂为吲哚菁绿、金纳米颗粒、金纳米管或碳纳米管。
具体地，所述吲哚菁绿为2,7-双[1,3-二氢-1,1-二甲基-3-(4-磺丁基)-1,3，5-庚三烯单钠盐。
进一步优选地，所述金纳米管为长约50nm、长径比为3.9的尺寸均一的、用于近红外热疗的金纳米棒。
所述金纳米棒具有两个表面等离子共振吸收峰，在该优选长径比条件下，其纵轴共振峰红移至近红外区，产生表面等离子共振吸收效应，通过一系列的非辐射性过程快速将光能转化成热能。
优选地，所述步骤(1)中，当所述目标样品为组织时，将含光热剂的药用载体注射至目标样品内至光热剂的终浓度为0.1～10mg/kg。
进一步优选地，所述步骤(1)中，当所述目标样品为组织时，将含光热剂的药用载体注射至目标样品内至光热剂的终浓度为5～10mg/kg。
优选地，所述步骤(1)中，当所述目标样品为细胞悬液时，将含光热剂的药用载体注射至目标样品内至光热剂的终浓度为10～500μg/mL。
进一步优选地，所述步骤(1)中，当所述目标样品为细胞悬液时，将含光热剂的药用载体注射至目标样品内至光热剂的终浓度为50～200μg/mL。
优选地，所述步骤(1)中，所述组织为人或动物的肿瘤区域。
在此优选条件下，所述将含光热剂的药用载体注射至目标样品内的优选方式为静脉注射或瘤内注射。
进一步优选地，所述人或动物的肿瘤区域包括但不限定为离体组织。
优选地，所述步骤(1)中，所述细胞悬液为包含肿瘤细胞和正常细胞的细胞培养液、PBS缓冲液或模拟人体内环境的水溶液。
在此优选条件下，所述将含光热剂的药用载体注射至目标样品内的优选方式为直接将所述含光热剂的药用载体注射至所述包含肿瘤细胞和正常细胞的细胞培养液中、所述PBS缓冲液中或所述模拟人体内环境的水溶液中。
优选地，所述肿瘤细胞选自B淋巴细胞肿瘤细胞、白血病细胞、肺癌细胞、胃癌细胞、结直肠癌细胞、肝癌细胞、食管癌细胞、乳腺癌细胞、胰腺癌细胞、膀胱癌细胞和甲状腺癌细胞中的一种。
优选地，所述步骤(1)中，所述药用载体还包括化疗试剂。
进一步优选地，所述化疗试剂为阿霉素、环磷酰胺、顺铂、紫杉醇、氟尿嘧啶、卡培他滨、博来霉素、或奥沙利铂。
具体地，所述阿霉素的结构式如下所示：
本发明采用的化疗试剂可以为蒽环类药物、烷化剂、抗代谢药物、博来霉素、铂类、长春花碱类和紫杉醇类药物等化疗试剂之一，阿霉素、环磷酰胺、顺铂、紫杉醇、氟尿嘧啶、卡培他滨、博来霉素、或奥沙利铂只是本发明更优选的化疗试剂，本发明可以根据肿瘤的不同类型选择不同的化疗试剂。
在此优选条件下，本发明的采用的包括化疗试剂的药用载体可以辅助超声热疗和光热治疗，进一步提高对肿瘤的杀伤力。相比普通的化疗需要大量的化疗试剂来杀伤肿瘤细胞，本发明可以采用更低剂量的化疗试剂，在大大降低化疗试剂对机体的毒副作用的同时，达到对肿瘤相同的杀伤效果，效果更佳。
优选地，所述药用载体为水、脂质体、阳离子聚合物或脂聚合物中的至少一种。
进一步优选地，所述脂质体为阳离子脂质体。
进一步优选地，所述阳离子聚合物为聚乙烯亚胺聚合物、聚酰胺-胺或聚赖氨酸。
进一步优选地，所述脂聚合物包括聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)、卵磷脂和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)。
在此优选条件下，DSPE-PEG的长链能使纳米给药载体系统有效的逃避网状内皮系统的吞噬，从而达到长循环的目的，并且取得了较好的治疗效果。可降解聚合物PLGA，在体内可以缓慢降解，可以使药物随材料的降解被缓慢释放出来，从而达到较长时间的治疗效果。
进一步优选地，所述脂聚合物为纳米给药载体系统。
进一步优选地，所述脂聚合物的直径为30～100nm。
更进一步优选地，所述脂聚合物的直径为50～100nm。
更进一步优选地，所述脂聚合物的直径为86nm。
在此优选条件下，由于正常组织周围的血管没有缝隙，而肿瘤组织周围的血管有100纳米左右的缝隙，所以纳米粒子就会从这些缝隙中渗透出来，并利用增强的渗透保留效应聚集于肿瘤部位，然后攻击癌细胞，但不会损害正常细胞，从而达到被动靶向的效果。
进一步优选地，所述含光热剂的药用载体的制备方法为：
a)取PLGA溶于乙腈中，浓度为2mg/mL，得到第一溶液；
b)180μg卵磷脂、120μg DSPE-PEG、750μg光热剂加入3mL 4％乙醇水溶液中，得到第二溶液；
c)将步骤a)所得1mL的第一溶液逐滴加入步骤b)所得的第二溶液中，期间采用超声波细胞破碎仪以20kHz的频率及130W的功率超声5min；
d)采用10kDa的超滤管离心超滤两次，即得所述含光热剂的药用载体。
在此优选条件下，可制得直径为30～100nm的包载光热剂的药用载体。
更进一步优选地，所述步骤b)中，还可加入750μg化疗试剂。
在此优选条件下，可制得直径为30～100nm的包载光热剂以及化疗试剂的药用载体。
本发明提供的包载光热剂的药用载体具备良好的生物相容性、体内长循环、被动靶向积累等特点。
优选地，采用所述超声装置对目标样品进行超声处理时，所述超声波的输出功率范围为0.8～2.0W/cm2。
优选地，采用所述超声装置对目标样品进行超声处理时，所述超声波的频率范围为1～10MHz。
优选地，采用所述超声装置对目标样品进行超声处理时，所述超声处理时间为180～600秒。
优选地，采用超声装置对目标样品进行超声处理时，超声波探头与治疗区域相贴，中间填充超声耦合剂。
优选地，所述超声装置为高能聚焦超声装置。
优选地，采用所述近红外激光照射装置对目标样品进行超声处理时，所述近红外激光的波长为650～900nm。
进一步优选地，所述步骤(2)中，所述近红外激光的波长为650～850nm。
进一步优选地，所述近红外激光的波长为808nm。
优选地，采用所述近红外激光照射装置对目标样品进行超声处理时，所述近红外激光的能量密度范围为0.5～1.5W/cm2。
进一步优选地，所述近红外激光的能量密度范围为0.75～1.0W/cm2。
优选地，采用所述近红外激光照射装置对目标样品进行超声处理时，所述近红外激光的照射时间为180～600秒。
优选地，同时对目标样品进行超声处理与近红外激光的照射时，近红外激光从与超声处理相对立的侧面进行照射。
优选地，所述温度监测装置监测目标样品的温度时，所述肿瘤细胞的温度超过43℃，所述正常细胞的温度不超过43℃。
优选地，所述超声辅助基于光热剂的肿瘤细胞杀伤系统还包括肿瘤组织标识装置，所述肿瘤组织标识装置用于对目标样品的肿瘤区域和正常区域进行区分。
第三方面，本发明提供了如第一方面所述的超声辅助基于光热剂的肿瘤细胞杀伤方法或如第二方面所述的超声辅助基于光热剂的肿瘤细胞杀伤系统在制备预防、诊断或治疗肿瘤药物中的应用。
本发明提供了的超声辅助基于光热剂的肿瘤细胞杀伤方法、系统和应用具有如下有益效果：
(1)本发明提供的超声热疗与近红外光热疗法的联合疗法综合了光热治疗的高效与超声热疗的穿透力强的特点，相比单独使用超声热疗或近红外光热疗法具有更强烈的光热效应，能持续、有效地积累热量，提高肿瘤区域的温度，进而高效率地杀伤肿瘤细胞；此外，该联合疗法对皮下较深层的肿瘤组织穿透力强，杀伤效果更佳。
(2)在同样的治疗效果下，本发明提供的联合疗法可以使用更低剂量化疗药物及光热剂，大大降低药物对机体正常组织产生的毒副作用。
(3)本发明提供的超声辅助基于光热剂的肿瘤细胞杀伤系统，对机体正常组织的毒副作用小、肿瘤杀伤力更强、更高效的特点，有良好的临床应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例提供的单独治疗与联合疗法的升温曲线图；
图2为本发明实施例提供的联合疗法细胞增殖和细胞毒性MTS检测柱状图。
具体实施方式
以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
若无特别说明，本发明实施例采用的试剂皆为市售商品。
实施例1
一种含吲哚菁绿药用载体的制备方法，包括以下步骤：
1)取PLGA溶于乙腈中，浓度为2mg/mL，得到第一溶液；
2)取180μg卵磷脂、120μg DSPE-PEG、750μg吲哚菁绿加入3mL 4％乙醇水溶液中，其中绿色的吲哚绿出现不溶下沉现象，得到第二溶液；
3)取1mL步骤1)所得的第一溶液逐滴加入步骤2)所得的第一溶液中，期间采用超声波细胞破碎仪以20kHz的频率及130W的功率超声5min；沉淀消失，并制得暗绿色溶液；
4)采用10kDa的超滤管离心超滤两次，即得所述含吲哚菁绿药用载体。
所得含吲哚菁绿药用载体的粒径通过粒度分析仪测得平均粒径为86nm，阿霉素的包封率为35.75±1.37％，对吲哚绿的包封率为32.73±1.17％。
检测实施例
为充分说明本发明提供的超声辅助基于光热剂的肿瘤细胞杀伤方法的有益效果，本发明实施例提供了如下检测实施例1～3，目的是说明本发明提供的联合疗法相比单独使用超声热疗或近红外光热疗法具有更强烈的光热效应，能持续、有效地积累热量，提高肿瘤区域的温度。
检测实施例1
取直径35mm，高12mm的带盖培养皿，加入1.5mL实施例1制备的含吲哚菁绿药用载体水溶液(包含吲哚菁绿为50μg/mL)；
将超声波治疗仪的探头表面涂满超声耦合剂，然后将培养皿在探头上，使培养皿底与耦合剂充分接触，设置功率输出为1.4W/cm2；
培养皿上方放置808nm激光器，控制其能量输出密度为0.8W/cm2；
设置单独超声组、单独近红外激光照射组以及联合治疗组(其中，单独超声组的超声条件为：超声能量密度1.4W/cm2，超声频率为1MHz；单独近红外激光照射组的条件为：光波长为808nm，光密度为0.8W/cm2；联合治疗组为超声与近红外激光照射联合处理，超声条件为：超声能量密度1.4W/cm2，超声频率为1MHz；近红外激光照射条件为：光波长为808nm，光密度为0.8W/cm2)，治疗时长为480s，全程采用热成像相机测量治疗区域的温度，每隔5s读取一个数据，收集的数据绘制成升温曲线。该实验还用水替代实施例1制备的含吲哚菁绿药用载体，作为对照。
实验结果显示，激光对水没有升温作用，且1.4W/cm2的超声能使水升温至37℃；吲哚菁绿纳米颗粒能十分微弱地吸收超声波的能量并将其转化为热能，但在808nm激光照射下能迅速升温至48℃以上；而治疗区域在两种能量源的作用下，能在更短的时间内超过48℃，然后继续升温，480s后能达到65℃。
为了进一步说明本发明的有益效果，本发明还提供了检测实施例1单独疗法(分别包括单独超声、单独近红外激光照射)与联合疗法的升温曲线图，如图1所示。在图1中，曲线1为单独近红外激光照射对水的升温效果，曲线2为单独超声对对水的升温效果，曲线3为单独超声对对含吲哚菁绿药用载体水溶液的升温效果，曲线4为单独近红外激光照射对含吲哚菁绿药用载体水溶液的升温效果，曲线5为联合疗法(近红外激光照射与超声同时进行)对含吲哚菁绿药用载体水溶液的升温效果。
由图1中由曲线2和3可以看出，超声可以使水及含吲哚菁绿药用载体水溶液持续升温，并达到37℃，即但超声对水或者含吲哚菁绿药用载体水溶液的作用没有很显著的差异。只是相对于水，含吲哚菁绿药用载体水溶液更能吸收超声波的能量，并将其转化为热能。
反之，由曲线1激光对水没有升温作用，而不同近红外光照波长使实施例1制备的含吲哚菁绿药用载体水溶液持续升温，并达到最高温度。说明近红外光照对于光热剂具有特异性升温作用，但温度不能持续升高。
由曲线4和5可以看出，本发明提供的方法能通过控制超声功率及超声时间来不断提高温度，克服了近红外光照热疗不能持续升温的缺陷。
此外，由于本发明提供的含光热剂的药用载体粒径在30～100nm之间，能被动靶向肿瘤组织，因此，在组织层次上的治疗中，近红外激光照射时能特异性地在具有光热剂的肿瘤区域产生光热效应，同时，通过控制超声功率及超声时间降低联合热疗对正常机体的影响，同时利用超声的穿透性强的优势，可以对皮下较深层次的肿瘤进行热疗。总之，本发明提供的超声辅助基于光热剂的肿瘤细胞杀伤方法克服了超声无特异性、不能针对肿瘤组织进行选择性杀伤的缺点，还克服了近红外光照热疗不能持续升温的缺陷。具有毒副作用小、高效、杀伤穿透力更强、对光热剂依赖性低的特点，具有较好的临床应用前景。
检测实施例2
取直径35mm，高12mm的带盖培养皿，加入1.5mL实施例1制备的含吲哚菁绿药用载体水溶液(浓度为50μg/mL)；
将超声波治疗仪的探头表面涂满超声耦合剂，然后将培养皿在探头上，使培养皿底与耦合剂充分接触，设置功率输出为0.8W/cm2；
培养皿上方放置650nm激光器，控制其能量输出密度为0.8W/cm2；
设置单独超声组、单独近红外激光照射组以及联合治疗组(其中，单独超声组的超声条件为：超声能量密度0.8W/cm2，超声频率为1MHz；单独近红外激光照射组的条件为：光波长为650nm，光密度为0.8W/cm2；联合治疗组为超声与近红外激光照射联合处理，超声条件为：超声能量密度0.8W/cm2，超声频率为1MHz；近红外激光照射条件为：光波长为650nm，光密度为0.8W/cm2)，治疗时长为600s，全程采用热成像相机测量治疗区域的温度，每隔5s读取一个数据，收集的数据绘制成升温曲线。该实验还用水替代实施例1制备的含吲哚菁绿药用载体，作为对照。
实验结果显示，激光对水没有升温作用，且0.8W/cm2的超声能使水600s后升温至37℃；吲哚菁绿溶液能十分微弱地吸收超声波的能量并将其转化为热能，但在650nm激光照射下能迅速升温至46℃以上；而治疗区域在两种能量源的作用下，能在更短的时间内超过46℃，然后继续升温，600s后能超过61℃。
检测实施例3
取直径35mm，高12mm的带盖培养皿，加入1.5mL实施例1制备的含吲哚菁绿药用载体水溶液(浓度为50μg/mL)；
将超声波治疗仪的探头表面涂满超声耦合剂，然后将培养皿在探头上，使培养皿底与耦合剂充分接触，设置功率输出为2.0W/cm2；
培养皿上方放置850nm激光器，控制其能量输出密度为1.5W/cm2；
设置单独超声组、单独近红外激光照射组以及联合治疗组(其中，单独超声组的超声条件为：超声能量密度2.0W/cm2，超声频率为1MHz；单独近红外激光照射组的条件为：光波长为850nm，光密度为1.5W/cm2；联合治疗组为超声与近红外激光照射联合处理，超声条件为：超声能量密度2.0W/cm2，超声频率为1MHz；近红外激光照射条件为：光波长为850nm，光密度为1.5W/cm2)，治疗时长为180s，全程采用热成像相机测量治疗区域的温度，每隔5s读取一个数据，收集的数据绘制成升温曲线。该实验还用水替代实施例1制备的含吲哚菁绿药用载体，作为对照。
实验结果显示，激光对水没有升温作用，且2.0W/cm2的超声能使水180s后最高升温至42℃；吲哚菁绿溶液能十分微弱地吸收超声波的能量并将其转化为热能，但在850nm激光照射下能迅速升温至60℃以上；而治疗区域在两种能量源的作用下，能在更短的时间内超过60℃，然后继续升温，300s后能超过75℃。
为了进一步说明本发明的有益效果，本发明实施例对检测实施例1～3的实验条件以及结果进行如下统计对比：
表1.检测实施例1～3单独超声实验结果
表2.检测实施例1～3单独光照实验结果
表3.检测实施例1～3联合热疗实验结果
由表1可以看出，不同超声功率使水达到37℃所需要的超声时间不同，功率越大，所需要的时间越短。
由表2可以看出，不同近红外激光波长使实施例1制备的含吲哚菁绿药用载体水溶液持续升温，并达到最高温度，光密度越大，最高温度越高。相对表1，近红外光照能在短时间内迅速升温，但温度不能持续升高。
由由表3可以看出，本发明提供的超声辅助基于光热剂的肿瘤细胞杀伤方法(联合疗法)能迅速升温，随着治疗时间延长，还能持续平稳升高。
效果实施例
一种超声辅助基于光热剂的肿瘤细胞杀伤方法，包括如下步骤：
(1)取实施例一制备的自杀基因纳米胶束配成浓度为 300μg/mL自杀基因纳米胶束溶液；
取人乳腺癌细胞系MCF-7，以104个/孔接种于96孔板，孵育过夜。取实施例1制备的含吲哚菁绿药用载体，以完全培养基为基底配置含吲哚菁绿药用载体溶液至吲哚菁绿(ICG)浓度为25μg/mL和50μg/mL(即假设所述含吲哚菁绿药用载体完全释放所包载的ICG时，ICG在完全培养基中的浓度分别为25μg/mL和50μg/mL)，每孔加药150μL，继续孵育2小时。
设置声热组、光热组和联合热疗组。声热组采用单独超声疗法，超声波发生器的超声条件为：超声能量密度1.0W/cm2，超声频率为1MHz；光热组为单独近红外激光照射组，近红外激光照射条件为：光波长为808nm，光密度为0.7W/cm2；联合热疗组为超声疗法与近红外激光照射联合处理，超声波发生器的超声条件为：超声能量密度1.0W/cm2，超声频率为1MHz；近红外激光照射条件为：光波长为808nm，光密度为0.7W/cm2。
声热组、光热组和联合热疗组各组的治疗时长为1分钟。每组还设置空白对照孔，空白对照采用细胞培养基替代含吲哚菁绿药用载体加入细胞培养孔中。
治疗后继续孵育12小时，每孔中加入MTS/PMS混合液，继续反应40min使其显色，然后通过酶联免疫检测仪在波长490nm处检测各孔吸光值，对比空白组得到细胞存活率。
结果如图2所示。由图2可知，声热组、光热组和联合热疗组的空白对照孔的细胞存活率差异不大，说明单纯的激光和超声对MCF-7细胞的存活率影响很小；此外，不加光热剂时的联合热疗也对细胞没有显著的杀伤作用。而ICG)浓度为25μg/mL和50μg/mL的条件下，光热剂被细胞摄取，在激光照射和超声辐照下，迅速产生高温，对细胞造成热毒性；其中，在ICG浓度为25μg/mL的条件下，联合热疗组细胞存活率为33.1％，光热组为47.2％，单纯声热组为74.2％，相对而言，本发明通过的联合热疗法对细胞的杀伤作用更强；当ICG浓度为50μg/mL，相比25μg/mL的浓度，声热组和联合热疗组相差不大，而光热组有明显的光热剂依赖性，虽然光热组的热毒性有所提高，但仍然比联合热疗组的效果差；综上足以说明本发明通过的超声辅助基于光热剂的肿瘤细胞杀伤方法不依赖光热剂、能持续稳定地保持较高杀伤温度的有益效果。
Claims (5)
1.一种超声辅助基于光热剂的肿瘤细胞杀伤方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）提供目标样品，将直径为30~100nm包载光热剂、化疗试剂的药用载体注射至目标样品内，其中，所述药用载体为脂聚合物，所述脂聚合物包括聚乳酸-羟基乙酸、卵磷脂和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇；所述目标样品为离体组织或细胞悬液，所述组织或细胞悬液包括肿瘤细胞和正常细胞；当所述目标样品为离体组织时，将直径为30~100nm包载光热剂、化疗试剂的药用载体注射至目标样品内至光热剂的终浓度为0.1~10mg/kg；当所述目标样品为细胞悬液时，将直径为30~100nm包载光热剂、化疗试剂的药用载体注射至目标样品内至光热剂的终浓度为10~500μg/mL；
2）取步骤1）处理后的目标样品，采用超声装置对目标样品进行超声处理，同时采用近红外激光照射所述目标样品，控制超声波的输出功率与频率，使得所述肿瘤细胞的温度超过43℃，使得所述正常细胞的温度不超过43℃，其中，所述超声波的输出功率范围为0.8~2.0 W/cm2；所述近红外激光的波长为650~900nm，能量密度范围为0.5~1.5 W/cm2；所述近红外激光从与超声处理相对立的侧面进行照射；采用超声装置对目标样品进行超声处理时，将超声装置的超声波探头与治疗区域相贴，中间填充超声耦合剂。
2.如权利要求1所述的一种超声辅助基于光热剂的肿瘤细胞杀伤方法，其特征在于，所述步骤（1）中，所述光热剂为吲哚菁绿、金纳米颗粒、金纳米管或碳纳米管。
3.如权利要求1所述的一种超声辅助基于光热剂的肿瘤细胞杀伤方法，其特征在于，所述肿瘤细胞选自B淋巴细胞肿瘤细胞、白血病细胞、肺癌细胞、胃癌细胞、结直肠癌细胞、肝癌细胞、食管癌细胞、乳腺癌细胞、胰腺癌细胞、膀胱癌细胞和甲状腺癌细胞中的一种。
4.如权利要求1所述的一种超声辅助基于光热剂的肿瘤细胞杀伤方法，其特征在于，所述超声波的输出功率为1.4W/cm2，所述近红外激光的波长为808nm，能量密度为0.8W/cm2；或者是
所述超声波的输出功率为0.8W/cm2，所述近红外激光的波长为650nm，能量密度为0.8W/cm2；或者是
所述超声波的输出功率为2.0W/cm2，所述近红外激光的波长为850nm，能量密度为1.5W/cm2。
5.如权利要求1所述的一种超声辅助基于光热剂的肿瘤细胞杀伤方法，其特征在于，所述超声处理与近红外激光的照射时间皆为180~600秒。
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