CN103893754A

CN103893754A - Dna-壳聚糖复合纳米颗粒、其制备及应用

Info

Publication number: CN103893754A
Application number: CN201210575641.0A
Authority: CN
Inventors: 万晓春; 田永帅; 马轶凡; 蔡林涛
Original assignee: Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Current assignee: Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Priority date: 2012-12-26
Filing date: 2012-12-26
Publication date: 2014-07-02

Abstract

本发明公开一种DNA-壳聚糖复合纳米颗粒，为壳聚糖增溶衍生物包裹的含有AS4短发夹序列的重组质粒，所述AS4短发夹序列为通过环状序列连接的、与IL-10基因的siRNA对应的DNA序列。本发明还公开了该纳米颗粒的制备方法，以及其作为免疫佐剂的应用。本发明的纳米颗粒免疫佐剂颗粒均匀性好；可引发细胞免疫刺激；细胞毒性小；可快速有效地抑制IL-10抑炎因子的表达，进而实现辅助增强疫苗效力的佐剂作用；而且由于使用壳聚糖纳米包裹技术，在细胞中具有缓释效应，并能组织细胞内的核酸内切酶降解DNA。

Description

DNA-壳聚糖复合纳米颗粒、其制备及应用

【技术领域】

本发明涉及新型免疫佐剂，具体涉及一种DNA-壳聚糖复合纳米颗粒、其制备方法，及作为免疫佐剂应用。

【背景技术】

目前不断开发出的新型疫苗具有良好的抗原特异性和低毒性，但疫苗免疫原性较差。尽管已成功制备得到很有希望的抗原，却并不能诱导出足够强的预防作用。例如，可溶性纯化蛋白质疫苗或蛋白质亚单位疫苗的免疫激活作用通常较弱，不足以刺激机体产生足够抗体；单独应用时所需抗原量较多，机体产生的抗体量较少；且还易引起免疫耐受。但这些疫苗在与较匹配佐剂连用时，以上缺点就会有所改善。因此开发安全有效的免疫佐剂来辅助增强疫苗效力，对于更多新型疫苗在临床上的成功应用具有重要意义。

佐剂的作用方式多种多样，人们对其与免疫系统间相互作用的知识也正在逐渐丰富，并已经成为现代免疫学的重要组成部分。分别从事佐剂研究，对于深入理解佐剂作用机理和机体免疫调节方式很有意义。

免疫佐剂可辅佐免疫原刺激机体产生较早、较强、持久的免疫应答。理想的免疫佐剂应该能满足以下条件：（1）在有效剂量内无毒或毒性极小；（2）能刺激机体产生强大的体液免疫和/或细胞免疫应答；（3）具有持久的免疫力；（4）不诱导自身免疫；（5）无致突变、致癌、致畸形作用等。虽然现在已有许多佐剂应用于动物，但还没有哪一种佐剂能完全满足以上要求。

近年来，随着第2、3代疫苗的迅速发展，特别是多肽疫苗呈现出的极大发展空间，促使免疫佐剂也有了长足的进步。

目前通过FDA批准的能用于人的佐剂铝胶佐剂存在两方面主要缺点：其一，只能激发机体产生体液免疫，不能诱导细胞免疫。而细胞免疫对机体细胞内寄生病原体(病毒、原虫等)及肿瘤免疫力的产生尤为必要。其二，铝胶佐剂对人免疫缺陷病毒（HIV）、丙型肝炎病毒（HCV）、单纯疱疹病毒（HSV）、流感病毒，以及血吸虫病、百日咳和伤寒等抗原没有免疫佐剂性效果。因此已远远不能满足新型疫苗发展的要求。

纳米技术是一门具有广阔前景的新兴技术，纳米技术与免疫技术相结合的产物-纳米佐剂已成为了当前疫苗研究的热点。从免疫学观点来看，纳米佐剂均匀性好，包裹或吸附的抗原颗粒正是巨噬细胞（M5）和树突状细胞（DC）的首选吞噬目标，这为实现机体有效的免疫反应完成了重要的一步。而且纳米佐剂与多肽抗原或DNA疫苗连接后，可以避免常规佐剂载体效应的发生，起到保护抗原的作用。

【发明内容】

本发明旨在克服现有技术的以上缺陷，提供新型DNA-壳聚糖复合纳米颗粒的免疫佐剂。

具体地，本发明一方面提供一种DNA-壳聚糖复合纳米颗粒，为壳聚糖增溶衍生物包裹的含有AS4短发夹序列的重组质粒，所述AS4短发夹序列为通过环状序列连接的SEQ NO.1所示序列与其互补序列。

所述壳聚糖增溶衍生物可以为壳聚糖-聚乙烯亚胺-聚乙二醇聚合物。

所述环状序列可以为TCAAGAG序列。

所述重组质粒的大小可以为4610bp。

所述纳米颗粒的粒径可以为35-50nm。

所述壳聚糖增溶衍生物与所述重组质粒的的包被比例为摩尔比20:1。

本发明另一方面提供用于制备该纳米颗粒的方法，包括以下步骤：

S1合成AS短发夹序列，并退火；

S2将经退火的AS短发夹序列与双酶切线性质粒、DNA连接酶在连接缓冲液中混合，转化感受态大肠杆菌，接种于含氨苄抗性的LB培养基，做抗性筛查，选取抗性菌落，得到重组质粒溶液；以及

S3将壳聚糖增溶衍生物溶液与重组质粒溶液混合，得到DNA-壳聚糖复合纳米颗粒溶液。

步骤S3中壳聚糖增溶衍生物溶液的pH可以为5.5。

步骤S3中壳聚糖增溶衍生物溶液与重组质粒溶液在混合前，可以分别于65℃恒温5分钟。

本发明再一方面提供该纳米颗粒作为免疫佐剂的应用。

本发明的纳米颗粒免疫佐剂均匀性好；可诱导细胞免疫；细胞毒性小；可快速有效地降低抑炎因子IL-10的表达；通过纳米颗粒包括技术，在细胞中具有缓释效应，且能保护DNA免于被细胞内核酸内切酶降解。

【附图说明】

图1示出根据本发明实施例的重组质粒的凝胶电泳检测结果。

图2为根据本发明实施例的纳米颗粒的扫描电镜图像。

图3示出根据本发明实施例的纳米颗粒的凝胶阻滞电泳检测结果。

图4示出本发明的纳米颗粒在降低抑炎因子IL-10表达上的作用。

【具体实施方式】

IL-10最初发现是鼠的Th2细胞分泌的一种独特的细胞因子，后来发现B细胞、单核/巨噬细胞、角化细胞和多种肿瘤细胞以及人的Th1细胞均可分泌IL-10。

IL-10具有很强的抗炎及免疫抑制活性，它能抑制IL-2、IFN-C及促炎因子的产生和释放；可减少免疫受体

的表面表达；能抑制人的Th2细胞,导致细胞增生和细胞因子的产生减少。

IL-10具有多种抑制功能，例如抑制单核细胞依赖性Th细胞增生；抑制Th1类淋巴因子的合成及其活性；抑制单核细胞表面

类分子表达，降低单核细胞的抗原提呈能力，阻断抗原特异性单核/巨噬细胞因子的产生；抑制NK细胞的活性，IL-10并不直接作用于NK细胞，而是通过抑制IFN-C的产生间接发挥作用。IFN-C对NK细胞增殖活化具有正向调节作用。¹/₄抑制T细胞的凋亡，从外周血单核细胞中分离出的T细胞，如在培养液中加入IL-10可减少T细胞的凋亡。抑制反应性氮氧化物的产生，反应性氮氧化物对细胞内代谢产物及细胞内外寄生物的清除有重要意义。

IL-10具有很强的免疫刺激作用，包括：促进非单核细胞依赖性T细胞的增殖、成熟。在IL-3、IL-4存在的条件下，刺激肥大细胞及其祖细胞的增殖，增强肥大细胞的活力。刺激抗原特异性B细胞增殖，并分化为浆细胞。

基于此，本发明人设计了一种包含有AS4短发夹序列的重组质粒，该AS4短发夹序列为通过环状序列连接的SEQ NO.1所示序列与其互补序列。

AS4短发夹序列的设计

通过GeneBank获得人IL-10基因序列，针对其编码区设计了一个RNAi靶位。在互补的siRNA之间引入一个环状结构序列，该环状序列可以为，例如TCAAGAG。在shRNA5'端和3'端分别引入BamH I和Hind Ⅲ酶切位点，反义片段以后接终止信号TTTTT，以终止转录。如此，形成了BamH I+正义链+环链+反义链+终止信号+Hind III的结构。

化学合成所设计的shRNA的反义DNA序列，即本发明的AS4序列。作为对照，本发明人还使用相同的环状序列TCAAGAG，连接SEQ NO.2所示序列，合成了对照序列（对照）。

为了形成稳定的DNA双链，将合成得到的DNA序列进行退火。用灭菌三蒸水分别溶解合成AS4片段（正义链与反义链）溶解，终浓度为10umol/L。并按以下条件完成退火：正义链2uL、反义链2uL、10x退火缓冲液2ul，加三蒸水到总体积为20uL，于80℃水浴2分钟，缓慢冷却至室温（16℃），完成退火。

重组质粒

制备：

为获得重组质粒，本发明人使用了pSilencer 3.1-H1 hygro载体来构建pS-AS4-IL10表达载体。

首先，利用pSilencer 3.1-H1 hygro，获得线形质粒：按照pSilencer 3.1-H1hygro载体说明书，制备质粒溶液1ug/uL；转化感受态大肠杆菌DH5α；接种于氨苄青霉素（ampcillin）的LB固体培养基；抗性筛选提取质粒pSilencer 3.1-H1；通过BamH I和Hind III双酶切；胶回收酶切产物，获得线性目的质粒20uL（16ug/uL）。

之后，连接线性目的质粒与经退火的DNA片段。双酶切线性质粒pSilencer3.1-H1 4uL、经退火AS4序列1uL、T4DNA连接酶2uL、10倍连接缓冲液（ligation buffer）2uL，加灭菌三蒸水至总体积为20uL，于16℃水浴12小时，之后置于65℃水浴10分钟。转化感受态大肠杆菌，接种于含氨苄抗性的LB培养基，做抗性筛选，选取抗性菌落。获得重组质粒（pS-AS4）。

使用对照DNA序列，以相同的方法，指标得到对照质粒（pS-对照）。

表征：

抗性筛选后取抗性菌落，在重组质粒的插入位点上下游设计引物菌落做菌落PCR鉴定扩增片段长度是否为插入片段长度，引物为：3.1sq-F:TCTTTGGATTTGGGAATCTTAT,3.1sq-R:ACACAGGAAACAGCTATGA。将PCR产物片段大小合适的菌落送Invitrogen公司测序，进一步鉴定重组质量的正确性。

菌落PCR产物电泳检测后条带大小为插入片段大小，Invitrogen公司测序结果显示shRNA表达片段正确的插入到pSilencer 3.1-H1载体中。

图1示出该重组质粒的凝胶电泳（1%琼脂糖凝胶）检测结果。重组质粒制备后电泳条带显示片段大小大约为5000bp，条带亮度较高，符合预期。

纳米颗粒

进一步，本发明人将该重组质粒与纳米技术相结合，利用壳聚糖增溶衍生物包裹重组质粒，以形成纳米颗粒。

壳聚糖是自然界中迄今发现的唯一一种阳离子多糖，在水溶液中电离为阳离子。如此形成的带极性阳离子纳米颗粒，便于吸附到带有负电荷的细胞膜上，促进细胞的胞吞作用。这样就可以使壳聚糖纳米颗粒包装的分子药物便于被细胞吸收。且壳聚糖的生物相容性非常好，用其制备的纳米颗粒对细胞毒性非常低，其本身就可以作为一种免疫增强剂使用，故用其包装可抑制IL-10表达的DNA分子药物将是一种非常好的免疫增强剂，即疫苗佐剂。

然而，壳聚糖因水溶性较差，在生物体中的使用也有一定的局限性。本发明使用经改性的壳聚糖增溶衍生物，例如壳聚糖-聚乙烯亚胺-聚乙二醇聚合物（CS-N-PEI-PEG），大大提高了壳聚糖的水溶性。其带有的阳离子电荷增加，使其转染效率大大提高。

此外，由于这样的壳聚糖衍生物的分子构象更加复杂，用其制备得到的纳米颗粒在包装DNA后会使包装后的纳米颗粒分子组装更加紧密，在细胞中能够更加有效地抵御细胞DNA酶对外来DNA的剪切，起到对IL-10干扰分子的缓释作用。

制备：

本发明中，使用离子交联法来制备壳聚糖增溶衍生物包裹的重组质粒。将壳聚糖增溶衍生物CS-N-PEI-PEG（壳聚糖-聚乙烯亚胺-聚乙二醇聚合物，参考《聚乙二醇-壳聚糖-聚乙烯亚胺共聚物的制备及其基因传递系统性能的研究》--中山大学博士学位论文---张未，潘仕荣等，20080420，制备得到）的溶液（pH5.5），重组质粒溶液，分别于65℃水浴恒温5分钟。然后将二者均匀混合10分钟，得到壳聚糖增溶衍生物包裹重组质粒的纳米颗粒，即本发明的DNA-壳聚糖复合纳米颗粒（CNP-pS-AS4）。

使用对照DNA序列，以相同的方法，获得对照纳米颗粒（CNP-pS-对照）。

表征：

1.纳米颗粒的形态、粒径及Zeta电位测定

取少量质粒壳聚糖纳米样品液于透射电子显微镜下观察纳米颗粒形态并拍照。另取纳米颗粒样品液适量，加双蒸水稀释后用Zetasizer3000HS/IHPL纳米粒度分析仪测定粒径、分散度及Zeta电位。

电镜照片示于图2中，图中的电镜观察结果表明壳聚糖纳米颗粒多呈球形，且均匀性较好。

纳米粒度分析仪测定结果如下表1所示：

表1 纳米颗粒的粒径和Zeta电位

纳米颗粒	粒径（nm）	Zeta电位（mV）
			CNP-pS-AS4	42.9	133.6
CNP-pS-对照	42.3	131.2

纳米颗粒的的粒径越小越容易转染到细胞内，转染效率越高，当纳米颗粒粒径小于80nm时可以穿透毛细血管的管壁。所以本发明颗粒的粒径在30-50nm范围内，使得本发明的颗粒可以做成针剂或者口服药物，利于穿透血管壁进入循环系统，利于药物投递，是一个非常好的投递系统。

2.凝胶阻滞分析

分别取pS-AS4重组质粒溶液和CNP-pS-AS4纳米颗粒样品液进行0.7%琼脂糖凝胶电泳，以检测本发明纳米颗粒的包裹效果。c为pSilencer 3.1-H1空载体，4为DNA-壳聚糖复合纳米颗粒（CNP-pS-AS4）。

0.7%琼脂糖凝胶水平电泳结果如图3所示：与对照比较，CS-N-PEI-PEG包裹的重组质粒在5000bp位置不见条带，加样孔中微有亮点。这说明核酸染料无法直接与DNA聚合；或者DNA-壳聚糖复合纳米颗粒的粒径过大，而无法通过琼脂糖聚合孔径。说明DNA-壳聚糖复合纳米颗粒包裹成功。

免疫试验

对淋巴细胞的转染：

向细胞培养板中分别加入本发明的DNA-壳聚糖复合纳米颗粒（CNP-pS-AS4），使其终浓度均为2ug/ml。转染4小时后向培养基中添加胎牛血清，使血清终浓度为10%。

定量PCR免疫相关基因的定量检测

表达分析用Bio-Rad iQ5定量PCR仪进行。以白细胞cDNA为模板，用下表2中所列引物进行扩增。检测细胞因子IL-10表达量的变化，以说明免疫效应是否提高。

表2

名称	引物序列（5′-3'）
		IL-10-F	CGGCGCTGTCATCAATTTCTG
IL-10-R	CCCCTCTCTTGGAGCTTGCTA
		β-actin-F	CAGCTCCTCCCTGGAGAAGAGCTA
β-actin-R	CTTCTGCATCCTGTCGGCAATGCC

定量PCR扩增参数为：95℃预变性30秒；95℃30秒；60℃60秒；循环45次。

溶解曲线参数为：65-95℃，每10秒上升0.5℃。

以β-actin作为内参基因，采用ΔΔCt法分析实时荧光定量PCR数据，比较同一目的基因不同时期的相对表达水平。

图4示出在抑炎因子IL-10中分别加入本发明的DNA-壳聚糖复合纳米颗粒；病毒激活剂猪繁殖与呼吸综合症病毒（PRRSV）的阳性对照Cp；以及不加病毒激活剂也不加本发明的纳米颗粒（空白对照C）时，IL-10的相对表达水平。

从图表中可见，加入本发明的CNP-pS-AS4之后，IL-10的表达水平得到明显抑制，48小时内抑制率在95%以上。

RNA干扰（RNAi）是一种特异的转录后基因沉默机制，这是由与目标基因同源互补的19-27个核苷酸的siRNA分子介导的转录调控机制。siRNA及其类似物可在体内外专门针对pre-mRNA或成熟的mRNA进行可逆性地抑制基因表达，通过RNAi技术手段实现IL-10表达水平的调控具有可行性，但其应用受siRNA半衰期短，易于降解等因素限制。

本发明设计表达shRNA的双链DNA序列，构建到psilencer3.1-H1载体中，通过壳聚糖包裹形成纳米颗粒转染到细胞中，壳聚糖纳米颗粒可以阻止细胞中DNA对表达载体的降解，表达载体可以在细胞中持续转录形成针对IL-10的shRNA，从而实现持久高效的抑制IL-10基因的表达的效果。

综上，本发明通过使用独特设计的AS4序列，并将其重组于质粒后，包裹在壳聚糖中，得到了能够快速有效抑制IL-10表达的纳米颗粒，从而可以用作免疫佐剂。

本发明的DNA-壳聚糖复合纳米颗粒均匀性好，平均粒径为42.9nm，分布在30nm-50nm范围内，匀质性好，且纳米颗粒带有阳离子电荷，利用吸附到细胞表面，有利于转染到细胞中。

纳米颗粒表面带有正电荷（Zeta电位133.6mV），易于与带有负电荷的细胞膜融合，便于树突状细胞和巨噬细胞吞噬，从而引发细胞免疫刺激；

由于使用了壳聚糖包裹，本发明的纳米颗粒在细胞内具有缓释效应，并且能够阻止细胞内核酸内切酶对纳米颗粒包裹的DNA的降解。

以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所作出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。

Claims

1.一种DNA-壳聚糖复合纳米颗粒，为壳聚糖增溶衍生物包裹的含有AS4短发夹序列的重组质粒，所述AS4短发夹序列为通过环状序列连接的SEQ NO.1所示序列与其互补序列。

2.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其特征在于，所述壳聚糖增溶衍生物为壳聚糖-聚乙烯亚胺-聚乙二醇聚合物。

3.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其特征在于，所述环状序列为TCAAGAG序列。

4.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其特征在于，所述重组质粒的大小为4610bp。

5.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其特征在于，所述纳米颗粒的粒径为35-50nm。

6.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其特征在于，所述壳聚糖增溶衍生物与所述重组质粒的包被比例为摩尔比20:1。

7.用于制备权利要求1-6中任一项所述的纳米颗粒的方法，包括以下步骤：

S1合成AS4短发夹序列，并退火；

S2将经退火的AS4短发夹序列与双酶切线性质粒、DNA连接酶在连接缓冲液中混合，转化感受态大肠杆菌，接种于含氨苄抗性的LB培养基，做抗性筛查，选取抗性菌落，得到重组质粒溶液；以及

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤S3中壳聚糖增溶衍生物溶液的pH为5.5。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤S3中壳聚糖增溶衍生物溶液与重组质粒溶液在混合前，分别于65℃恒温5分钟。

10.权利要求1-6中任一项所述的纳米颗粒作为免疫佐剂的应用。