CN103882135A - 一种用于检测白色念珠菌的引物对、试剂盒及其应用 - Google Patents

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黄钟
李小青
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Abstract

本发明涉及一种用于检测白色念珠菌的引物对、试剂盒及其应用。本发明的引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物为SEQ ID NO：1上的一段序列，所述下游引物为SEQ ID NO：1的互补序列上的一段序列。使用本发明的特异性引物对能够快速、灵敏、准确地从临床样品中检测白色念珠菌，这对于早期诊断、及时治疗和有效控制生殖道白色念珠菌感染极有意义。

Description

一种用于检测白色念珠菌的引物对、试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及疾病检测技术领域，尤其涉及白色念珠菌的检测，特别涉及一种用于检测白色念珠菌的引物对、试剂盒和基因芯片。
背景技术
生殖道感染（Reproductive Tract Infection，RTI）是指各种病源微生物和寄生虫感染于生殖道或是经生殖道感染的一组感染性疾病的统称，包括内源性、外源性、医源性及性传播等感染，该病主要发生于生育期。生殖道感染疾病危害性涉及到诸多方面，表现在：（1）危害人类生殖健康，所导致的严重后果包括慢性盆腔炎疼痛、男女不孕症、宫外孕、异位妊娠和感染HIV风险增加等。（2）RTI还会对新生儿的健康带来影响，很多性传播疾病（如梅毒、淋病、衣原体、乙肝、人类乳头状瘤病毒、单纯疱疹病毒和艾滋病毒）可以通过妇女的怀孕期、分娩期和哺乳期传给孩子，这被称为“垂直传播”，给婴儿的健康造成严重后果。另外RTI也会引起自然流产、胎膜早破、早产和由此产生的低出生体重以及死胎。当孕妇为淋病患者时，多达35％的妊娠结果为自然流产和早产，多达10％为围产儿死亡。当孕妇衣原体未经治疗，新生儿先天性感染几率为30％，每年有数千名新生儿因此而失明。（3）生殖道感染疾病影响避孕节育的安全性。（4）生殖道感染还可增加宫颈癌发生的危险。（5）生殖道感染会增加多种疾病混合感染的危险，例如淋病患者感染衣原体、支原体的概率为非感染者的3-5倍。RTI带来这些严重的后果，对男性、女性个人和他们的家庭乃至整个社区造成健康问题。在我国有生殖感染症状的育龄妇女比例高达34.1%，已婚育龄妇女的既往生殖感染率高达73％，同时生殖感染疾病发病率目前也正以30%的速度逐年增长。
妇女RTI疾病严重影响人类生殖健康，随着RTI发病率的上升，经济生产率受到影响，很多家庭的生活质量下降，RTI已经成为当今人类面临的重大社会问题。
白色念珠菌（Candida albicans，CA）又称假丝酵母菌，广泛存在于自然界，也存在于正常人口腔、上呼吸道、肠道及阴道，一般在正常机体中数量少，不引起疾病，为条件致病性。当机体抵抗力降低或菌群失调时，白色念珠菌由酵母相转化为有毒性的菌丝相并快速繁殖侵入人体细胞从而引起疾病。白色念珠菌是RTI重要的条件致病性真菌，白色念珠菌感染给人们特别是育龄妇女带来非常严重的危害，造成的女性生殖器官病理性改变，是不孕不育的重要原因。孕妇感染白色念珠菌后，影响胎儿发育，上行感染时，会导致早产，也会引起宫颈炎和宫颈糜烂，如果病原体进入宫腔，则会引起输卵管卵巢炎症、盆腔炎等后果。
近年来，随着社会发展及人们生活环境等因素改变，并伴随光谱抗菌药物、肿瘤化疗、器官和细胞移植技术的发展、激素、放疗、化疗及免疫抑制剂的广泛应用和侵入性医疗操作的普遍使用，机会性真菌尤其是白色念珠菌引起的生殖道感染人口数量日益增多。有文献报道，女性阴道白色念珠菌感染率为80.77%，并且大部分经治疗后极易复发，难以彻底治愈。
CA的传统检测有湿片法、免疫血清检查、微生物法（培养观察菌落特征和菌体形态结合生化特性检验）和动物接种等方法。湿片法敏感性较低（30%～50%）；白色念珠菌在人体某些部位正常寄居，其孢子可存在于正常人体，而且与人体某些组织间有共同抗原，使免疫血清鉴定缺乏特异性；微生物法培养时间长，而且生化性状阳性率参数设置因地域差或生化型不好控制，直接影响鉴定结果的准确性，漏检率也很高；动物接种法可靠，但手续繁琐，对早期诊断不利，难以推广。自上世纪80年代起，分子生物学研究的不断深入，新的技术也普遍应用于白色念珠菌的检测，如分子杂交和荧光探针和直接免疫荧光法等，这些方法需要特殊的实验设备和条件，成本较高，难以在临床推广。有报道以白色念珠菌的P47细胞质的抗原蛋白建立了ELISA检测试剂盒，但此试剂盒缺乏敏感度和特异性，有待临床考验。由于早期治疗能减低病死率，因此，快速、灵敏、准确地从临床标本中直接检出CA对于疾病的早期诊断和治疗有着非常重要的意义。
自上世纪80年代起，分子生物学研究的不断深入，PCR技术开始广泛应用于微生物领域，该技术灵敏度好、特异性高，操作简单、快速，很大程度上缩短了诊断时间。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明人通过PCR方法确定了一段白色念珠菌的保守序列，通过检测该段保守序列能够检测白色念珠菌的感染，所述保守序列具有SEQ ID NO：1所示的序列。因此，本发明的目的在于提供一种用于检测白色念珠菌的引物对，包括所述引物对的PCR检测试剂盒及其应用。使用本发明提供的白色念珠菌的特异性引物对能够快速、灵敏、准确地从临床样品中检测白色念珠菌，这对于早期诊断、及时治疗和有效控制生殖道白色念珠菌感染极有意义。
在第一方面，本发明提供一种用于检测白色念珠菌的引物对，包括上游引物和下游引物，所述上游引物为SEQ ID NO：1上的一段序列，所述下游引物为SEQ ID NO：1的互补序列上的一段序列。
本发明人通过研究发现，SEQ ID NO：1是一段在白色念珠菌基因组上具有高度保守性的序列，而且相比于白色念珠菌基因组上的其它序列片段，该序列片段更容易扩增，针对该序列片段通过设计引物对取自人体（如女性生殖器）的样品进行PCR扩增能够判定白色念珠菌的感染情况。发明人针对该序列片段设计了多对引物进行PCR扩增，均能得到预期的扩增产物。而针对白色念珠菌基因组上的其它几个序列片段设计引物进行PCR扩增，没有得到预期的扩增产物。说明本发明的SEQ ID NO：1是易于扩增的序列片段，能够用于确定白色念珠菌的感染。
作为本发明的优选技术方案，所述上游引物和下游引物的序列长度均为12-30个碱基，例如12个碱基、15个碱基、16个碱基、18个碱基、20个碱基、22个碱基、25个碱基、27个碱基或29个碱基等。
作为本发明的优选技术方案，所述上游引物的5’端起始于SEQ ID NO：1的第一个碱基；所述下游引物的5’端第一个碱基与SEQ ID NO：1的最后一个碱基互补。其中，SEQ ID NO：1的第一个碱基即5’端的首个碱基，最后一个碱基即3’端的首个碱基。这样的一对引物能够扩增出SEQ ID NO：1的全长序列，长度为118bp。
作为本发明的优选技术方案，所述上游引物和下游引物的PCR扩增产物的大小为80-118bp，例如82bp、88bp、92bp、98bp、100bp、105bp、108bp、112bp、114bp、115bp或117bp，优选90-118bp，更优选99-118bp。PCR扩增产物的大小具体是由引物对在SEQ ID NO：1序列上的位置决定的。
作为本发明的优选技术方案，所述引物对的扩增产物为SEQ ID NO：1、SEQID NO：10、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：18，大小分别为118bp、112bp、104bp和99bp。
作为本发明的优选技术方案，所述上游引物选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13或SEQ IDNO：16；所述下游引物选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：17。可以从上游引物的具体例中选择一个引物与从下游引物的具体例中选择的一个引物配对进行PCR扩增。
作为本发明的优选技术方案，所述引物对选自下列任一项：
（a）所述上游引物为SEQ ID NO：2，所述下游引物为SEQ ID NO：3；
（b）所述上游引物为SEQ ID NO：4，所述下游引物为SEQ ID NO：5；
（c）所述上游引物为SEQ ID NO：6，所述下游引物为SEQ ID NO：7；
（d）所述上游引物为SEQ ID NO：8，所述下游引物为SEQ ID NO：9；
（e）所述上游引物为SEQ ID NO：11，所述下游引物为SEQ ID NO：12；
（f）所述上游引物为SEQ ID NO：13，所述下游引物为SEQ ID NO：14；
（g）所述上游引物为SEQ ID NO：16，所述下游引物为SEQ ID NO：17。
本发明人使用（a）～（g）中的7对引物进行PCR扩增，分别得到118bp、118bp、118bp、112bp、112bp、104bp和99bp的扩增产物，与预期相符，因此可使用这7对引物作为检测白色念珠菌感染的引物对。
在第二方面，本发明提供一种白色念珠菌的PCR检测试剂盒，包括第一方面所述的引物对。
作为本发明的优选技术方案，所述PCR检测试剂盒还包括PCR缓冲液、MgCl2溶液、dNTPs和Taq DNA聚合酶。
在第三方面，本发明提供一种第一方面所述的引物对在作为白色念珠菌的PCR检测试剂盒的特异性引物或作为白色念珠菌的基因芯片探针序列中的应用。
本发明的有益效果为：本发明人研究发现了一段白色念珠菌的保守序列SEQ ID NO：1，该段保守序列易于扩增，具有高度的白色念珠菌特异性，本发明针对该序列设计了引物对，使用本发明提供的引物对扩增临床样品，能够快速、灵敏、准确地从临床样品中检测白色念珠菌，对于早期诊断、及时治疗和有效控制生殖道白色念珠菌感染极有意义。
附图说明
图1为本发明实施例1的引物对扩增临床标本的PCR扩增产物鉴定结果图，其中泳道Mr为DNA Marker，泳道1和2为从临床阳性样品（白色念珠菌感染）DNA中扩增的产物，泳道3为阴性对照。
图2为本发明实施例1阳性扩增产物的测序结果图，其中，测序图谱上第167位G到284位G之间的序列为扩增产物的序列，与预计序列一致。
图3为本发明实施例1阳性扩增产物的测序结果与NCBI数据库中Blast比对结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，以下实施例仅为本发明的优选实施例，以便于更好地理解本发明，因而不应视为限定本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂厂商购买得到的。
实施例中，pMD18-T载体、PCR buffer、MgCl2、dNTPs、Taq DNA聚合酶和DNA Ligation Kit购自Takara（大连），DNeasy Plant Mini Kit购自Qiagen公司。试剂盒保存于-20℃，尽量避免反复冻融。
实施例1：
本实施例以GAACCACCTCAAAATCATCCAAC（SEQ ID NO：2）和CTTGAGAAGACGAAGAAGCGG（SEQ ID NO：3）作为引物对扩增临床样本。
（1）PCR扩增反应
准备好3支PCR反应管，分别向其中加入临床阳性样品DNA和阴性对照样品，随后分别加入0.1μL Taq酶、0.8μL dNTPs（2.5mM）、1μL PCR buffer(10*PCR buffer)、0.6μL MgCl2(25μM)、0.1μL上游引物(100μM)和0.1μL下游引物(100μM)，用ddH2O补充至总体积10μL。将已经加好样的PCR管放置PCR仪上，设置PCR反应参数（见表1），进行扩增；反应结束后，用1%的琼脂糖凝胶进行鉴定，结果如图1，样品大小结果与预计大小相符，阴性结果正常。
表1PCR反应参数
Figure BDA0000484693990000071
（2）PCR产物的克隆转化
将（1）中所获得的PCR产物用试剂盒纯化后用DNA Ligation Kit的SolutionI与pMD18-T载体连接过夜，然后取10μL连接产物转化大肠杆菌，于LB固体培养板（含50μg/mL Amp）上，37℃倒置培养过夜。
取LB培养板上的阳性单克隆菌落，接种到LB液体培养基中扩增培养，进行测序鉴定，测序结果如图2，片段长度118bp，序列如SEQ ID NO：1所示。
将测序结果与NCBI数据库中Blast比对，结果如图3所示，显示其与白色念珠菌上的序列完全互补同源。
实施例2
本实施例以GAACCACCTCAAAATCATCCAACTAC（SEQ ID NO：4）和CTTGAGAAGACGAAGAAGCGGCAG（SEQ ID NO：5）作为引物对扩增临床样本。
采用实施例1的体系和程序进行PCR扩增，将PCR产物克隆转化并测序鉴定，片段长度118bp，序列如SEQ ID NO：1所示。
实施例3
本实施例以GAACCACCTCAAAATCATCC（SEQ ID NO：6）和CTTGAGAAGACGAAGAAG（SEQ ID NO：7）作为引物对扩增临床样本。
采用实施例1的体系和程序进行PCR扩增，将PCR产物克隆转化并测序鉴定，片段长度118bp，序列如SEQ ID NO：1所示。
实施例4
本实施例以CCACCTCAAAATCATCCAACTAC（SEQ ID NO：8）和GAGAAGACGAAGAAGCGGCAG（SEQ ID NO：9）作为引物对扩增临床样本。
采用实施例1的体系和程序进行PCR扩增，将PCR产物克隆转化并测序鉴定，片段长度112bp，序列如SEQ ID NO：10所示。
实施例5
本实施例以CCACCTCAAAATCATCCAAC（SEQ ID NO：11）和GAGAAGACGAAGAAGCGG（SEQ ID NO：12）作为引物对扩增临床样本。
采用实施例1的体系和程序进行PCR扩增，将PCR产物克隆转化并测序鉴定，片段长度112bp，序列如SEQ ID NO：10所示。
实施例6
本实施例以CCTCAAAATCATCCAACTACTAC（SEQ ID NO：13）和GACGAAGAAGCGGCAGCAGAAG（SEQ ID NO：14）作为引物对扩增临床样本。
采用实施例1的体系和程序进行PCR扩增，将PCR产物克隆转化并测序鉴定，片段长度104bp，序列如SEQ ID NO：15所示。
实施例7
本实施例以TCAAAATCATCCAACTACTACTC（SEQ ID NO：16）和GAAGAAGCGGCAGCAGAAGAAG（SEQ ID NO：17）作为引物对扩增临床样本。
采用实施例1的体系和程序进行PCR扩增，将PCR产物克隆转化并测序鉴定，片段长度99bp，序列如SEQ ID NO：18所示。
对比例1
本实施例以SAP基因上的一对引物CsapF：CTGCTGATATTACTGTTGGTTCC（SEQ ID NO：19）和CsapR：ACCACCAATACCAACGGTATC（SEQ ID NO：20）作为引物对扩增临床样本。
预期应该得到266bp的扩增产物，而实际结果未扩增到相应片段。
对比例2
本实施例以18S rDNA上的一对引物C18sF：TCCGTAGGTGAACCTGCG（SEQ ID NO：21）和C18sR：TCCTCCGCTTATTGATATGC（SEQ ID NO：22）作为引物对扩增临床样本。
预期应该得到257bp的扩增产物，而实际结果未扩增到相应片段。
对比例3
本实施例以ITS基因上的一对引物CitsF：AACTTGCTTTGGCGGTGGGG（SEQ ID NO：23）和CitsR：TGGACGTTACCGCCGCAAGCC（SEQ ID NO：24）作为引物对扩增临床样本。
预期应该得到386bp的扩增产物，而实际结果未扩增到相应片段。
对比例4
本实施例以Hwp1基因上的一对引物ChwpF：AGGGAGAGTTTTGGTAGGCTC（SEQ ID NO：25）和ChwpR：TCCCGGTTGTGAGCCATTAG（SEQ ID NO：26）作为引物对扩增临床样本。
预期应该得到113bp的扩增产物，而实际结果未扩增到相应片段。
对比例5
本实施例以mp58/pra1基因上的一对引物CmpF：AACATATTCAGCAAAGGCTACC（SEQ ID NO：27）和CmpR：GTGGTTGTGATGAGAGTGCG（SEQ ID NO：28）作为引物对扩增临床样本。
预期应该得到232bp的扩增产物，而实际结果未扩增到相应片段。
对比例6
本实施例以cht2基因上的一对引物CchtF：CCAACTAACCCCAAGTCATTCG（SEQ ID NO：29）和CchtR：GCAGAAGCAACATCGCTGAAAC（SEQ ID NO：30）作为引物对扩增临床样本。
预期应该得到480bp的扩增产物，而实际结果未扩增到相应片段。
对比例7
本实施例以ALS3基因上的一对引物CalsF：ACCACAACTGTAACTGCACC（SEQ ID NO：31）和CalsR：ACCAGGTGGAGCGGTAAT（SEQ ID NO：32）作为引物对扩增临床样本。
预期应该得到135bp的扩增产物，而实际结果未扩增到相应片段。
对比例8
本实施例以RBT1基因上的一对引物CrbtF：GCTGCCCTCGCTTACTACAT（SEQ ID NO：33）和CrbtR：GCATTTACACCAGCGCTTCC（SEQ ID NO：34）作为引物对扩增临床样本。
预期应该得到224bp的扩增产物，而实际结果未扩增到相应片段。
对比例1-8显示，白色念珠菌上序列的扩增存在一定难度，而本发明发现的序列SEQ ID NO：1易于扩增，高度保守，特异性高，适合作为检测白色念珠菌感染的靶标，本发明提供的针对SEQ ID NO：1的引物对能够成功扩增相应片段，实现白色念珠菌感染的检测。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细特征以及详细方法，但本发明并不局限于上述详细特征以及详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细特征以及详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明选用组分的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Figure IDA0000484694060000011
Figure IDA0000484694060000031
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Figure IDA0000484694060000051
Figure IDA0000484694060000071
Figure IDA0000484694060000081

Claims (10)

1.一种用于检测白色念珠菌的引物对，包括上游引物和下游引物，所述上游引物为SEQ ID NO：1上的一段序列，所述下游引物为SEQ ID NO：1的互补序列上的一段序列。
2.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述上游引物和下游引物的序列长度均为12-30个碱基。
3.根据权利要求1或2所述的引物对，其特征在于，所述上游引物的5’端起始于SEQ ID NO：1的第一个碱基；所述下游引物的5’端第一个碱基与SEQID NO：1的最后一个碱基互补。
4.根据权利要求1或2所述的引物对，其特征在于，所述上游引物和下游引物的PCR扩增产物的大小为80-118bp，优选90-118bp，更优选99-118bp。
5.根据权利要求1-4任一项所述的引物对，其特征在于，所述引物对的扩增产物为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：18。
6.根据权利要求1-5任一项所述的引物对，其特征在于，所述上游引物选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：16；所述下游引物选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：17。
7.根据权利要求1-6任一项所述的引物对，其特征在于，所述引物对选自下列任一项：
（a）所述上游引物为SEQ ID NO：2，所述下游引物为SEQ ID NO：3；
（b）所述上游引物为SEQ ID NO：4，所述下游引物为SEQ ID NO：5；
（c）所述上游引物为SEQ ID NO：6，所述下游引物为SEQ ID NO：7；
（d）所述上游引物为SEQ ID NO：8，所述下游引物为SEQ ID NO：9；
（e）所述上游引物为SEQ ID NO：11，所述下游引物为SEQ ID NO：12；
（f）所述上游引物为SEQ ID NO：13，所述下游引物为SEQ ID NO：14；
（g）所述上游引物为SEQ ID NO：16，所述下游引物为SEQ ID NO：17。
8.一种白色念珠菌的PCR检测试剂盒，包括权利要求1-7任一项所述的引物对。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，还包括PCR缓冲液、MgCl2溶液、dNTPs和Taq DNA聚合酶。
10.一种权利要求1-7任一项所述的引物对在作为白色念珠菌的PCR检测试剂盒的特异性引物或作为白色念珠菌的基因芯片探针序列中的应用。
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