CN103882130B - 一种检测结核分枝杆菌复合群的引物对及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测结核分枝杆菌复合群的引物对及其应用。本发明所提供的引物对具体为由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对。本发明还提供了利用所述引物对检测待测样本中是否含有结核分枝杆菌复合群的方法。本发明所提供的检测方法无需等待4-8周时间等待检测结果，省时；无需价格昂贵的大型仪器，也无需特殊的抗体或荧光试剂，只需普通的PCR仪及其试剂，即可进行实验；检测结果简单明了，易于判断；检测阳性率高。

Description

一种检测结核分枝杆菌复合群的引物对及其应用
技术领域
本发明属于医学检验领域，涉及一种检测结核分枝杆菌复合群的引物对及其应用。
背景技术
结核病是目前严重威胁人民身体健康的慢性传染病之一。世界卫生组织(WHO)曾将结核病与AIDS、疟疾一起列为人类的最主要杀手。由于抗结核药物的滥用以及艾滋病毒(HIV)等感染而使结核病的疫情再次回升。据WHO估算，全球大约有1/3人口已感染结核病，每年新发生肺结核患者约130万人，每年约有13万人死于结核病，每年近10万个多药耐药结核(MDR-TB)病例。但结核病只要早期诊断并合理用药，绝大多数的结核病是可以治愈的。我国作为人口大国，人口流动性较大，不易对结核病患者进行管理，容易造成肺结核病在人群中的传播。结核分枝杆菌复合群，包括结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、牛分枝杆菌(M.bovis)、非洲分枝杆菌(M.africanum)和田鼠分枝杆菌(M.microti)等，其中结核分枝杆菌是引起结核病的主要病因。早期快速、有效的诊断和治疗是结核病控制的关键。
目前临床检测结核分枝杆菌的主要方法是细菌学检测，包括痰涂片抗酸染色检查和细菌培养。痰涂片抗酸染色检查法是全世界最普遍使用的检测方法，它简便、快速、价廉，当天即可出结果，但敏感性低，阳性率在25％-35％。细菌培养法一直以来都是诊断结核的“金标准”，灵敏度略高于痰涂片抗酸染色法，但其培养周期长，一般4-8周才能获得结果。实验室研究的气相色谱法需要高精密度分析仪，分析过程的条件选择和质量控制都需严格要求。从1985年Mullis创建了聚合酶链式反应(PCR)技术，到1989年Hance等首先将该技术应用于检测分枝杆菌，再到1990年我国引进该项技术，从而开辟了以PCR为代表的分子生物学技术检测结核分枝杆菌阶段。由于PCR具有快速、灵敏、特异的优点，非常适合结核分枝杆菌这类生长缓慢细菌的快速诊断。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测结核分枝杆菌复合群的引物对及其应用。
本发明所提供的用于检测或辅助检测结核分枝杆菌复合群的引物对，具体为由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对。
进一步，组成所述引物对的两条单链DNA分子的摩尔比可为1：1。
本发明的另一个目的是提供一种用于检测或辅助检测结核分枝杆菌复合群的试剂盒。
本发明所提供的试剂盒具体可含有所述引物对、dNTP和DNA聚合酶。
制备所述引物对和所述试剂盒的方法也属于本发明的保护范围。
进一步，制备所述引物对的方法，具体可包括将组成所述引物对的两条单链DNA分子分别单独包装的步骤。
制备所述试剂盒的方法，具体可包括如下步骤：将组成所述引物对的两条单链DNA分子分别单独包装后，与如下物质包装于同一个试剂盒内：dNTP和DNA聚合酶。
所述引物对，或所述试剂盒在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：(1)在检测或辅助检测结核分枝杆菌复合群的非疾病诊断目的的应用；(2)在制备检测或辅助检测结核分枝杆菌复合群的产品中的应用。
本发明的又一个目的是提供一种利用所述引物对，或所述试剂盒检测待测样本中是否含有结核分枝杆菌复合群的非疾病诊断目的的方法。
本发明所提供的利用所述引物对，或所述试剂盒检测待测样本中是否含有结核分枝杆菌复合群的非疾病诊断目的的方法，具体可包括如下步骤：
(1)从待测样本中提取DNA作为模板，采用所述引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；
(2)根据步骤(1)所得PCR产物的大小，按照如下方法确定待测样本中是否含有结核分枝杆菌复合群：若PCR产物中含有大小为344bp的DNA片段，则所述待测样本中含有或候选含有结核分枝杆菌复合群；若PCR产物中不含有大小为344bp的DNA片段，则所述待测样本中不含有或候选不含有结核分枝杆菌复合群。
在所述方法的步骤(1)中，进行所述PCR扩增的反应条件具体为94℃5min；30个循环：94℃30sec、56℃30sec、72℃45sec；最终延伸72℃7min。
在所述方法的步骤(1)中，在进行所述PCR扩增的反应体系中，所述引物对中每条单链DNA分子的终浓度均为0.5μM。
进一步，进行所述PCR扩增的反应体系具体为2×Premix Taq 10μl，10μM的上下游引物各1μl(终浓度均为0.5μM)，DNA模板1μl，补双蒸水7μl至20μl体系。
其中，所述2×Premix Taq由TaKaRa Taq(1.25U/25μl)、dNTP Mixture(2×；各0.4mM)、Taq Buffer(2×；3mM Mg2+)、色素Marker、比重增加物和稳定剂组成。在本发明的一个实施例中，所述2×Premix Taq具体为宝生物工程(大连)有限公司产品，其产品目录号为RR901A。
在上述方法的步骤(1)中，进行所述PCR扩增时采用的退火温度具体可为56℃。
在实际应用中，判断所述PCR产物中是否含有大小为344bp的DNA片段，可通过将所述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳进行检测，若电泳结果显示有大小为344bp目的条带，则所述PCR产物中含有大小为344bp的DNA片段；反之，则不含有大小为344bp的DNA片段。
在所述方法中，所述大小为344bp的DNA片段的核苷酸序列为序列表中序列3所示。
在上述方法中，所述待测样本可为痰液样本。
在本发明中，以上所有的所述结核分枝杆菌复合群均具体可为如下中的至少一种：结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌和田鼠分枝杆菌。
在本发明的一个实施例中，所述结核分枝杆菌复合群具体为结核分枝杆菌标准菌株H37RV，或牛分枝杆菌菌株93006。
本发明与现有技术相比较，具有如下优点：无需等待4-8周时间等待检测结果，省时；无需价格昂贵的大型仪器，也无需特殊的抗体或荧光试剂，只需普通的PCR仪及其试剂，即可进行实验；检测结果简单明了，易于判断；检测阳性率高。
附图说明
图1为结核分枝杆菌标准菌株H37RV对本发明所提供的引物对(引物1和引物2)最佳退火温度的鉴定。其中，M：Trans 2K plus DNA Marker；1：退火温度50℃；2：退火温度52℃；3：退火温度54℃；4：退火温度56℃；5：退火温度58℃；N：阴性对照。
图2为供试菌株对本发明所提供的引物对(引物1和引物2)的特异性的鉴定。其中，M：Trans 2K plus DNA Marker；1：结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)标准菌株H37RV；2：牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)93006；3：堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii)ATCC 12478；4：阴性对照。
图3为采用本发明所提供的引物对(引物1和引物2)对30个临床确诊为结核病患者痰液样本的PCR检测结果。其中，M：Trans 2K plus DNA Marker；N为阴性对照；1-30：30个结核病患者的痰液样本。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii)ATCC 12478菌株：记载于“F Papa,MRiviere,J J Fournie,et al.Specificity of a Mycobacterium kansasii phenolic glycolipid(mycoside A)immunoserum.Journal of Clinical Microbiology,1987,2270-2273”一文中的“M.kansasii ATCC 12478”。
结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)标准菌株H37RV、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)93006：记载于“张媛媛，黄明翔，赵秀芹等.Spoligotyping结合多位点PCR用于牛分枝杆菌卡介苗的快速鉴定.中国人兽共患病学报，2011,27(8):712-720”一文。
实施例1、用于检测结核分枝杆菌复合群的引物对的设计及鉴定
一、用于检测结核分枝杆菌复合群的引物对的设计
本实施例针对结核分枝杆菌复合群的插入序列IS1081，设计如下引物1和引物2作为用于检测结核分枝杆菌复合群的特异性引物对。
引物1(序列1)：5’-CGGGTACTCGACGCTCTGA-3’(序列3的第1-19位)；
引物2(序列2)：5’-GTGTTGGTGGTTTGCTGCTT-3’(序列3的第325-344位的反向互补序列)。
理论上，扩增产物长度为序列表中序列3所示的344bp DNA片段。
二、反应条件的优化
供试菌株：属于结核分枝杆菌复合群的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)标准菌株H37RV。
本发明的发明人以供试菌株的基因组DNA为模板，采用步骤一设计的引物对在不同退火温度下进行PCR扩增，以确定最佳退火温度。
反应体系(20μl)：2×Premix Taq 10μl，10μM的上下游引物(引物1和引物2)各1μl(终浓度均为0.5μM)，DNA模板1μl，补双蒸水7μl至20μl体系。其中，2×PremixTaq为宝生物工程(大连)有限公司产品，其产品目录号为RR901A，具体由TaKaRa Taq(1.25U/25μl)、dNTP Mixture(2×；各0.4mM)、Taq Buffer(2×；3mM Mg2+)、色素Marker、比重增加物和稳定剂组成。
设置梯度PCR反应程序：预变性：94℃5min；变性：94℃30s，复性30s，延伸：72℃45s，循环次数：30次；最终延伸：72℃7min。复性时的退火温度设置为：50℃、52℃、54℃、56℃、58℃共5个梯度。
反应结束后，PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭(EB，终浓度为0.5μg/ml)染色，用凝胶呈像仪拍照并观察条带亮度。结果显示退火温度为56℃的目的条带(大小约为344bp)相对较亮(图1)，从而确定56℃为最佳退火温度。
三、用于检测结核分枝杆菌复合群的引物对的特异性鉴定
供试菌株：属于结核分枝杆菌复合群的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)标准菌株H37RV和牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)93006，以及不属于结核分枝杆菌复合群的堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii)ATCC 12478。
以供试菌株的基因组DNA为模板，采用步骤一设计的引物对进行PCR扩增。
反应体系(20μl)：同步骤二。
反应条件：94℃5min；30个循环：94℃30sec、56℃30sec、72℃45sec；最终延伸72℃7min。
实验同时设置以水替代模板的阴性对照。
实验重复三次。
反应结束后，采用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，在电压为100V条件下电泳40min。理论上，属于结核分枝杆菌复合群的结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)标准菌株H37RV和牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)93006的PCR产物在电泳结果上应显示大小为344bp(序列3)的目的条带；而不属于结核分枝杆菌复合群的堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii)ATCC 12478在电泳结果上应不显示大小为344bp(序列3)的目的条带。
结果如图2所示，从图中可以看出，属于结核分枝杆菌复合群的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)标准菌株H37RV和牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)93006的PCR产物均扩增出了大小为344bp的目的条带，进一步将目的条带测序，其序列正为序列表中序列3；而不属于结核分枝杆菌复合群的堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii)ATCC 12478的PCR产物未扩增出了大小为344bp的目的条带。以上结果与预期一致，证明本发明步骤一所设计的引物对特异性较强。
四、检测待测样本中是否含有结核分枝杆菌复合群的方法
根据以上步骤三的结果，总结得到检测待测样本中是否含有结核分枝杆菌复合群的方法，具体可包括如下步骤：
(1)从待测样本中提取DNA作为模板，采用所述引物对进行PCR扩增(退火温度56℃)，得到PCR产物；
(2)根据步骤(1)所得PCR产物的大小，按照如下方法确定待测样本中是否含有结核分枝杆菌复合群：若PCR产物中含有大小为344bp的DNA片段(序列3)，则所述待测样本中含有或候选含有结核分枝杆菌复合群；若PCR产物中不含有大小为344bp的DNA片段(序列3)，则所述待测样本中不含有或候选不含有结核分枝杆菌复合群。
实施例2、用于检测结核分枝杆菌复合群的引物对进行临床样本检测
待测样本：30个临床上通过影像学、痰涂片以及细菌培养结果综合确诊为结核病患者的痰液样本。
一、从待测样本中提取DNA
(1)挑取约1～3ml痰液于50ml无菌有盖离心管中，加等体积(或根据痰液浓稀程度酌情调整)NALC-NaOH消化液(简单处理可以用NaOH水溶液处理。如果需要过夜处理就用NALC-NaOH消化液。只提取DNA时可以直接用简单法。)。
其中，NALC-NaOH消化液的配方如下：50ml浓度为6％(6g/100ml)氢氧化钠的水溶液、50ml浓度为2.94％(2.94g/100ml)柠檬酸钠的水溶液、0.5g N-乙酰-L半胱氨酸。临用前新鲜配制。
(2)漩涡振荡，打散痰液，室温孵育15min；
(3)加PBS缓冲液(pH6.8)至45ml，4000g离心15min，弃去上清夜；
(4)向沉淀的痰菌样品加溶菌酶至终浓度为20mg/ml，37℃孵育过夜；加蛋白酶K至终浓度为100mg/ml，56℃孵育1h。然后采用QIAamp DNA minikit试剂盒提取基因组DNA，作为检测时PCR扩增的模板。
二、PCR扩增
以步骤一从待测样本中提取的DNA为模板，采用实施例1步骤一设计的引物对(引物1和引物2)进行PCR扩增。具体的反应体系和反应条件同实施例1步骤二。实验同时设置以双蒸水为模板作为阴性对照。实验重复三次。
反应结束后，采用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，在电压为100V条件下电泳40min。根据电泳结果，按照实施例1中步骤三的方法确定待测样本中是否含有结核分枝杆菌复合群。
结果如图3所示，从图中可以看出，利用本发明的引物对(引物1和引物2)对30个临床确诊结核患者痰液样本进行检测，均扩增得到大小为344bp的目的条带，将这些条带回收后送样测序，其序列均为序列表中序列3所示。以上结果表明，采用本发明的引物对(引物1和引物2)对结核分枝杆菌复合群进行检测，其准确率与临床采用的细菌培养法相当，但大大缩短的检测时间，且花费少，利用标准的PCR试剂和仪器便可达到高通量检测的目的。

Claims (13)

1.用于检测或辅助检测结核分枝杆菌复合群的引物对，其特征在于：所述引物对为由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对。
2.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于：组成所述引物对的两条单链DNA分子的摩尔比为1：1。
3.用于检测或辅助检测结核分枝杆菌复合群的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有权利要求1或2所述的引物对、dNTP和DNA聚合酶。
4.制备权利要求1或2所述引物对的方法，包括将组成所述引物对的两条单链DNA分子分别单独包装的步骤。
5.制备权利要求3所述试剂盒的方法，包括如下步骤：将组成所述引物对的两条单链DNA分子分别单独包装后，与如下物质包装于同一个试剂盒内：dNTP和DNA聚合酶。
6.权利要求1或2所述引物对在检测或辅助检测结核分枝杆菌复合群的非疾病诊断目的的应用。
7.权利要求1或2所述引物对在制备检测或辅助检测结核分枝杆菌复合群的产品中的应用。
8.权利要求3所述的试剂盒在检测或辅助检测结核分枝杆菌复合群的非疾病诊断目的的应用。
9.权利要求3所述的试剂盒在制备检测或辅助检测结核分枝杆菌复合群的产品中的应用。
10.利用权利要求1或2所述引物对检测待测样本中是否含有结核分枝杆菌复合群的非疾病诊断目的的方法，包括如下步骤：
(1)从待测样本中提取DNA作为模板，采用权利要求1或2所述的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；
(2)根据步骤(1)所得PCR产物的大小，按照如下方法确定待测样本中是否含有结核分枝杆菌复合群：若PCR产物中含有大小为344bp的DNA片段，则所述待测样本中含有或候选含有结核分枝杆菌复合群；若PCR产物中不含有大小为344bp的DNA片段，则所述待测样本中不含有或候选不含有结核分枝杆菌复合群。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：在步骤(1)中，进行所述PCR扩增时采用的退火温度为56℃。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其特征在于：所述大小为344bp的DNA片段的核苷酸序列为序列表中序列3所示。
13.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：所述结核分枝杆菌复合群为如下中的至少一种：结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌和田鼠分枝杆菌。
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