CN103866003A - 甘肃高山细毛羊生长速度相关性基因adrb3的pcr-sscp检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

甘肃高山细毛羊生长速度相关性基因adrb3的pcr-sscp检测试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及动物生物技术领域中的绵羊生长速度的分子标记辅助育种技术，具体涉及到甘肃高山细毛羊生长速度相关基因等位基因检测试剂盒。一种甘肃高山细毛羊生长速度相关基因ADRB3的PCR-SSCP检测试剂盒，其特征是包括有PCR反应液，ADRB3*A和ADRB3*D的DNA标准样；SSCP检测试剂，去离子水，10%过硫酸铵，上样变性缓冲液，TEMED，12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶Arc:Bis=37.5:1；所述的上样变性缓冲液，包括98%去离子甲酰胺，0.025%溴酚蓝，0.025%二甲苯青，10mmol/L EDTA pH8.0。本发明的优点是本发明对甘肃高山细毛羊的分子标记选种具有快速、敏感性高、成本低等特点。

Description

甘肃高山细毛羊生长速度相关性基因ADRB3的PCR-SSCP检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及动物生物技术领域中的绵羊分子标记辅助育种技术，具体涉及到绵羊生长速度的相关基因检测试剂盒及其检测方法。 
背景技术
β3-肾上腺素能受体抗体基因（β3-adrenergic receptor gene,ADRB3）的突变影响动物机体的产热机能。Slee等（1987）和Evans等（1999）发现，小鼠（Mus musculus）ADRB3基因内有两个不同的选择性剪切位点，可调控与ADRB3基因相关的代谢功能。Susulic等(1995)用基因敲除技术对ADRB3基因与动物产热关系进行研究，结果表明，敲除ADRB3基因的动物机体表现极差的冷应激反应。 
目前对ADRB3基因的研究主要集中在人类（Homo sapiens）。人类ADRB3基因编码的蛋白质序列第64号位点存在1个Trp64Arg突变，而Trp64Arg突变可降低脂肪分解酶的活性，进而减少脂肪分解（Umekawa et al.,1999）。还发现Trp64Arg的多态性还与肥胖、2-型糖尿病、高血压等病症有密切关系（Shihara et al.,1999;Ringel et al.,2000）。绵羊育种实践中发现，不同气候条件下，不同绵羊类群具有不同的耐寒性，其ADRB3基因型也有所不同(杨果,2008)。因此，通过研究动物ADRB3基因的多态性进而阐述突变位点对机体产热性能的可能遗传学基础。 
对绵羊ADRB3基因的研究已有报道。绵羊ADRB3基因部分内含子区域有较丰富的多态性（Luo et al.,2008;武建亮等，2010)，且其多态性与绵羊的初生重、生长率、屠宰重和耐寒性相关(Byunet al.,2008；Forrest et al.,2003)。Forrest等（2007）发现新西兰绵羊ADRB3基因多态性与羊毛平均纤维强度、产量和羔羊死亡率相关。Horrell等（2009）发现新西兰罗姆尼羊ADRB3基因多态性与其初生重具有显著相关性（P<0.05），与断奶前生长速度有极显著相关性（P<0.01）。 
目前ADRB3基因已成为绵羊生长性状的候选基因而被国内外广泛研究，并在分子遗传育种标记方面加以应用。绵羊生长速度相关基因分子选种技术主要利用PCR-SSCP技术对 待测绵羊的ADRB3基因第2内含子进行多态性分析，然后根据检测结果确定携带不同等位基因的绵羊生长速度的强弱，从而判断是否可以留作种用。 
发明内容
本发明的目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种甘肃高山细毛羊生长速度相关性基因ADRB3 PCR-SSCP检测试剂盒。以解决快速、敏感性高、成本低，用于甘肃高山细毛羊生长速度相关基因分子选种技术。 
通过PCR-SSCP对甘肃高山细毛羊ADRB3基因第2内含子进行遗传多态性分析，测序群体内变异产生的各等位基因序列，结合生产性能相关的生产数据，确定控制生长速度的等位基因，为改善甘肃高山细毛羊生产性能提供指导。 
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种甘肃高山细毛羊生长速度相关性基因ADRB3的PCR-SSCP检测试剂盒，其主要特点是包括有PCR反应液，ADRB3*A和ADRB3*D的DNA标准样；去离子水，10%过硫酸铵，上样变性缓冲液，TEMED，12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶Arc:Bis=37.5:1； 
所述的上样变性缓冲液，包括98%去离子甲酰胺，0.025%溴酚蓝，0.025%二甲苯青，10mmol/L EDTA pH8.0； 
所述的PCR反应液的反应液：总体积20μL，其中10×buffer缓冲液为2.0μL，Mg2+浓度为2.5mM，dNTPs的终浓度为100μM，引物ADRB3-F:5’CTAGCTCAGTTCTTTCTCTGC3'和ADRB3-R:5’CCCAACTCCAACCCGACC3'各0.1μM，Taq聚合酶0.5U，ddH2O补充体积至20μL。 
所述的ADRB3*A的DNA标准样的核苷酸序列为： 
Figure BDA0000458360370000021
所述的ADRB3*D的DNA标准样的核苷酸序列为： 
Figure BDA0000458360370000022
Figure BDA0000458360370000031
所述的甘肃高山细毛羊生长速度相关性基因ADRB3的PCR-SSCP检测试剂盒的使用方法，其步骤为： 
（1）待检甘肃高山细毛羊基因组DNA1μL/50ng与试剂盒中PCR扩增液混合，反应条件：预变性94℃3min，变性94℃30s，退火62℃30s，延伸72℃30s，共35个循环，最后延伸72℃10min； 
（2）用步骤（1）中扩增的PCR产物和ADRB3*A或ADRB3*D的DNA标准样与试剂盒中SSCP检测试剂各组分混合进行SSCP检测； 
（3）步骤（2）中检测到的带型与ADRB3*A或ADRB3*D标准样带型一致的样品为携带控制甘肃高山细毛羊生长速度等位基因的个体。 
一种甘肃高山细毛羊生长速度相关性基因ADRB3的PCR-SSCP检测方法，其主要特点在于检测步骤为： 
（1）样品采集：甘肃高山细毛羊颈静脉采血10ml,ACD抗凝，-20℃冻存； 
（2）基因组DNA的提取：用常规的酚-氯仿抽提法从冻存血样中提取基因组DNA； 
（3）聚合酶链式反应： 
PCR反应体系：总体积20μL，其中10×buffer缓冲液为2.0μL，Mg2+浓度为2.5mM，dNTPs的终浓度为100μM，引物ADRB3-F和ADRB3-R各0.1μM，Taq聚合酶0.5U，模板DNA50ng，ddH2O补充体积至20μL；反应条件：预变性94℃3min，变性94℃30s，退火62℃30s，延伸72℃30s，共35个循环，最后延伸72℃10min； 
引用引物序列为： 
ADRB3-F:5’CTAGCTCAGTTCTTTCTCTGC3'； 
ADRB3-R:5’CCCAACTCCAACCCGACC3'。 
（4）PCR产物的SSCP检测： 
取2μl的PCR产物加入8μl的上样变性缓冲液，包括98%去离子甲酰胺、0.025%溴酚蓝、0.025%二甲苯青、10mmol/L EDTA pH8.0，98℃变性10min，立即冰浴10min；12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶，200V电压条件下，18℃电泳20h，银染法显色后拍照； 
（5）结果判断： 
对甘肃高山细毛羊ADRB3基因第2内含子的PCR-SSCP检测，有5个等位基因，控制甘肃高山细毛羊生长速度的等位基因为ADRB3*A核苷酸和ADRB3*D核苷酸；对甘肃高山细毛羊生长速度无影响的为ADRB3*B核苷酸或ADRB3*C核苷酸或ADRB3*E 核苷酸 
控制甘肃高山细毛羊生长速度的等位基因为ADRB3*A的核苷酸序列为：ctagctcagttctttctctgcccaaaattcttaccatcacgcgagctggctttgacttgccgagactagagggcaaccccccattccctgccccaccccatccccgcgccagtccccaagccttcgggctcagttctggtttctttggaaagtctgatagccccgaaggtgaggattcgcttccggaatgaaggctagcagggctgaggaagctgtgagtgcgaattcttcctcagtaggaagcgggtcgggttggagttggg； 
ADRB3*D核苷酸序列为：ctagctcagttctttctctgcccaaaattcttaccatcacgcgagctggctttgacttgccgagactagagggcaaccccccatcccctgccccaccccatccccgcgccagtccccaagccttcgggctcagttctggtttctttggaaagtctgatagccccgaaggtgaggattcgcttccggaatgaaggctagccgggctgaggaagctgcgagtgcgaattcttcctcagtaggaagcgggtcgggttggagttggg； 
对甘肃高山细毛羊生长速度无影响的ADRB3*B核苷酸序列为：ctagctcagttctttctctgcccaaaattcttaccatcacgcgagctggctttgacttgccgagactagagggcaaccccccattccctgccccaccccatccccgcgccagtccccaagccttcgggctcagttctggtttctttggaaagtctgatagccccgaaggtgaggattcgcttccggaatgaaggctagcagggctgaggaagctgcgagtgcgaattcttccccagtaggaagcgggtcgggttggagttggg； 
ADRB3*C核苷酸序列为：ctagctcagttctttctctgcccaaaattcttaccatcacgcgagctggctttgacttgccgagactagagggcaaccccccattccctgccccaccccatccccgcgccagtccccaagccttcgggctcagttctggtttctttggaaagtctgatagccccgaaggtgaggattcgcttccggaatgaaggctagcggggctgaggaagctgcgagtgcgaattcttccccagtaggaagcgggtcgggttggagttggg； 
ADRB3*E核苷酸序列为：ctagctcagttctttctctgcccaaaattcttaccatcacgcgagctggctttgacttgccgagactagagggcaaccccccattccctgtcccaccccatccccgcgccagtccccaagccttcgggctcagttctggtttctttggaaagtctgatagccccgaaggtgaggattcgcttccggaatgaaggctagcggggctgaggaagctgcgagtgcgaattcttccccagtaggaagcgggtcgggttggagttggg。 
本发明的有益效果：反应灵敏、特异性强、易操作，适用于各级畜牧兽医教学科研单位，兽用生物制品厂以及各大、中型绵羊养殖企业的生产性能的改良。 
本发明利用PCR-SSCP对甘肃高山细毛羊ADRB3基因第2内含子进行遗传多态性分析，并克隆、测序群体内变异产生的各等位基因序列，结合生长速度相关的生产数据，确定生长较快的等位基因，为改善绵羊生产性能提供指导。本发明通过对试验甘肃高山细毛羊ADRB3基因第2内含子的SSCP分析，发现了5个（A、B、C、D和E）等位基因。其中，A和D等位基因对甘肃高山细毛羊生长速度影响较显著。 
本发明对甘肃高山细毛羊的分子标记选种具有快速、敏感性高、成本低等特点。 
附图说明：
图1是甘肃高山细毛羊ADRB3基因第2内含子的PCR-SSCP检测凝胶图。 
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下面以甘肃高山细毛羊生产性能分子选种技术的建立为例，对本发明的内容进行详细的说明。 
实施例1：一种甘肃高山细毛羊生长速度相关性基因ADRB3PCR-SSCP检测试剂盒，包括有PCR反应液，ADRB3*A和ADRB3*D的DNA标准样；去离子水，10%过硫酸铵，上样变性缓冲液，TEMED，12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶Arc:Bis=37.5:1； 
所述的上样变性缓冲液，包括98%去离子甲酰胺，0.025%溴酚蓝，0.025%二甲苯青，10mmol/L EDTA pH8.0； 
所述的PCR反应液的反应液：总体积20μL，其中10×buffer缓冲液为2.0μL，Mg2+浓度为2.5mM，dNTPs的终浓度为100μM，引物ADRB3-F:5’CTAGCTCAGTTCTTTCTCTGC3'和ADRB3-R:5’CCCAACTCCAACCCGACC3'各0.1μM，Taq聚合酶0.5U，ddH2O补充体积至20μL。 
所述的ADRB3*A的DNA标准样的核苷酸序列为： 
Figure BDA0000458360370000051
所述的ADRB3*D的DNA标准样的核苷酸序列为： 
实施例2：一种甘肃高山细毛羊生长速度相关性基因ADRB3PCR-SSCP检测试剂盒的使用方法，其步骤为： 
（1）待检甘肃高山细毛羊基因组DNA1μL/50ng与试剂盒中PCR扩增液混合，反应条件：预变性94℃3min，变性94℃30s，退火62℃30s，延伸72℃30s，共35个循环，最后延伸72℃10min； 
（2）用步骤（1）中扩增的PCR产物和ADRB3*A或ADRB3*D的DNA标准样与试剂盒中SSCP检测试剂各组分混合进行SSCP检测； 
（3）步骤（2）中检测到的带型与ADRB3*A或ADRB3*D标准样带型一致的样品为携带控制甘肃高山细毛羊生长速度等位基因的个体。 
实施例3：一种甘肃高山细毛羊生长速度相关性基因ADRB3PCR-SSCP检测方法，其特征在于检测步骤为： 
（1）样品采集：甘肃高山细毛羊颈静脉采血10ml,ACD抗凝，-20℃冻存； 
（2）基因组DNA的提取：用常规的酚-氯仿抽提法从冻存血样中提取基因组DNA； 
（3）聚合酶链式反应： 
PCR反应体系：总体积20μL，其中10×buffer缓冲液为2.0μL，Mg2+浓度为2.5mM，dNTPs的终浓度为100μM，引物ADRB3-F和ADRB3-R各0.1μM，Taq聚合酶0.5U，模板DNA50ng，ddH2O补充体积至20μL；反应条件：预变性94℃3min，变性94℃30s，退火62℃30s，延伸72℃30s，共35个循环，最后延伸72℃10min； 
引用引物序列为： 
ADRB3-F:5’CTAGCTCAGTTCTTTCTCTGC3'； 
ADRB3-R:5’CCCAACTCCAACCCGACC3'； 
（4）PCR产物的SSCP检测： 
取2μl的PCR产物加入8μl的上样变性缓冲液，包括98%去离子甲酰胺、0.025%溴酚蓝、0.025%二甲苯青、10mmol/L EDTA pH8.0，98℃变性10min，立即冰浴10min；12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶，200V电压条件下，18℃电泳20h，银染法显色后拍照； 
（5）结果判断： 
对甘肃高山细毛羊ADRB3基因第2内含子的PCR-SSCP检测，有5个等位基因，控制甘肃高山细毛羊生长速度的等位基因为ADRB3*A核苷酸和ADRB3*D核苷酸；对甘肃高山细毛羊生长速度无影响的为ADRB3*B核苷酸或ADRB3*C核苷酸或ADRB3*E核苷酸 
控制甘肃高山细毛羊生长速度的等位基因为ADRB3*A的核苷酸序列为：ctagctcagttctttctctgcccaaaattcttaccatcacgcgagctggctttgacttgccgagactagagggcaaccccccattccctgccc caccccatccccgcgccagtccccaagccttcgggctcagttctggtttctttggaaagtctgatagccccgaaggtgaggattcgcttccggaatgaaggctagcagggctgaggaagctgtgagtgcgaattcttcctcagtaggaagcgggtcgggttggagttggg； 
ADRB3*D核苷酸序列为：ctagctcagttctttctctgcccaaaattcttaccatcacgcgagctggctttgacttgccgagactagagggcaaccccccatcccctgccccaccccatccccgcgccagtccccaagccttcgggctcagttctggtttctttggaaagtctgatagccccgaaggtgaggattcgcttccggaatgaaggctagccgggctgaggaagctgcgagtgcgaattcttcctcagtaggaagcgggtcgggttggagttggg； 
对甘肃高山细毛羊生长速度无影响的ADRB3*B核苷酸序列为：ctagctcagttctttctctgcccaaaattcttaccatcacgcgagctggctttgacttgccgagactagagggcaaccccccattccctgccccaccccatccccgcgccagtccccaagccttcgggctcagttctggtttctttggaaagtctgatagccccgaaggtgaggattcgcttccggaatgaaggctagcagggctgaggaagctgcgagtgcgaattcttccccagtaggaagcgggtcgggttggagttggg； 
ADRB3*C核苷酸序列为：ctagctcagttctttctctgcccaaaattcttaccatcacgcgagctggctttgacttgccgagactagagggcaaccccccattccctgccccaccccatccccgcgccagtccccaagccttcgggctcagttctggtttctttggaaagtctgatagccccgaaggtgaggattcgcttccggaatgaaggctagcggggctgaggaagctgcgagtgcgaattcttccccagtaggaagcgggtcgggttggagttggg； 
ADRB3*E核苷酸序列为：ctagctcagttctttctctgcccaaaattcttaccatcacgcgagctggctttgacttgccgagactagagggcaaccccccattccctgtcccaccccatccccgcgccagtccccaagccttcgggctcagttctggtttctttggaaagtctgatagccccgaaggtgaggattcgcttccggaatgaaggctagcggggctgaggaagctgcgagtgcgaattcttccccagtaggaagcgggtcgggttggagttggg。 
实验例1： 
试验材料 
315只甘肃高山细毛羊(Ovis aries)血样均采自甘肃省天祝藏族自治县松山镇同一牧民羊群，属于同一族群。每只绵羊颈静脉采血10mL，加入装有1mL抗凝剂酸性柠檬酸葡萄糖(acid citrate dextrose，ACD)的采样管中，再将采样管置于冰盒中临时保存，实验室-20℃冻存。 
所有采集血样的羊只均为已标注耳号，并进行了跟踪观测记录的羊只，其中初生重是在羔羊吮初乳前称重，其他月龄体重均在距相同时间间隔、早晨空腹时称量的体重。 
试验方法 
1.引物设计和PCR扩增 
根据GenBank已公布绵羊β3-肾上腺素能受体抗体基因（ADRB3）内含子序列（登录号：DQ269497），应用Primer5.0在线设计特异性引物，对该基因一段长为263bp的内 含子进行扩增。引物序列为：上游5-CTAGCTCAGTTCTTTCTCTGC-3；下游5-CCCAACTCCAACCCGACC-3，由宝生物（大连）工程有限公司合成。 
最佳反应体系及条件： 
PCR反应体系：总体积20μL，其中10×buffer缓冲液为2.0μL，Mg2+浓度为2.5mM，dNTPs的终浓度为100μM，引物ADRB3-F和ADRB3-R各0.1μM，Taq聚合酶0.5U，基因组DNA模板1.0μL，ddH2O补充体积至20μL； 
PCR反应条件：94℃预变性3min，35个循环（94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s），72℃延伸10min，4℃保存。PCR扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。 
引用引物序列为： 
ADRB3-F:5’CTAGCTCAGTTCTTTCTCTGC3'； 
ADRB3-R:5’CCCAACTCCAACCCGACC3'。 
得到263bp的特异性扩增产物，可直接进行SSCP检测。 
2.SSCP检测 
取步骤1中2μl的PCR产物加入8μl的上样变性缓冲液[包括98%去离子甲酰胺、0.025%溴酚蓝、0.025%二甲苯青、10mmol/L EDTA(pH8.0)]，98℃变性10min，立即冰浴10min。12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶（Arc:Bis=37.5:1）200V电压条件下，18℃电泳20h，银染法显色后拍照。其中，对PCR扩增产物进行SSCP检测，结果在所检测的315只甘肃高山细毛羊中检测到5个等位基因，分别命名为ADRB3*A、*B、*C、*D和*E。 
甘肃高山细毛羊的ADRB3*A的DNA标准样的核苷酸序列为： 
Figure BDA0000458360370000081
所述的ADRB3*D的DNA标准样的核苷酸序列为： 
Figure BDA0000458360370000082
3.基因测序 
根据SSCP胶图分析结果，选取不同基因型的个体，纯合子进行PCR扩增，检测后直接测序；对所检测到的等位基因只存在于杂合子个体中PCR产物，进行克隆纯化后测序。基因由北京六合华大基因公司测定。测定结果通过MegAlign软件与GenBank序列进行比对。 
4.数据分析 
根据实验结果计算ADRB3基因的基因频率与基因型频率，根据最小二乘线性模型，用SPSS20.0软件对不同基因型、等位基因与生长发育性状（初生重、一月龄体重、二月龄体重、三月龄体重、断奶重、日增重）进行相关性分析。 
统计模型如下（结果见表2）： 
Yij=μ+Allelei+Genderj+Allelei×Genderj+eij
Yij=μ+Genotypei+Genderj+Genotypei×Genderj+eij
其中Yij为性状表型值，μ为同一群体均值；Genotypei为基因型效应；Genderj为性别效应；Allelei为等位基因效应；Genotypei×错误!未找到引用源。Genderj为基因型与性别互作效应；Allelei×Genderj为等位基因与性别互作效应；eij为随机误差。 
5.甘肃高山细毛羊ADRB3基因第2内含子等位基因频率及生长速度的相关性分析 
表1甘肃高山细毛羊ADRB3基因第2内含子等位基因频率 
Figure 2014100242439100002DEST_PATH_IMAGE001
表2甘肃高山细毛羊ADRB3基因第2内含子各等位基因与生长速度的关联性 
Figure BDA0000458360370000092
注：（P<0.01）表示差异极显著；（P<0.05）表示差异显著。 
5.结果分析 
甘肃高山细毛羊ADRB3基因内含子区等位基因与生长速度的相关性分析结果见表2。结果表明，存在等位基因A的个体体重显著高于缺失等位基因A的个体，等位基因A的存在/缺失与平均日增重关联性显著（P<0.05）；初生重以及2月龄时，存在等位基因D的个体均显著高于缺失的个体，等位基因D与初生重、2月龄体重显著相关（P<0.05）。因此，可认为选留携带等位基因A和D的纯合个体可改善甘肃高山细毛羊种群的生长性能。 
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。 
Figure BDA0000458360370000121
Figure BDA0000458360370000131

Claims (3)

1.一种甘肃高山细毛羊生长速度相关性基因ADRB3的PCR-SSCP检测试剂盒，其特征是包括有PCR反应液，ADRB3*A和ADRB3*D的DNA标准样；去离子水，10%过硫酸铵，上样变性缓冲液，TEMED，12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶Arc:Bis=37.5:1；
所述的上样变性缓冲液，包括98%去离子甲酰胺，0.025%溴酚蓝，0.025%二甲苯青，10mmol/L EDTA pH8.0；
所述的PCR反应液的反应液：总体积20μL，其中10×buffer缓冲液为2.0μL，Mg2 +浓度为2.5mM，dNTPs的终浓度为100μM，引物ADRB3-F:5’CTAGCTCAGTTCTTTCTCTGC3'和ADRB3-R:5’CCCAACTCCAACCCGACC3'各0.1μM，Taq聚合酶0.5U，ddH2O补充体积至20μL。
2.如权利要求1所述的甘肃高山细毛羊生长速度相关性基因ADRB3的PCR-SSCP检测试剂盒的使用方法，其特征在于步骤为：
（1）待检甘肃高山细毛羊基因组DNA1μL/50ng与试剂盒中PCR扩增液混合，反应条件：预变性94℃3min，变性94℃30s，退火62℃30s，延伸72℃30s，共35个循环，最后延伸72℃10min；
（2）用步骤（1）中扩增的PCR产物和ADRB3*A或ADRB3*D的DNA标准样与试剂盒中SSCP检测试剂各组分混合进行SSCP检测；
（3）步骤（2）中检测到的带型与ADRB3*A或ADRB3*D标准样带型一致的样品为携带控制甘肃高山细毛羊生长速度等位基因的个体。
3.一种甘肃高山细毛羊生长速度相关性基因ADRB3的PCR-SSCP检测方法，其特征在于检测步骤为：
（1）样品采集：甘肃高山细毛羊颈静脉采血10ml，ACD抗凝，-20℃冻存；
（2）基因组DNA的提取：用常规的酚-氯仿抽提法从冻存血样中提取基因组DNA；
（3）聚合酶链式反应：
PCR反应体系：总体积20μL，其中10×buffer缓冲液为2.0μL，Mg2+浓度为2.5mM，dNTPs的终浓度为100μM，引物ADRB3-F和ADRB3-R各0.1μM，Taq聚合酶0.5U，模板DNA50ng，ddH2O补充体积至20μL；反应条件：预变性94℃3min，变性94℃30s，退火62℃30s，延伸72℃30s，共35个循环，最后延伸72℃10min；
引用引物序列为：
ADRB3-F:5’CTAGCTCAGTTCTTTCTCTGC3'；
ADRB3-R:5’CCCAACTCCAACCCGACC3'；
（4）PCR产物的SSCP检测：
取2μl的PCR产物加入8μl的上样变性缓冲液，包括98%去离子甲酰胺、0.025%溴酚蓝、0.025%二甲苯青、10mmol/L EDTA pH8.0，98℃变性10min，立即冰浴10min；12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶，200V电压条件下，18℃电泳20h，银染法显色后拍照；
（5）结果判断：
对甘肃高山细毛羊ADRB3基因第2内含子的PCR-SSCP检测，有5个等位基因，控制甘肃高山细毛羊生长速度的等位基因为ADRB3*A核苷酸和ADRB3*D核苷酸；对甘肃高山细毛羊生长速度无影响的为ADRB3*B核苷酸或ADRB3*C核苷酸或ADRB3*E核苷酸。
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