CN103833822B

CN103833822B - 6-酮-22-甲氧基呋甾烷类甾体皂苷及其应用

Info

Publication number: CN103833822B
Application number: CN201410040834.5A
Authority: CN
Inventors: 张存莉; 韩清芳; 许静; 王�琦; 刘晓丽; 巩文秀; 曹莹莉
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2014-01-28
Filing date: 2014-01-28
Publication date: 2015-07-29
Anticipated expiration: 2034-01-28
Also published as: CN103833822A

Abstract

本发明涉及6-酮-22-甲氧基呋甾烷类甾体皂苷及其应用。所涉及的化合物结构式如式（Ⅰ）所示。所涉及的应用是关于上述化合物用于制备植物生长剂的应用。该化合物具有促进植物生长、提高作物产量和品质及增强植物抗性的活性；且该化合物具有高效、安全无毒的特点；同时其原料资源丰富、可再生；提取分离技术难度小，溶剂可回收使用，生产成本低；不会对生态环境造成不利影响。其中或R₁=H。

Description

6-酮-22-甲氧基呋甾烷类甾体皂苷及其应用

技术领域

本发明涉及一种天然的呋甾烷酮类化合物及其应用，具体涉及6-酮-22-甲氧基呋甾烷类甾体皂苷及其应用。

背景技术

甾体皂苷(Steroid saponins)是一类以甾体为母核与糖链结合的寡糖苷，其水溶液振摇后能够产生持久性肥皂液样的泡沫。薯蓣科、百合科、菝葜科、龙舌兰科、石蒜科、茄科、棕榈科等植物中富含甾体皂苷类化合物，过去主要用于合成抗炎药、避孕药和激素类药物。目前研究发现，甾体皂苷类化合物还具有抗肿瘤、抗真菌、降血糖、调节免疫、防治心血管疾病等生理活性，并且有些已作为药物制剂应用于临床治疗中。

甾体皂苷的母核结构有27个碳原子，含有A、B、C、D、E和F6个环，根据螺甾烷结构中F环的结合状态不同，甾体皂苷元可分为螺甾烷醇型、异螺甾烷醇型、呋甾烷醇型、变形呋甾烷醇型四种结构类型。

黑刺菝葜(Smilax scobinicaulis C.H.Wright)为百合科菝葜属植物，又名短梗菝葜，在我国资源丰富、野生量较大，其根茎可以入药，做威灵仙和金刚刺入药已有多

年历史，临床用于治疗风湿性腰腿病、小儿惊风、肠炎、疮疖、癌肿等病症。研究发现，其根茎中含有丰富的甾体皂苷。

BRs是油菜素内酯及其结构上相似的具有生物活性的天然甾醇类物质的统称，在植物界分布广泛，目前已有近70种BRs物质被发现。BRs能显著提高作物的产量、品质和抗逆活性，是国际上公认为活性最高的高效、广谱、无毒的植物生长激素，在农业生产上具有广阔的应用前景。但是其在植物中的含量极低，在植物地上部分的含量为10ng/kg-100μg/kg(鲜重)，而且提取分离十分困难。目前可以用于农业生产上的主要是表油菜素内酯(24-epibrassinolide)，但是其合成技术难度大，工艺路线复杂，生产成本高，价格昂贵的(5mg价值$90)，严重的制约了在农业上的应用和发展。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种6-酮-22-甲氧基呋甾烷类甾体皂苷。

为此，本发明提供的6-酮-22-甲氧基呋甾烷类甾体皂苷的结构式如式(Ⅰ)所示：

其中或R₁＝H。

本发明的目的之二是提供上述化合物用于制备植物生长剂的应用。

本发明提供的6-酮-22-甲氧基呋甾烷类甾体皂苷化合物具有促进植物生长、提高作物产量和品质及增强植物抗性的活性；且该化合物具有高效、安全无毒的特点，同时其原料资源丰富、可再生；提取分离技术难度小，溶剂可回收使用，生产成本低；不会对生态环境造成不利影响。

附图说明

图1为化合物1的1H NMR谱；

图2为化合物1的13C NMR谱；

图3为化合物1的DEPT谱；

图4为化合物1的COSY谱；

图5为化合物1的HSQC谱；

图6为化合物1的HMBC谱；

图7为化合物1的NOESY谱；

图8为化合物1的HR-ESI-MS谱；

图9为化合物1的IR谱；

图10为化合物2的1H NMR谱；

图11为化合物2的13C NMR谱；

图12为化合物2的DEPT谱；

图13为化合物2的COSY谱；

图14为化合物2的HSQC谱；

图15为化合物2的HMBC谱；

图16为化合物2的NOESY谱；

图17为化合物2的HR-ESI-MS谱；

图18为化合物2的IR谱。

具体实施方式

本发明化合物的提取原料为黑刺菝葜，黑刺菝葜(Smilax scobinicaulis)的根与茎于2010年10月采自陕西秦岭太白山，由西北农林科技大学吴振海高级实验师鉴定，已认证的凭证标本(XB 00045)储存在西北农林科技大学标本馆。

提取方法具体如下：

步骤一，取黑刺菝葜的根和茎粉碎后的干粉末(62kg)，用70％甲醇(3×80L)在室温下提取3次，合并3次的提取液减压浓缩得到乙醇浸膏。

步骤二，将得到的乙醇浸膏悬浮于水(5L)中，依次用石油醚(5L)、乙酸乙酯(5L)、5L正丁醇萃取，浓缩萃取液得到正丁醇浸膏(1792g)。

步骤三，将正丁醇浸膏(1792g)用水溶解后过D101大孔树脂，先用水洗除去糖及其他水溶性杂质后，再用50％乙醇洗脱，得到呋甾烷醇类皂苷Fr.1(645g)，最后用90％乙醇洗脱，得到螺甾烷醇类皂苷Fr.2(110g)。

Fr.1(645g)用水溶解后再次过D101大孔树脂，用70％的乙醇洗脱得到Fr.1b。Fr.1b(600g)甲醇溶解，硅胶拌样，经硅胶柱用乙酸乙酯-甲醇-水(15∶1∶0.5～3∶1∶0.5)梯度洗脱，TLC检测合并得到10个组分，按洗脱顺序，依次记为：Fr.1b1、Fr.1b2、Fr.1b3、Fr.1b4、Fr.1b5、Fr.1b6、Fr.1b7、Fr.1b8、Fr.1b9、Fr.1b10。

Fr.1b4(9.7g)经硅胶柱用乙酸乙酯-甲醇(17∶1～3∶1)梯度洗脱，得到4个组分：按洗脱顺序，依次记为：Fr.1b4a、Fr.1b4b、Fr.1b4c、Fr.1b4d。

Fr.1b4c(1.6g)经凝胶Sephadex LH-20柱用甲醇洗脱得到3个组分，按洗脱顺序，依次记为：Fr.1b4c1、Fr.1b4c2、1b4c3。

Fr.1b4c1(635mg)经反相C₁₈柱用甲醇-水(30％-70％)梯度洗脱，得到4个组分，按洗脱顺序，依次记为：Fr.1b4c1a、Fr.1b4c1b、Fr.1b4c1c、Fr.1b4c1d。

Fr.1b4c1c(238mg)经制备HPLC(RP-C₁₈)，在55％甲醇-水，波长215nm,流速5ml/min的条件下纯化得到化合物2(125.8mg,保留时间t_R＝7.9min)。

Fr.1b9(24.0g)经凝胶Sephadex LH-20柱用甲醇洗脱得到4个组分，按洗脱顺序，依次记为：Fr.1b9a、Fr.1b9b、Fr.1b9c、Fr.1b9d。

Fr.1b9a(2.1g)经反相C₁₈柱用甲醇-水(30％-70％)梯度洗脱，得到四个组分，按洗脱顺序，依次记为：Fr.1b9a1、Fr.1b9a2、Fr.1b9a3、Fr.1b9a4。

Fr.1b9a3(1.1g)经硅胶柱用乙酸乙酯-甲醇-水(9:2:0.3)等度洗脱，得到四个组分，按洗脱顺序，依次记为：Fr.1b9a3a、Fr.1b9a3b、Fr.1b9a3c、Fr.1b9a3d。

Fr.1b9a3c(223mg)经半制备HPLC(RP-C₁₈)，在53％甲醇-水，波长215nm,流速3ml/min的条件下纯化得到化合物1(120.3mg,保留时间t_R＝9.3min)。

上述分离方法中，()中给出的是一具体参考数据。

化合物1和化合物12的酸水解和糖分析

分别对化合物1和化合物2进行以下试验：取化合物1(化合物2)5mg溶于50mL 1M HCl(体积比1:1的甲醇-水作为展开剂)中，在沸水浴中回流提取8h。移去溶剂，剩余的部分用水和CHCl3溶解，分层。水层用质量百分比浓度为5％的NaOH中和，然后用Sephadex LH-20凝胶柱脱盐。

用TLC检测，与D-葡萄糖与L-阿拉伯糖标准品对照，确定化合物1中含有D-葡萄糖和L-阿拉伯糖，化合物2中含有D-葡萄糖。

化合物1结构解析

化合物1，白色粉末，易溶于吡啶，可溶于水、甲醇和乙醇。

Liebermann-Burchard反应和Molish反应均呈阳性，与Ehrlich试剂反应显红色，说明化合物可能为呋甾皂苷。

如图8所示，正离子HR-ESI-MS的分子离子峰m/z 941.4727[M+Na]⁺(Calcd for C₄₅H₇₄NaO₁₉，m/z 941.4717)，提示化合物的分子式为C₄₅H₇₄O₁₉，ESI-MS中的941.4[M+Na]⁺也显示分子式为C₄₅H₇₄O₁₉。

如图9所示，在IR光谱中，化合物1糖苷中羟基的信号出现在3408cm^-1和1044cm^-1，羰基的信号出现在1707cm^-1，烷基的信号出现在2927cm^-1。

以上信息结合化合物1的¹H NMR、¹³C NMR、DEPT和2D-NMR(COSY、HSQC、HMBC和NOESY)谱得知化合物1是一个呋甾皂苷。具体地说：

如图1所示，¹H NMR谱显示有4个甲基峰，其中有2个次甲基上甲基δ_H 0.86(3H,s,H-18)和0.80(3H,s,H-19)，2个亚甲基上的甲基δ_H 1.04(3H,d,J＝6.0Hz,H-21)和0.98(3H,d,J＝5.0Hz,H-27)，如图2所示，它们对应的C信号为δ_C 15.5,12.1,14.7和15.9，这是典型的甾体甲基信号。

如图2和图3所示，在¹³C NMR中存在一羰基信号δ_C 212.0，如图6所示，HMBC谱中存在H-7和C-6相关信号，表明该羰基在C-6位。核磁信号中δ_H 3.17(3H,s,OCH₃)显示存在一甲氧基，HMBC谱中OCH₃与C-22的相关峰显示该甲氧基连在C-22位。如图4和图7所示，在COSY谱和NOESY谱中存在甲氧基质子δ_H 3.17和H-16质子δ_H 4.40相关信号，表明C-22的构型为α构型。

除此，在¹H NMR谱中存在三个端基质子信号4.26(1H,d,J＝7.0Hz,glc-1′),4.42(1H,d,J＝6.5Hz,glc-1″)和4.34(1H,d,J＝6.0Hz,ara-1″′)，如图5所示，由HSQC谱可知它对应的C信号在δ_C 103.2,100.9和103.8，表明存在三个取代糖。

综合分析¹H NMR、¹³C NMR、DEPT和2D-NMR(COSY、HSQC、HMBC和NOESY)谱可知该取代糖为两个吡喃葡萄糖基和一个吡喃阿拉伯糖基。端基质子的偶合常数J为6.0–7.0Hz，表明吡喃葡萄糖基为β构型，吡喃阿拉伯糖基α构型。通过TLC检测和测定其旋光值与D-吡喃葡萄糖和L-吡喃阿拉伯糖基的标准品确定为D-吡喃葡萄糖和L-吡喃阿拉伯糖。从C-26的C信号(δ_C 74.6)可知其发生了苷化位移，在HMBC谱中有glc-H-1"′与C-3相关峰，这表明有一个D-吡喃葡萄糖连接在C-26位上。在HMBC谱中存在glc-H-1′与C-3相关峰，ara-H-1″与C-6′相关峰，这表明D-吡喃葡萄糖连接在C-3位上，D-吡喃葡萄糖和L-吡喃阿拉伯糖是1→6连接。

H₂-26上两个偕质子化学位移的差异Δ_ab＝0.35，表明C-25为R构型。在NOESY谱中，可以看到H-5质子δ_H 2.40和H-9质子δ_H 1.40相关，因此C-5为5α构型。

综上所述，化合物1的结构为26-O-β-D-葡萄糖基-3β,26-三羟基-(25R)-5α-呋甾烷-6-酮-22α-甲氧基-3-O-[α-L-阿拉伯糖基-(1→6)]-β-D-葡萄糖苷。

化合物1(26-O-β-D-葡萄糖基-3β,26-二羟基-(25R)-5α-呋甾烷-6-酮-22α-甲氧基-3-O-[α-L-阿拉伯糖基-(1→6)]-β-D-葡萄糖苷)的相关试验数据数据

白色粉末,熔点>290℃；旋光(c 0.115,CH₃OH)；

HR-ESI-MS:m/z 941.4727[M+Na]⁺(Calcd for C₄₅H₇₄O₁₉:941.4717)；

ESI-MS:m/z 941.4[M+Na]⁺and 917.3[M–H]^–；

IRυ_max(KBr):3408,2927,1707and 1044cm^-1；

¹H NMR(Pyridine-d₅,500MHz)δ:2.40(1H,d,J＝12.0Hz,H-5),2.16(1H,t,J＝13.0Hz,H-7a),2.24(1H,m,H-7b),1.40(1H,m,H-9),1.43(1H,m,H-14),4.40(1H,m,H-16),1.80(1H,m,H-17),0.80(3H,s,H-18),0.86(3H,s,H-19),1.04(3H,d,J＝6.0Hz,H-21),3.40(1H,m,H-26a),3.76(1H,m,H-26b),0.98(1H,d,J＝5.0Hz,H-27),3.17(3H,s,OCH₃),4.42(1H,d,J＝6.5Hz,glc-H-1′),4.09(1H,d,J＝11.5Hz,glc-H-6a′),3.83(1H,m,glc-H-6b′),4.34(1H,d,J＝6.0Hz,glc-H-1″),4.26(1H,d,J＝7.0Hz,glc-H-1″′)；¹³C NMR(Pyridine-d₅,125MHz)δ:36.3(C-1),28.6(C-2),76.8(C-3),26.0(C-4),56.0(C-5),212.0(C-6),46.1(C-7),37.4(C-8),53.4(C-9),40.8(C-10),21.0(C-11),39.1(C-12),41.1(C-13),56.0(C-14),31.2(C-15),80.8(C-16),63.6(C-17),12.1(C-18),15.5(C-19),39.8(C-20),14.7(C-21),112.6(C-22),29.9(C-23),27.6(C-24),33.6(C-25),74.6(C-26),15.9(C-27),46.3(OCH₃),100.9(glc-C-1′),73.7(glc-C-2′),76.6(glc-C-3′),70.4(glc-C-4′),75.5(glc-C-5′),68.2(glc-C-6′),103.8(ara-C-1″),71.0(ara-C-2″),72.8(ara-C-3″),68.0(ara-C-4″),65.2(ara-C-5″),103.2(glc-C-1″′),73.8(glc-C-2″′),77.1(glc-C-3″′),70.4(glc-C-4″′),76.5(glc-C-5″′),61.5(glc-C-6″′)。

化合物2结构解析

化合物2，白色粉末，易溶于吡啶，可溶于水、甲醇和乙醇。

如图17所示，正离子HR-ESI-MS的分子离子峰m/z 647.3762[M+Na]⁺(Calcd for C₃₄H₅₆NaO₁₆，m/z 647.3766)，提示化合物的分子式为C₃₄H₅₆O₁₀，ESI-MS中的m/z 647.4[M+Na]⁺和m/z 623.4[M–H]^–也显示分子式为C₃₄H₅₆O₁₀。

如图18所示，在IR光谱中，化合物2糖苷中羟基的信号出现在3423cm^-1和1043cm^-1，羰基的信号出现在1713cm^-1，烷基的信号出现在2943,2915和2865cm^-1。

以上信息结合化合物2的¹H NMR、¹³C NMR、DEPT和2D-NMR(COSY、HSQC、HMBC和NOESY)谱得知化合物2是一个带有一个糖的呋甾皂苷。具体地说：

如图10所示，¹H NMR谱显示有4个甲基峰，其中有2个次甲基上甲基δ_H 0.77(3H,s, H-18)和0.75(3H,s,H-19)，2个亚甲基上的甲基δ_H 1.19(3H,d,J＝6.8Hz,H-21)和0.99(3H,d,J＝6.8Hz,H-27)。如图11和图12所示，它们对应的C信号为δ_C 16.2,13.0,16.0和16.9，这是典型的甾体甲基信号。在¹³C NMR中存在一羰基信号δ_C 212.0，如图15所示，HMBC谱中存在H-7和C-6相关信号，表明该羰基在C-6位。核磁信号中δ_H 3.17(3H,s,OCH₃)显示存在一甲氧基，HMBC谱中OCH₃与C-22的相关峰显示该甲氧基连在C-22位。如图13和图16所示，在NOESY谱中存在甲氧基质子δ_H 3.17和H-16质子δ_H 4.41相关信号，表明C-22的构型为α构型(Matsuo et al.2008)。

除此，在¹H NMR谱中存在一个端基质子信号δ_H 4.26(1H,d,J＝8.0Hz,glc-1"′)，如图14所示，由HSQC谱可知它对应的C信号在δ_C 103.2，表明存在一个取代糖。

综合分析¹H NMR、¹³C NMR、DEPT和2D-NMR(COSY、HSQC、HMBC和NOESY)谱可知该取代糖为吡喃葡萄糖基。端基质子的偶合常数J为8.0Hz，表明该吡喃葡萄糖基为β构型。通过TLC检测和测定其旋光值与D-吡喃葡萄糖的标准品确定为D-吡喃葡萄糖。从C-26的C信号(δ_C 74.6)可知其发生了苷化位移，在HMBC谱中有H-1"′与C-26相关峰，这表明取代糖连接在C-26位上。D-吡喃葡萄糖连接在C-26位上是自然界中呋甾皂苷的一个特征。

甾体皂苷中C-25的构型通过H₂-26上两个偕质子化学位移的差异(Δ_ab＝δ_a-δ_b)来推断，当Δ_ab<0.48时C-25的构型为25R；当Δ_ab>0.57时C-25的构型为25S。化合物2中Δ_ab＝0.35，所以C-25为R构型。在NOESY谱中，可以看到H-5质子δ_H 2.38和H-9质子δ_H 1.40相关，因此C-5为5α构型。

综上所述，化合物2的结构为26-O-β-D-葡萄糖基-3β,26-二羟基-(25R)-5α-呋甾烷-6-酮-22α-甲氧基。

化合物2(26-O-β-D-葡萄糖基-3β,26-二羟基-(25R)-5α-呋甾烷-6-酮-22-甲氧基)的相关试验数据

白色粉末,熔点>290℃；旋光(c 0.119,CH₃OH)；

HR-ESI-MS:m/z 647.3762[M+Na]⁺(Calcd for C₃₄H₅₆NaO₁₀:647.3766)；

ESI-MS:m/z 647.4[M+Na]⁺,623.4[M–H]^–and 659.4[M+Cl]^–；

IRυ_max(KBr):3423,2943,2915,2865,1713and 1043cm^-1；

¹H NMR(Pyridine-d₅,500MHz)δ:2.38(1H,d,J＝11.0Hz,H-5),2.25(1H,dd,J＝13.0and 4.5Hz,H-7a),2.14(1H,t,J＝12.5Hz,H-7b),1.40(1H,m,H-9),1.41(1H,m,H-14),4.41 (1H,q-like,J＝7.5,H-16),1.79(1H,m,H-17),0.79(3H,s,H-18),0.85(3H,s,H-19),1.03(3H,d,J＝7.0Hz,H-21),3.40(1H,dd,J＝9.5and 6.5Hz,H-26a),3.75(1H,dd,J＝9.5and 6.5Hz,H-26b),0.97(1H,d,J＝7.0Hz,H-27),3.17(3H,s,OCH₃),4.26(1H,d,J＝8.0Hz,glc-H-1′),3.68(1H,dd,J＝12.0and 5.5Hz,glc-H-6a′),3.88(1H,dd,J＝12.0and 1.5Hz,glc-H-6b′)；¹³C NMR(Pyridine-d₅,125MHz)δ:36.3(C-1),30.1(C-2),69.7(C-3),29.3(C-4),56.2(C-5),212.0(C-6),46.1(C-7),37.4(C-8),53.4(C-9),40.6(C-10),21.0(C-11),39.2(C-12),41.1(C-13),56.0(C-14),31.2(C-15),80.6(C-16),63.6(C-17),12.1(C-18),15.5(C-19),39.8(C-20),14.5(C-21),112.6(C-22),35.5(C-23),27.2(C-24),33.6(C-25),74.6(C-26),16.0(C-27),46.2(OCH₃),103.2(glc-C-1′),73.8(glc-C-2′),76.5(glc-C-3′),70.3(glc-C-4′),76.7(glc-C-5′),61.4(glc-C-6′)。

关于本发明的化合物的生物活性，发明人作了以下相关试验：

一、促进植物生长试验：

将萝卜种子用0.5％的KMnO₄溶液浸泡10min消毒。

然后用蒸馏水将种子冲洗干净并浸泡10h。把种子洒在湿棉花上25℃黑暗培养72h，挑选长势相同的萝卜幼苗，用刀片截取子叶(称重)和下胚轴(1.2cm长并测量直径)，分别放入盛有9mL化合物1和化合物2样品溶液的直径为9cm培养皿中，每个浓度(样品溶液设置5个浓度梯度，即10^-3～10^-7mg/mL)的样品溶液设置5个培养皿，每个培养皿中分别放入10个胚轴和子叶。25℃下黑暗培养72h，测量子叶鲜重，下胚轴长度和直径。

测定结果见表1-3。

表1萝卜幼苗下胚轴增长

注：δl/δl₀＝样品溶液处理萝卜幼苗下胚轴增长量/水对照萝卜幼苗下胚轴增长量×100％(cm)。l与l₀分别表示样品溶液处理的萝卜幼苗下胚轴生长长度和水对照萝卜幼苗下胚轴生长长度。

表2萝卜幼苗子叶增重

注：δw/δw₀＝样品溶液处理萝卜幼苗增加质量/水对照萝卜幼苗下子也增加质量×100％(g)。w与w₀分别表示样品溶液处理的萝卜幼苗子叶重量和水对照萝卜幼苗子叶重量。

表3萝卜幼苗子下胚轴增粗

注：δt/δt₀＝样品溶液处理萝卜幼苗下胚轴直径增加长度/水对照萝卜幼苗下胚轴直径增加长度×100％(mm)。t与t₀分别表示样品溶液处理的萝卜幼苗下胚轴增粗粗度和水对照萝卜幼苗下胚轴增粗粗度。

由表可以看出，在极低的浓度下，不同浓度的化合物1和2均显著促进了植物的增长、增粗和增重效应，差异极其显著。

Claims

1.一种6-酮-22-甲氧基呋甾烷类甾体皂苷，其特征在于，该化合物的结构式如式（Ⅰ）所示：

其中或R₁=H。

2.权利要求1所述的6-酮-22-甲氧基呋甾烷类甾体皂苷用于制备植物生长剂的应用。