CN103815128A

CN103815128A - 一种建立动脉粥样硬化动物模型的高热量饲料及其应用

Info

Publication number: CN103815128A
Application number: CN201410057583.1A
Authority: CN
Inventors: 曾文; 龚立; 毕凤均; 申渝波; 杨遵远
Original assignee: SICHUAN PRIMED BIO-TECH Co Ltd
Current assignee: SICHUAN PRIMED XINGZHI BIO-TECH Co.,Ltd.
Priority date: 2014-02-20
Filing date: 2014-02-20
Publication date: 2014-05-28
Anticipated expiration: 2034-02-20
Also published as: CN103815128B

Abstract

本发明公开了一种建立动脉粥样硬化动物模型的高热量饲料及其应用。所述饲料中蛋白质的质量百分含量为18-20%，脂肪的质量百分含量6-8%。所述饲料采用低脂肪比例和不含胆固醇的高热量配方，造模方法更温和，不仅符合动物福利，更能模拟动脉粥样硬化血管损伤患病人群的饮食习惯，更有利于疾病和药物的研究。以所述高热量饲料长时间慢性诱导的动脉粥样硬化模型，更符合人类患病群体的年龄体征情况和饮食生活习惯，与人类发病过程更接近，造模过程更缓和，模型更稳定。可作为降脂及抗动脉粥样硬化新药成药性研究的理想动物模型，服务于药物评价及临床前研究。

Description

一种建立动脉粥样硬化动物模型的高热量饲料及其应用

技术领域

本发明属于生物领域，涉及一种建立动脉粥样硬化动物模型的高热量饲料及其应用。

技术背景

动脉粥样硬化是以胆固醇和胆固醇脂为主要成分的脂质在动脉及其分支的动脉壁内膜或内膜下沉着，同时伴有中层平滑肌细胞移行至内膜下增生，使内膜增厚，形成粥样黄色或灰黄色斑块,造成血管损伤。造成动脉粥样硬化的原因可分内因外因。内因有遗传因素，如家族性的糖尿病、冠心病，以及性别年龄的因素：随着年龄的增长，动脉粥样硬化形成的速度也加快。在性别上，女性在更年期前受卵巢激素保护，很少发生动脉粥样硬化。外因有诸如高血压、高血脂、吸烟、肥胖、运动太少、心理紧张以及糖尿病。

随着我国社会经济的发展及人民生活水平的日益提高，心血管疾病以及代谢性疾病如高血压、糖尿病和高血脂已经成为人们健康的最大杀手。其中，全世界每天因高血脂症引发的心脑血管疾病死亡人数近3600人之多，我国每年因高血脂引起的高血压、脑梗、中风、心梗、偏瘫、致残、致死人数以每年递增12%的速度上升。而有研究表明，高血脂、高血糖和胰岛素抵抗均能增加动脉粥样硬化风险。近几年动脉粥样硬化的发病率年龄已由中老年向中青年方向发展，且发病率逐年上升。中青年是国家和谐建设的主力军，社会的中流砥柱。每年动脉粥样硬化的发病给国家和家庭造成巨大的经济损失，已引起医药卫生部门及国家中央的高度重视。

国家“十二五”新增课题申报指南新药研究开发关键技术研究明确写出：应针对多因素复杂疾病如肿瘤、心脑血管病、神经退行性疾病等防治药物的研发需求，研究并建立更灵敏、更可靠、更快捷的早期成药性评价的新技术和新模型，评价一批创新药物品种。但是因为种属的差异，将传统实验动物如小型动物及目前广泛应用的啮齿类动物模型作为研究对象评价新药，其正常生理指标与人类相去甚远，稳定的具有相似发病机理的动物模型的建立与验证与临床不尽相同。且以啮齿类动物为对象进行的传统动物实验获得的药代动力学、药效学和安全性的实验结果对临床用药的指导意义有限，致使花费了大量研究费用后，药物却不能通过临床试验或临床应用后出现严重的不良反应，危及用药人群生命安全。

以恒河猴这一非人灵长类种属作为研究对象，建立合适的动物模型进行新药的筛选、PK/PD研究以及新药临床前试验意义重大。这得益于非人灵长类与人类生理结构、功能及相关疾病诊治指标的相似性。药物作用于非人灵长类动物而得到的实验结果能更好地转化，指导临床研究。因此建立非灵长类动物模型动脉粥样硬化模型成为治疗研究与临床前药物评价的迫切需要。

但是非人灵长类动物动脉粥样硬化模型通常存在着造模周期长、模型稳定性欠缺、模型的确立以及诊治技术等相关平台构建的不完整等技术难点。国内外皆有文献或专利报道。Kukreja, R.等（Atherosclerosis, 1981. 40(3): p. 291-298.）使用 18只雌雄各半的2.5-5.5kg体重的成年恒河猴作为造模对象，饲喂配方为蛋白质15%、脂肪15%、碳水化合物60%、胆固醇1%，加之每天注射50mg/kg量的肾上腺素。7个月后通过杀死动物取病理检查，发现其中15只恒河猴出现了显著的主动脉和冠状动脉粥样硬化纤维性斑块。此法为药物干预急性造模，存在一定的模型不稳定的问题。选取的恒河猴体重范围不属于动脉粥样硬化易感群体的体重范围，不能更好的模拟人类的发病过程。检测方法为侵入性，不利于模型的应用和药物开发。国内有使用与恒河猴同属的食蟹猴造高血脂症和动脉粥样硬化模型的报道，其选用的饲料配方为蛋黄粉5%、猪油15%、胆固醇0.5%、基础饲料75%，造模3个月，最后用TC、TG、和LDL-C来评价和确认模型。同样属于急性造模，胆固醇总量过高对动物身体有损，并且以血脂生化指标来表征动脉粥样硬化，说服力不够。

综上所述，现有的非人灵长类动脉粥样硬化模型中，大多是通过急性高胆固醇饮食短期诱导获得，造模方法对动物刺激过于激烈，模型不够稳定，与真实的动脉粥样硬化的临床表现也有较大差异。从而限制了这类动物模型的应用。

所以，使用先天肥胖、老龄这种种群中易感的非人灵长类个体作为研究对象，充分模拟患病人群饮食习惯，以高热量饲料饮食长时间诱导为方法建立的非人灵长类动脉粥样硬化模型，较之急性高胆固醇饮食短期诱导获得的模型，造模方法更平和，模型更稳定，在遗传、心血管功能和脂质代谢等方面与人类相似。目前临床上最常用的是血生化指标辅助多普勒彩超以及核磁共振成像（MRI）等非侵入性的影像学手段来明确诊断动脉粥样硬化。因此，通过多普勒彩超以及3.0T MRI等无创性的检测，可以更客观地评价动脉粥样硬化的发展程度及发生部位。由于检测方法为非侵入性，稳定的模型可以进一步用于降脂及抗动脉粥样硬化药物的研发。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种全新的建立动脉粥样硬化动物模型的高热量饲料。

本发明通过以下技术方案来实现：

一种建立动脉粥样硬化动物模型的高热量饲料，所述饲料中蛋白质的质量百分含量为18-20%，脂肪的质量百分含量6-8%。低脂肪比例和不含胆固醇的高热量配方，造模方法更温和，不仅符合动物福利，更能模拟动脉粥样硬化血管损伤患病人群的饮食习惯，更有利于疾病和药物的研究。蛋白质含量采用GB/6432-94检测，脂肪含量采用GB/T6433-94检测。

作为可选方式，所述饲料中蛋白质的质量百分含量为18%，脂肪的质量百分含量8%。

作为可选方式，饲料按重量份计的组成为：豆粕20-30份、麸皮20-30份、面粉15-20、猪油2-4份、蛋白粉5-8份、蔗糖6-10份、复合维生素5-10份、电解质5-8份和水10-15份。所述饲料配方除了提供蛋白质和脂肪还提供维生素和电解质等更能模拟动脉粥样硬化血管损伤患病人群的饮食习惯。

作为可选方式，所述饲料按重量份计的组成为：豆粕20份、麸皮20份、猪油4份、面粉18、蛋白粉8份、蔗糖6份、复合维生素5份、电解质5份和水14份。

作为可选方式，所述饲料被压制成饼状。制作成饼状方便储存和转移，同时方便动物取食，较少饲喂时的浪费，有利于对饲喂量的精确控制。

本发明还提供了一种建立动脉粥样硬化动物模型的方法，包括以下步骤：

1）选取背景清晰的恒河猴作为模型动物；

2）每只恒河猴每天饲喂250g本发明所述的任意一种高热量饲料；

3）连续饲喂一段周期，建立稳定的动脉粥样硬化恒河猴模型。

作为可选方式，在上述建立动脉粥样硬化动物模型的方法中，步骤3）中，所述连续饲喂的周期为2年。

作为可选方式，在上述建立动脉粥样硬化动物模型的方法中，选择背景清晰中老年先天性肥胖恒河猴作为模型动物。优选雄性恒河猴。这类模型动物对动脉粥样硬化更易感，造模成功率更高，可缩短造模周期。

作为可选方式，在上述建立动脉粥样硬化动物模型的方法中，所述作为模型动物的恒河猴年龄10-20岁，身体质量指数BMI>30。

本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。

本发明的有益效果：

1. 本发明所述高热量饲料，采用低脂肪比例和不含胆固醇的高热量配方，造模方法更温和，不仅符合动物福利，更能模拟动脉粥样硬化血管损伤患病人群的饮食习惯，更有利于疾病和药物的研究。

2.所述动脉粥样硬化模型的建立方法，以高热量饲料长时间慢性诱导，更符合人类患病群体的年龄体征情况和饮食生活习惯，与人类发病过程更接近，造模过程更缓和，模型更稳定。本发明建立的动脉粥样硬化恒河猴模型，可作为降脂及抗动脉粥样硬化新药成药性研究的理想动物模型，服务于药物评价及临床前研究。

附图说明：

图1为实施例4中连续饲喂2年后的实验动物的右颈总动脉彩色多普勒超声图。

图2为实施例4中连续饲喂2年后的实验动物的颈动脉核磁共振成像照片。

具体实施方式：

以下通过实施例的具体实施方式再对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应当将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。在不脱离本发明的精神和原则之内做的任何修改，以及根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的等同替换或者改进，均应包括在本发明的保护范围内。以下实施例中所用原料均可以从市场上购得。

实施例1 制备高热量饲料

所述饲料按重量份计的组成为：豆粕20份、麸皮20份、面粉18、猪油4份、蛋白粉8份、蔗糖6份、复合维生素5份、电解质5份和水14份。所述电解质可选NaCl、KCl、CaCl₂等常用电解质中的至少一种，复合维生素可选择维生素A、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、维生素C、维生素D、维生素E等常用维生素进行组合，也可采用市售的复合维生素产品。

将各组分均匀混合后压制成饼状待用。

所得饲料中蛋白质的质量百分含量为18%，脂肪的质量百分含量8%，蛋白质含量按照GB/6432-94检测，脂肪含量按照GB/T6433-94检测。

实施例2 制备高热量饲料

所述饲料按重量份计的组成为：豆粕30份、麸皮20份、面粉15、猪油2份、蛋白粉5份、蔗糖10份、复合维生素10份、电解质8份和水10份。

将各组分均匀混合后，压制成饼状待用。

所得饲料中蛋白质的质量百分含量为20%，脂肪的质量百分含量6%，蛋白质含量按照GB/6432-94检测，脂肪含量按照GB/T6433-94检测。

实施例3制备高热量饲料

所述饲料按重量份计的组成为：18份蛋白质，60份碳水化合物，8份脂肪和14份水。将各组分均匀混合，压制成饼状待用。

实施例4动脉粥样硬化动物模型的建立

动物入选、检疫及饲养

选取背景清晰健康成年恒河猴60只，每只动物单笼饲养，动物室保持温度为19-26℃，湿度为60%±20%，每小时通风次数为10次，每天保持光照为12h。将实验动物分为3组，每组20只，分别给予实施例1-3中制备的高热量饲料，每天每只给予高热量饲料250g，自由饮水。

评价方法及结果（检测周期可选择每月1次）

（1）血脂相关生化指标的长期动态监测

在造模的两年时间内，多次进行血脂相关生化指标TC、TG、LDL-C等的检测。每次检测为动物禁食12h后，上午9点至10点静脉肘正中静脉采血1ml于含有分离胶的微量采血管中，4℃静置30min，离心分取血清，通过Beckman-Coulter全自动生化分析仪对血清进行生化分析。将分析结果与种群长期积累的血脂正常范围对比，确证高脂血症并辅助影像学指标判断（见表1）。

表1恒河猴饲喂高热量饲料后血液TC、TG、LDL-C指标的检测

Figure 2014100575831100002DEST_PATH_IMAGE001

动态监测血脂生化相关指标是考虑到多点动态地进行指标的检测和观察，有助于获得疾病进展的详细信息，利于机理探究。

（2）颈动脉彩色多普勒超声检测

选用SonoSite M-turbo型彩色多普勒超声仪，探头频率7-15MHz。被检查恒河猴经戊巴比妥钠麻醉后取仰卧位。充分暴露颈部，探头横切颈总动脉及颈内动脉、颈外动脉起始部，观察有无硬化斑形成；探头纵切颈总动脉，使其前、后壁内膜显示清晰后冻结并放大图像，取颈动脉球部下1cm处测量后壁内中膜厚度（IMT）（见图1），膜超声形态及测量的厚度值来判定恒河猴动脉粥样硬化情况。

基于本种群的正常数据，在10-20岁的模型恒河猴中，IMT值为0.3-0.5mm，而检测建立的模型所得到的IMT值均大于0.8mm，表现出不同程度的增厚。

（3）颈动脉核磁共振成像

选用西门子BRUKER BIOSPEC 3.0T MRI，采用标准自旋回波（SE）脉冲序列，获取横断面T1加权像（T1WI）。恒河猴用氯胺酮镇静戊巴比妥钠麻醉后取仰卧位保定，具体扫描参数如下：T1WI取TR（重复时间）19ms，TE（回波时间）3.1ms，层厚1mm，间距2mm.扫描野FOV为200*150mm。采用盲法评价颈动脉斑块。

通过对模型动物的颈动脉扫描成像，均发现了颈总动脉的分叉处不同程度的表面不规则，信号不均匀的现象，有相关部位的血管损伤（见图2）。

选择以上两种影像学检查方法是基于以下考虑：

影像学检测结果较之血液生化指标更直观更客观也更有说服力。模型的建立是为了应用于疾病的研究和药物的开发，故影像学造模指标的建立意义重大，并且，无创性的检查手段有助于模型的维持，并能后续地应用于研究。赋予模型应用价值的同时兼顾了动物福利。

结果显示：采用实施例1-3所述的三者饲料均能成功构建动脉粥样硬化模型，建模成功率均在90%以上，且各例均为慢性发病过程，与人类发病过程及症状相似度高，造模过程缓和，模型稳定。

通过以上实例得到的实验结果证明，使用该法可以制备出与人类发病过程、机理，疾病表现非常相似的动脉粥样硬化模型。并可以通过多普勒彩超及MRI这两种先进的临床非侵入性检测方法验证模型。

综上所述，本发明动脉粥样硬化恒河猴的建模成功率高，稳定性好。疾病评价的影像学诊断背景数据的建立，可以很大程度上解决传统动物实验对新药成药性研究以及临床评价的局限性，有助于对疾病机理及发病过程进行更深层次的研究，进一步推动降脂及抗动脉粥样硬化药物的研发，造福患者。

实施例5 动脉粥样硬化模型的建立

动物入选

选择背景清晰中老年先天性肥胖恒河猴作为模型动物，选取背景清晰雄性恒河猴20只。其中，动物选择的标准是：年龄10-20岁，BMI>30。

选择以上策略是基于以下考虑：

（1）作为实验动物必须为背景清晰，有一定生理数据积累的动物。

（2）选用年龄10-20岁，BMI>30的中老年先天性肥胖个体是因为高脂血症和动脉粥样硬化患病人群有中老年发病倾向的特点，故中老年先天性肥胖恒河猴为该病的易感个体，使用易感个体造模能更有利于疾病的研究。

检疫及饲养

对实验动物进行结核杆菌皮试，寄生虫粪检，沙门氏菌、志贺氏菌培养检测，血清B型疱疹病毒检测，以上检测全阴性才可入选。每只动物单笼饲养，动物室保持温度为19-26℃，湿度为60%±20%，每小时通风次数为10次，每天保持光照为12h。每只动物每天给予实施例1中制备的高热量饲料250g，自由饮水。

评价方法与实施例4相同。

结果显示：采用中老年先天性肥胖个体作为模型动物，同样成功地构建了非人灵长类动物动脉粥样硬化模型，建模成功率在95%以上，模型动物对动脉粥样硬化更易感，造模周期更短，大部分实验动物在连续饲喂2年后出现典型的症状，与人类发病过程及症状相似度更高，造模过程更缓和，模型更稳定。

以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围。

Claims

1.一种建立动脉粥样硬化动物模型的高热量饲料，其特征在于，所述饲料中蛋白质的质量百分含量为18-20%，脂肪的质量百分含量6-8%。

2.根据权利要求1所述的建立动脉粥样硬化动物模型的高热量饲料，其特征在于，所述饲料中蛋白质的质量百分含量为18%，脂肪的质量百分含量8%。

3.根据权利要求1所述的建立动脉粥样硬化动物模型的高热量饲料，其特征在于，所述饲料按重量份计的组成为：豆粕20-30份、麸皮20-30份、面粉15-20、猪油2-4份、蛋白粉5-8份、蔗糖6-10份、复合维生素5-10份、电解质5-8份和水10-15份。

4.根据权利要求1所述的建立动脉粥样硬化动物模型的高热量饲料，其特征在于，所述饲料按重量份计的组成为：豆粕20份、麸皮20份、面粉18、猪油4份、蛋白粉8份、蔗糖6份、复合维生素5份、电解质5份和水14份。

5.根据权利要求1所述的建立动脉粥样硬化动物模型的高热量饲料，其特征在于，所述饲料被压制成饼状。

6.一种建立动脉粥样硬化动物模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）选取恒河猴作为模型动物；

2）每只恒河猴每天饲喂250g如权利要求1-5所述的任意一种高热量饲料；

7.根据权利要求6所述的建立动脉粥样硬化动物模型的方法，其特征在于，步骤3）中，所述连续饲喂的周期为2年。

8.根据权利要求6所述的建立动脉粥样硬化动物模型的方法，其特征在于，选择背景清晰的中老年先天性肥胖恒河猴作为模型动物。

9.根据权利要求6所述的建立动脉粥样硬化动物模型的方法，其特征在于，所述作为模型动物的恒河猴年龄10-20岁，身体质量指数BMI>30。