CN103814425B - 用于高速蛋白质组学的步进扫描离子阱质谱法 - Google Patents

Abstract

一种用于获得离子的质谱的离子阱质谱仪和方法，通过在一波段上以频率增量步进扫描驱动频率，其中对于每个步进，将特定频率保持固定数量的完整周期，其中每个特定频率连续地改变到下一步进中的频率，并且其中在每个步进中的每个特定频率起始于零相位位置。

Description

用于高速蛋白质组学的步进扫描离子阱质谱法

技术领域

本发明涉及质谱法和蛋白质组学(proteomics)领域。本申请尤其涉及一种用于在质谱法中高速测定蛋白质组和检测大生物分子离子的方法。本申请还尤其涉及用于检测大分子和生物分子的离子阱质谱法的频率步进扫描设备和方法。

背景技术

质谱法是一种用于通过其质荷比来识别分子或离子的强大的工具。质谱法的局限性是难以快速测定高质荷比的生物分子或大分子。大生物分子检测的最新进展包括基质辅助激光解吸／电离(matrix-assisted laser desorption／ionization，MALDI)和电喷雾离子化(electrospray ionization，ESI)。

质谱法已被应用到蛋白质、细胞器和细胞的研究，用于表征分子量以及用于研究蛋白质的消化产物、蛋白质组分析、代谢组(metabolomics)和肽序列(peptide sequencing)等。诸如三维四极离子阱(three-dimensional quadrupole iontraps)的离子捕获设备和方法对一般的蛋白质组学已非常有用，因为其提供了离子从离子阱中的质量选择性喷射。

简单地说，离子从离子阱中的质量选择性喷射可以通过频率扫描质谱仪的LC谐振电路来实现，其中所述离子阱为电容器。可以使扫频对应于被检测离子的质荷比的范围。

通过频率扫描方法的离子从离子阱中的质量选择性喷射的缺点是，当在一频率范围上扫频时，在切换到下一频率之前未在整个周期上完成特定频率。此外，扫频中的每个相继频率起始于任意相位。这些缺点降低了质谱的分辨率和频率与质荷比的对应性。

对使用质谱仪检测蛋白质和生物分子的方法存在持续需求。还存在对能够检测大生物分子离子的质谱仪装置和安排的需要。更存在能够为蛋白质组学研究中以高分辨率快速检测生物分子的质谱仪装置和方法的需要。

发明内容

本发明的实施例可以提供使用质谱仪检测蛋白质和生物分子的方法。本公开还提供了一种用于质谱仪的装置和安排，其可以检测大生物分子离子。本公开的实施例还可以提供能够在蛋白质组学研究中以高分辨率快速检测生物分子的质谱仪装置和方法。

在一些方案中，本公开提供了用四极离子阱质谱仪获得离子的质谱的方法，通过在一波段上以频率增量步进扫描捕获频率，其中对于每个步进，将特定频率保持固定数量的完整周期，其中每个特定频率连续地改变到下一步进中的频率，并且其中在每个步进中的每个特定频率起始于零相位位置。在一些实施例中，完整周期的所述固定数量可为10至1000000。在某些实施例中，所述频率增量可为1Hz至256Hz。

在进一步的实施例中，所述方法包括在一波段上以频率增量步进扫描离子阱轴向激发RF频率，其中对于每个步进，将特定轴向频率保持固定数量的完整周期，其中每个特定轴向频率连续地改变到下一步进中的轴向频率，并且其中在每个步进中每个特定的轴向频率起始于零相位位置。

在进一步的实施例中，所述离子可以是选自以下群组的较大分子或结构的离子化分子或片段：大分子(macromolecules)、生物分子(biomolecules)、有机聚合物(organic polymers)、纳米颗粒(nanoparticles)、蛋白质、抗体(antibodies)、蛋白质复合物(protein complexes)、蛋白质偶联物(proteinconjugates)、核酸(nucleic acids)、寡核苷酸(oligonucleotides)、DNA、RNA、多糖(polysaccharides)、病毒、细胞、和生物细胞器(biological organelles)。在某些实施例中，所述离子可以具有约1kDa到约200k Da的质量。

本发明的实施例还可以提供一种获得离子的质谱的方法，通过在四极离子阱中捕获离子，所述四极离子阱包括中心环电极和两个端盖电极，然后将第一特定频率的RF施加到所述中心环电极持续所述第一特定频率的RF的第一数量的完整周期，将第二特定频率的RF施加到所述中心环电极持续所述第二特定频率的RF的第二数量的完整周期，其中所述第二特定频率的RF起始于零相位而施加，并且其中所述第二特定频率的RF与所述第一特定频率的RF在频率上相差Δf₁的量。

所述方法还可以包括以下额外的步骤：将特定频率的RF施加到所述中心环电极持续所述特定频率的RF的一数量的完整周期，其中每个附加的特定频率的RF起始于零相位而施加，并且其中所述每个附加的特定频率的RF与前一特定频率的RF在频率上相差Δf_n的量。在一些实施例中，完整周期的所述第一数量和所述第二数量可以分别独立地为10至1000000。在某些实施例中，增量值Δf₁和Δf_n可以分别独立地为1至256Hz。

在进一步的实施例中，所述离子可以通过以下途径产生：MALDI、电喷雾离子化、激光离子化、热喷离子化、热离子化、电子离子化、化学离子化、电感耦合等离子体离子化、辉光放电离子化、场解吸离子化、快原子轰击离子化、火花离子化、或离子附着离子化。

在一些方案中，本发明包括一种用于获得离子的质谱的离子阱质谱仪。所述离子阱质谱仪可以包括：三维四极离子阱；顺序控制器，包括可编程波形发生器，用于在一波段上以频率增量合成驱动或捕获频率的步进扫描波形，其中对于每个步进，将特定频率保持固定数量的完整周期，其中每个特定频率连续地改变到下一步进中的频率，并且其中在每个步进中的每个特定频率起始于零相位位置；以及电荷检测器。

所述方法还可以包括将第一特定轴向频率的RF施加到所述端盖电极持续所述第一特定轴向频率的RF的第一数量的完整周期；以及将第二特定轴向频率的RF施加到所述端盖电极持续所述第二特定轴向频率的RF的第二数量的完整周期，其中所述第二特定轴向频率的RF起始于零相位而施加，并且其中所述第二特定轴向频率的RF与所述第一特定轴向频率的RF在频率上相差Δf₁的量。

在以下描述中，参照形成其一部分的附图，并且其中以图示可实施的具体实施例的方式示出。详细描述这些实施例以使本领域技术人员能够实施本发明，并且应当理解的是，可以利用其他实施例，并且可以做出结构、逻辑以及电学上的改变而不脱离本发明的范围。因此，以下对示例性实施例的描述不应当被理解为具有限制意义，并且本发明的范围由所附的权利要求限定。

附图说明

图1示出质谱仪中的三维离子阱的实施例。可以以捕获RF频率Ω驱动离子阱的中心环电极，并且离子阱的端盖电极可以经受辅助的轴向激发RF。电压斜坡函数发生器提供频率扫描的分析RF和轴向共振激发RF频率扫描。

图2示出本公开的质谱仪中的三维离子阱的实施例。可以以捕获RF频率Ω驱动离子阱的中心环电极，并且离子阱的端盖电极可以经受辅助的轴向激发RF。阶梯函数发生器提供分析RF步进式频率扫描和轴向共振激发RF步进式频率扫描。

图3示出使用任意函数发生器的实验线性扫频模式的示例。

图4示出质谱仪的顺序控制器的时序图。

图5示出本公开的实验步进式频率扫描的示例。扫描中的每个特定频率被保持固定数量的完整周期。扫描中的每个特定频率连续变化到下一步进中的频率。扫描中的每个特定频率起始于相位零位置。

图6示出通过使用从300kHZ到100kHZ步进式扫描得到的血管紧张素(M.W.1296Da)的实验质谱。整个频率范围分为4096步进。每个步进的特定频率被保持120个完整周期。

图7示出通过使用步进式扫描方法得到的IgG(M.W.150kDa)的实验质谱。

具体实施方式

本发明的实施例提供了用于研究蛋白质、细胞器和细胞以表征分子量、蛋白质的消化产物、蛋白质组分析、代谢组和肽序列等的质谱法的新方法。

本公开提供了一种使用对蛋白质组学研究有用的三维四极离子阱用于质谱法的新的离子捕获、喷射(ejection)和检测的方法。

三维(3D)四极离子阱可以包括两个双曲面(hyperbolic surface)端盖和一个双曲面中心环。可以在中心环和端盖之间捕获引入阱空间的离子。在保罗四极离子阱中被捕获的离子的运动轨迹的稳定性的条件描述为下列等式：

Φ₀=U+V cos Ωt 等式1

其中Φ₀是施加在中心环电极上的电势，V cos Ωt是RF电势，Ω是交流电压电源的角驱动频率，V是中心环电极上的AC振幅(0-峰值)，而U是中心环电极上的DC电势，以及

$q_z=\frac{8\mathrm{eV}}{m({r_0}^2+{{2z}_0}^2){\mathrm{\Ω}}^2}$ 等式2

其中，q_z是由马休方程(Mathieu equation)导出的离子的无量纲参数，m是离子质量，r₀是由环形电极的内接半径给定的离子阱的几何尺寸，而2z₀是两个端盖电极之间的距离。

对于被捕获离子的质量分析而言，可以使正弦电压V斜线上升以将q_z增加到离子选择性喷射过程中的不稳定点。

图1示出3D离子阱质谱仪的谐振电路。在电压斜线上升的过程中，可以通过使用LC电路来放大正弦波形V的电压。LC电路是由电感器和电容器构成的谐振电路或调谐电路。当连接在一起时，在电路中电流可以在电感器和电容器之间交替。这将以特定频率产生最大信号。对于质谱仪的谐振电路而言，3D离子阱是电容器，并连接到柱形空芯线圈。

空芯线圈具有比铁磁芯线圈更低的电感。因为空芯线圈没有在铁磁芯中发生的、增加频率的能量损失或磁芯损失，所以空芯线圈在高频上很有用。LC电路可以储存在其谐振频率上振动的电能。电容器取决于其两端的电压而将能量储存在其极板之间的电场中，并且电感取决于通过其的电流而将能量存储在其磁场中。

根据马修方程，LC谐振电路的斜坡电压可以增加到q_z到达不稳定区域并且从阱喷射离子的点。因为q_z也成反比依赖于离子质量，所以随着质量的增加，将q_z提升到喷射点所需的电压也增加。对于大生物分子和高分子量的分析物而言，LC电路的电压必须提升得极高，这可能会导致中心环与所述离子阱的端盖之间的电击穿。

为了避免电击穿，可以对离子阱使用频率扫描方法。为了调谐特定的谐振频率，离子阱耦合有可变电容器。可以机械地或电子地控制可变电容器的电容以获得LC电路的谐振频率。当电感器的值为固定时，可变电容器的电容可以用于在步进式扫描中获得特定的谐振频率。然而，使用机械控制器难以将特定频率保持固定数量的周期，并且然后将特定频率步进到下一谐振频率。用机械控制器还难以在每步进起始于相位零位置时从一个谐振频率步进到下一谐振频率。

为了克服LC电路的这个问题，可以使用扫频的扫描方法。线性调频正弦波形可以被设置为随时间线性增加或减少频率。可以用模拟电子器件经由压控振荡器产生调频信号(chirp signal)，并且线性地或指数地变化控制频率。也可以由数字-模拟转换器(DAC)数字化产生调频信号。

一般而言，对于离子阱的U值设置为等于零。

在本公开的扫频扫描方法中，正弦波的高电压固定在400伏，或Vpp800伏特。这有利地避免了在高压下电极之间的电击穿。

图2示出本公开的三维离子阱质谱仪的实施例。可以以捕获RF频率Ω驱动离子阱的中心环电极，并且离子阱的端盖电极可以经受辅助的轴向激发RF。阶梯函数发生器提供分析RF步进式频率扫描和轴向共振激发RF步进式频率扫描。

使用函数发生器，可以在可调节的短时间里在线性扫频中向下扫频。通过使用高起始频率捕获离子，然后通过向下扫频到低频率来从低质量到高质量喷射离子。因此，函数发生器可以产生Ωt(Ω=2πf)的频率。射频与分子离子的重量相关。

函数发生器的输出电压可能太低而无法直接捕获离子。可以用高电压功率运算放大器来放大函数发生器的输出电压。从低频到高频的运算放大器的输出电压类似。

根据马修方程的解，当RF电压(V)与扫频扫描匹配时，分子离子的重量与RF频率(Ω)相关。

例如，DS345任意函数发生器可以实施如图3所示的扫频。扫频可以在频率中向上或向下进行，并且可以进行线性扫频或对数扫频。当扫频经过一定的频率时不存在中断或波段切换伪影(band-switching artifact)。可以在整个频率范围上进行平滑而相位连续的扫频。此扫频的缺点是缺乏相位控制，换句话说，每个相继的特定频率起始于任意相位，并且不起始于零相位。此扫频的另一缺点是对改变频率的控制局限于设置扫频时间。

图3所示的线性扫频模式局限于对整个频率范围扫频。此外，在改变到下一频率之前未在整个周期上完成特定频率。因此，在频率改变时不能清晰地限定频率。

由于这些缺点，在改变到下一频率之前，所观察到的波形未在特定频率上彻底完成一周期。因此，离子喷射信号无法与精确的频率相关。这对于高分辨质谱法而言是严重缺陷。

为了解决这个问题，并且为了提供对驱动RF的频率和相位的最终控制，本公开提供了一种用于质谱仪的顺序控制器。所述顺序控制器可以提供如图4所示的离子检测的时序图。在一些实施例中，所述顺序控制器将包括通用计算机(PC)和阶梯函数发生器。

在图4所示的实验实施例中，激活检测器时的期间为离子检测期间。在激活检测器时的期间中，轴向共振激发从150kHz步进降至50kHz，并且分析RF从300kHz步进降至100kHz。激光发射产生离子发生在检测期间之前。

在本公开的方法中，通过使用顺序控制器直接数字化合成波形来实施步进式频率扫描。在任何时候可以产生具有特定频率和相位的波形。可以精确地控制正弦波形的频率变化，并且可以将特定的频率精确地保持固定数量的完整周期。本公开的步进扫描方法可以在每个单独的频率步进中提供对质谱仪数据采集的精确控制。

在本公开的一些实施例中，通过使用AD5930波形发生器产生正弦波形。AD5930是能够提供频域和时域中的数字式可编程波形序列的通用波形发生器。该设备包含嵌入式数字处理以提供对用户可编程频率分布的重复扫描，从而可以增强频率控制。因为该设备是可预先编程的，所以其消除了DSP在产生特定波形中的连续的写周期。使用AD5930，波形可以从已知的相位开始并且相位连续地进行增量，使得可以很容易地确定相移。

在本公开的某些实施例中，步进式扫描用于由起始频率(Fstart)、频率增量(Δf)以及每次扫描的增量的数量(Ninc)来限定频率分布的情况。例如，如图5所示，步进扫描从Fstart增量到Fstart+(Ninc×Δf)。每个特定的频率可以保持几个周期，而检测器收集并整合信号，因此，可以在每个特定频率上在其改变到下一频率之前完整地喷射检测到的离子。此步进扫描方法的优点在于，可以精确的限定离子信号与喷射频率的关系。此外，本公开的步进扫描方法有利地在每个频率步进起始提供了对相位的控制。

在一个实施例中，正弦波发生器的时钟为50MHz。AD5930具有24位数字输出。Ninc被设置为4096点。保持每个特定频率的周期数为120(Ncycle)。起始频率Fstart为300kHz。最终频率Fend为100kHz。固件频率步进DFreq为(300000-100000)／[4096{50E+6／(2E+24-1)}]=16.38Hz，四舍五入到16Hz。差分频率步进为16*{50E+6／(2E+24-1)}=47.68Hz。最终的频率为300000-[16*{50E+6／(2E+24-1)}*4096]＝104687.5Hz。

此外，每步进中增量的量Δf可以是负的或正的，并且可以是任意大小，使得步进式扫描可以在频率中向上或向下以任意大尺寸或小尺寸的步进来进行。

无论是粗差分频率步进或细差分频率步进，本公开的频率扫描方法均可以允许精确的控制。本公开的频率扫描方法还可以提供高分辨率的快速扫描。

本公开的频率扫描方法可以允许在离子信号与扫描频率之间建立精确的关系。

在进一步的实施例中，捕获频率可以斜线下降到恒定电压幅度。

在另外的实施例中，通过使用高电压功率运算放大器放大正弦波形。例如，可以使用被设计用于驱动高达100mA的连续输出电流和高达200mA的脉冲电流至电容性负载中的高电压MOSFET运算放大器的APEX PA94。

在图6所示的示例性实施例中，通过步进式扫描耦合MALDI源获得血管紧张素(angiotensin)的质谱。频率差分被划分为4096步进，并且每步进保持120个周期。因此，本公开提供了获得大生物分子的质谱的方法。

在图7所示的另一示例性实施例中，通过使用步进式扫描方法得到IgG(M.W.150kDa)的质谱。因此，本公开提供了用于获得非常大的生物分子的质谱的方法。

对于共振激发而言，沿离子阱中的轴向施加辅助的振荡AC电场。辅助振荡电场的频率等于离子长期频率(ion secular frequency)ω_z。频率与离子的长期运动在轴向上谐振，使得离子的动能增加并且离子的轨迹扩大。最后，离子穿过离子阱端盖的孔。基本频率与长期频率相关并且可以表达为ω_z=(1／2)β_zΩ。

为了通过步进式扫描方式实施质谱分析，可以线性改变基本频率，并且将q_z固定为某一值。因此，辅助AC的频率可以通过共振激发式与基本频率成比例地改变。此方法使用了两个波形发生器，例如两个AD5930，以产生可以由PA94放大的两个正弦波形。可以将基本捕获RF施加到中心环，并且将谐振激发RF施加到作为偶极耦合喷射的端盖。对于β_z等于1，在整个步进式频率扫描中将长期频率设置为基本频率的一半。

本公开的频率扫描方法允许在基本捕获频率和辅助频率之间建立精确的比例。

在另外的方案中，本发明可以提供一种能够以高检测效率和分辨率检测诸如蛋白质、抗体、蛋白质复合物、蛋白质偶联物、核酸、寡核苷酸、DNA、RNA、多糖和许多其他物质的生物分子的质谱仪装置和方法。

在一些实施例中，可以使用本发明的方法获得纳米颗粒、病毒和具有高达约50纳米或更大范围尺寸的其他生物组分和细胞器的质谱。

在一些变型中，本公开的装置和方法还可以提供小分子离子的质谱。

质谱法中的离子化方法的示例包括激光离子化、MALDI、电喷雾离子化、热喷离子化、热离子化、电子离子化、化学离子化、电感耦合等离子体离子化、辉光放电离子化、场解吸离子化、快原子轰击离子化、火花离子化或离子附着离子化。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员所通常理解的相同含义。虽然在本发明的实施或测试中可以使用类似或等同于本文所描述的任何方法和材料，但是本文描述了优选的方法和材料。

通过引用合并本文具体提及的所有出版物和专利、文献用于所有目的。本文的任何内容均不视为承认本发明无权以在先发明的方式先于这样的公开。

应当理解，本发明并不限定于所描述的特定方法、方案、材料和反应物，因为这些可能会发生变化。还应当理解，本文所用的术语仅用于描述特定实施例的目的，并且无意限制由所附权利要求涵盖的本发明的范围。

必须指出的是，如本文以及在所附的权利要求中所使用的，单数形式的“一”、“一个”和“该”包括复数形式，除非上下文另有明确规定。术语“一”(或“一个”)、“一个或多个”以及“至少一个”可以互换使用。还应指出的是，术语“包括”、“包括着”、“包含”、“含有”以及“具有”可以互换使用。

无需进一步详尽说明的是，相信本领域技术人员可以基于上面的描述最大限度地利用本发明。因此，下面的具体实施方式应当被解释为仅仅是说明性的，而不以任何方式限制本公开的其余部分。

本说明书中公开的所有特征可以以任何组合方式进行组合。本说明书中公开的每个特征可以由替代特征所代替而用于相同、等同或类似的目的。

Claims (9)

1.一种获得离子的质谱的方法，包括：

在四极离子阱中捕获离子，所述四极离子阱包括中心环电极和两个端盖电极；

将第一特定频率的RF施加到所述中心环电极持续所述第一特定频率的RF的第一数量的完整周期；以及

将第二特定频率的RF施加到所述中心环电极持续所述第二特定频率的RF的第二数量的完整周期，其中所述第二特定频率的RF起始于零相位而施加，并且其中所述第二特定频率的RF与所述第一特定频率的RF在频率上相差Δf₁的量。

2.根据权利要求1所述的方法，其中Δf₁为1Hz至256Hz。

3.根据权利要求1所述的方法，其中完整周期的所述第一数量和所述第二数量分别独立地为10至1000000。

4.根据权利要求1所述的方法，还包括以下额外的步骤：将特定频率的RF施加到所述中心环电极持续所述特定频率的RF的多个完整周期，其中每个附加的特定频率的RF起始于零相位而施加，并且其中所述每个附加的特定频率的RF与前一特定频率的RF在频率上相差Δf_n的量。

5.根据权利要求4所述的方法，其中Δf_n为1Hz至256Hz。

6.根据权利要求1所述的方法，还包括：将第一特定轴向频率的RF施加到所述端盖电极持续所述第一特定轴向频率的RF的第一数量的完整周期；以及

将第二特定轴向频率的RF施加到所述端盖电极持续所述第二特定轴向频率的RF的第二数量的完整周期，其中所述第二特定轴向频率的RF起始于零相位而施加，并且其中所述第二特定轴向频率的RF与所述第一特定轴向频率的RF在频率上相差Δf₁的量。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述离子是选自以下的分子或结构的离子化分子或片段：纳米颗粒、抗体、蛋白质复合物、蛋白质偶联物、寡核苷酸、DNA、RNA、多糖、病毒、以及细胞。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述离子具有1kDa至200kDa的分子量。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述离子产生自：基质辅助激光解吸/电离、电喷雾离子化、激光离子化、热喷离子化、热离子化、电子离子化、化学离子化、电感耦合等离子体离子化、辉光放电离子化、场解吸离子化、快原子轰击离子化、火花离子化、或离子附着离子化。