CN103808906B - 一种基于乳酸脱氢酶测定的电子烟烟液细胞毒性评价方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于乳酸脱氢酶测定的电子烟烟液细胞毒性评价方法，包括以下步骤：1）配制实验试剂，2）细胞接种，3）电子烟烟液染毒，4）LDH测定，5）结果与分析。本发明针对大多数电子烟烟液样本密度大的特点，确立了采用质量称重配制电子烟染毒溶液的方法。本发明的评价方法通过细胞接种密度的优化、细胞裂解液的选择、LDH基质液反应时间的优化提高检测灵敏度，并通过电子烟烟液染毒浓度的优化，确定了最佳染毒浓度，以获得最佳剂量效应曲线。通过LDH的测定，可反映电子烟烟液对细胞膜的损伤程度，揭示电子烟的细胞毒性机理。此外，本测定方法还具有操作快速简便、灵敏性高、结果稳定的优点。
Description
技术领域
本发明涉及电子烟烟液体外毒理学评价研究领域，具体说是一种基于乳酸脱氢酶测定的电子烟烟液细胞毒性的方法。
背景技术
随着人们对“吸烟有害健康”的了解，各国政府均在现行法律规定范围内积极采取和实行有效的立法、行政或其他措施，禁止在公共场所吸烟。2005年，中国签署了世界卫生组织《烟草控制框架公约》。2012年，中国政府发布《中国烟草控制规划（2012-2015年）》，提出创造无烟环境，实施公共场所全面禁烟。室内禁烟措施导致电子烟等新型产品在各国市场上得到迅速增长，消费群体不断扩大。电子烟又名电子尼古丁传送系统。世界卫生组织对电子尼古丁传送系统的官方定义为：电子尼古丁传送系统是一种消费产品，能够向肺传输尼古丁。电子烟一般都由三部分构成：烟杆、雾化器、烟液。近年来，电子烟以“保健”，“戒烟”，“清肺”等为宣传口号，以网络为主要营销途径，在中国地区销量大增。某些电子烟产品还宣称其比传统卷烟的危害性更小。然而目前对电子烟的毒性评价研究较少，相关研究仅使用3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐法（MTT法）对电子烟烟液或烟雾的细胞毒性进行评价，结果表明不同电子烟烟液的细胞毒性相差很大。
检测化合物细胞毒性可通过多种生物学终点进行，例如通过测定酸性磷酸酶或其他蛋白活性来计算细胞数量、测定细胞代谢活性（例如MTT法）以及检测细胞膜的完整性等生物学终点进行评价。根据不同检测原理开展细胞毒性评价，可从不同角度揭示化合物细胞毒性的作用机理。
细胞凋亡或化合物染毒而造成的细胞膜结构的破坏会导致细胞浆内的酶释放到培养液里，其中包括酶活性较为稳定的乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)。通过检测释放的乳酸脱氢酶的活性，可表征细胞膜的完整性，实现对化合物细胞毒性的定量分析。
目前，电子烟烟液染毒对细胞膜的完整性影响还未见文献报道，亟需建立基于LDH测定的电子烟烟液细胞毒性评价方法，考察电子烟烟液细胞毒性的作用机理，定量准确评价市售电子烟产品烟液的细胞毒性。
发明内容
本发明的目的是建立的一种LDH测定的电子烟烟液细胞毒性评价方法，为电子烟产品的细胞毒性评价提供方法学支持。LDH法的测定原理是基于在乳酸脱氢酶的作用下，氧化型辅酶Ⅰ（NAD+）被反应生成的还原型辅酶Ⅰ（NADH），再与氧化型2-（4-碘苯）-3-（4-硝基苯）-5-苯四唑（INT）在硫辛酰胺脱氢酶（diaphorase）的催化下反应生成强生色物甲臜（formazan），在490nm波长下产生吸收峰，从而确定释放的乳酸脱氢酶的活性，作为细胞膜完整性的标志，实现对细胞毒性的定量分析。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种基于乳酸脱氢酶测定的电子烟烟液细胞毒性评价方法，包括以下步骤：
1）配制实验试剂：有以下几种：
（1）LDH基质液的配制：用0.2 mol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐-盐酸（Tris-HCl）缓冲液（pH8.2）配制LDH基质液，其中各成分及其终浓度分别为：乳酸锂5×10-2 mol/L、硝基氯化四氮唑（INT） 6.6×10-4 mol/L、吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS） 2.8×10-4 mol/L、氧化型辅酶Ⅰ（NAD）1.3×10-3 mol/L，LDH基质液应在临用前配制；
（2） 细胞裂解液： 20%的曲拉通100（Triton-100）；
（3）终止液：4M的盐酸（HCl）溶液；
（4）细胞培养基：溶剂为RPMI-1640 培养基，其中胎牛血清的体积百分比为10%，L-谷氨酰胺的浓度为2 mM，青霉素的浓度为100 IU/ml，链霉素的浓度为100μg/ml；
（5）电子烟烟液染毒溶液：由于电子烟烟液的主要组成成分包括丙二醇、丙三醇等保润剂，导致电子烟烟液溶液密度较大，无法准确移取体积进行染毒溶液的配制。因此，本发明中使用精度不小于万分之一的分析天平对电子烟烟弹液进行准确称量，然后使用细胞培养基溶液配制。电子烟烟液染毒浓度范围应覆盖为10mg/ml-120 mg/ml，应设置不少于7个非零染毒浓度。
2）细胞接种：本方法所用细胞系为中国仓鼠卵巢细胞CHO细胞。在考察电子烟烟液对CHO细胞系的细胞毒性时，需开展预实验，对细胞接种密度进行优化。向96孔板的每孔中加入100 μL细胞悬液，按照优化好的细胞接种密度进行细胞接种，96 孔板的最外周36 个孔中每孔加入100 μl 生长培养液作为空白对照，其余每孔加入100 μl 细胞悬液，于37 ℃、5% CO2 条件下培养24 h；
3）电子烟烟液染毒：细胞培养至指数增长期后，吸去培养液，96 孔板（除最外周36 孔）每6 孔为一组，分别设置正常对照组、7个不同剂量的电子烟烟液染毒组和LDH最大释放组（细胞中能释放出来的LDH最大量），正常对照组和LDH最大释放组均每孔加入100 μl的细胞培养基，电子烟烟液染毒组每孔加入100 μl不同浓度的电子烟烟液染毒溶液，96 孔板的最外周36 个孔中选择其中6个孔作为培养基背景对照，再选择6个孔加入最高电子烟烟液染毒溶液作为染毒溶液背景对照，于37 ℃、5% CO2 条件下培养24 h。
4）LDH测定：电子烟烟液对细胞染毒24h，染毒结束前15分钟，在最大释放量孔中加入5μl裂解液。染毒结束后使用250g离心力对细胞培养板离心5分钟，每孔移取50μl上清至透明96孔板，加入100μlLDH基质液，反应一段时间后，加入50μl终止液，使用酶标仪检测每孔在490 nm 波长处的吸光值。
6）结果与分析
原始吸光值A ：A = A490 nm
A(染毒孔吸光度值)=6个平行孔的吸光度平均值
A(染毒溶液背景)=6个平行孔的吸光度平均值
A(培养基背景)=6个平行孔的吸光度平均值
A(空白对照组)=6个平行孔的吸光度平均值
A(最大释放组)=6个平行孔的吸光度平均值
本发明中，在开展细胞毒性评价前，需对染毒所用细胞株的细胞接种密度进行优化，在细胞培养板中分别接种含有不同细胞个数的100μl细胞悬液，每个接种密度为6孔平行，将细胞培养板放入细胞培养箱中孵育24小时。每个接种密度选择3孔测定LDH最大释放量：每孔加入5μl细胞裂解液，反应15min，将细胞中所有LDH释放至培养基中。每个接种密度的剩余3孔作为空白对照组：不加细胞裂解液，培养基中仅含有少量细胞生长过程中自发释放的LDH。使用250g离心力对细胞培养板离心5分钟，每孔移取50μl上清至透明96孔板，加入100μl的LDH基质液，反应15分钟后，加入50μl终止液，使用酶标仪检测每孔在490 nm 波长处的吸光值。选择LDH最大释放量与空白对照组吸光度值相差最大，且细胞处于指数增长期的细胞个数作为最优细胞接种密度。
图1所示为不同CHO细胞接种个数与其最大LDH释放量和空白对照组吸光度值的响应曲线，如图4可知，当CHO细胞接种密度等于或大于20000个/孔时，细胞LDH最大释放量达到平台期，这表明细胞接种密度过高，已出现抑制作用，细胞无法继续增殖和生长。在其余接种密度中，当细胞接种密度为10000个/孔时，细胞LDH最大释放量与空白对照组吸光度值相差最大，且细胞处于指数增长期。因此，在开展LDH测定时，选择CHO细胞接种密度为10000个/孔。
本发明中对文献报道常用的细胞裂解液进行了筛选，以得到细胞中准确的LDH最大释放量。图2所示为分别使用终浓度为1%的乙基苯基聚乙二醇-40（NP-40）、1%十二烷基磺酸钠（SDS）和1% Triton-100作为细胞裂解液，对10000个/孔接种密度下的CHO细胞孵育48h之后检测得到的LDH最大释放量。如图2可知，最终浓度为1%的Triton-100裂解细胞后检测得到的LDH释放量最大，故本发明中选择细胞裂解液为20% Triton-100，使用时加入5μl至含有100μl培养基的培养孔中，使其最终浓度为1%。
为提高检测灵敏度，本发明对LDH基质液加入后的孵育时间进行了优化。图3所示为10000个/孔接种密度下的CHO细胞孵育48h之后，每孔加入5μl的细胞裂解液反应15min。然后使用250g离心力对细胞培养板离心5分钟，每孔移取50μl上清至透明96孔板，加入100μl的LDH基质液，分别反应5min、10min、15min、20min、30min，每孔均加入50μl终止液，使用酶标仪检测490 nm 波长处的吸光值。如图3可知，当加入LDH基质液的反应时间大于15min后，检测响应不再增大。为缩短实验分析时间，本发明中选择15分钟作为加入LDH基质液的反应时间。
为得到电子烟烟液细胞毒性的剂量-效应曲线，本发明中对电子烟样品1烟液的染毒浓度进行了优化，图4所示为CHO细胞分别用10mg/ml，20mg/ml，40 mg/ml，50 mg/ml，60 mg/ml，80 mg/ml，100 mg/ml，120 mg/ml电子烟样品1烟液染毒所得到的剂量效应曲线，如图4可知，当染毒浓度为10mg/ml至120 mg/ml时，电子烟样品1烟液对细胞的细胞毒性由小变大，有很好的剂量效应关系，因此考察电子烟烟液细胞毒性浓度的染毒区间应包含10mg/ml-120 mg/ml范围。
本发明根据电子烟烟液的特性，建立了一种基于LDH测定评价电子烟烟液细胞毒性的方法，本发明具有以下特点：（1）针对大多数电子烟烟液样本密度大的特点，确立了采用质量称重配制电子烟染毒溶液的方法。（2）通过细胞接种密度的优化步骤，本发明可适用于多种贴壁培养细胞，可用于考察电子烟烟液对不同细胞系的细胞毒性。（2）通过细胞裂解液的选择、LDH基质液反应时间的优化提高检测灵敏度。（3）并通过电子烟烟液染毒浓度的优化，确定了最佳染毒浓度，以获得最佳剂量效应曲线。通过LDH的测定，可反映电子烟烟液对细胞膜的损伤程度，揭示电子烟的细胞毒性机理。此外，本测定方法还具有操作快速简便、灵敏性高、结果稳定的优点。
附图说明
图1. 细胞接种密度优化图；
图2. 细胞裂解液优化；
图3. LDH基质液反应时间优化；
图4. 电子烟样品1烟液细胞毒性的剂量-效应曲线；
图5. 电子烟样品2烟液的细胞毒性。
具体实施方式
本发明以下结合实施例做进一步描述，但并不是限制本发明。
实例1：为考察电子烟样品2对CHO细胞系的细胞毒性，开展以下实验：
按前述要求配制所需实验试剂。使用分析天平称取电子烟样品2的烟液240mg，加入1.2ml培养基，配制终浓度为200mg/ml的染毒溶液母液。然后使用培养基进一步稀释，配制染毒浓度分别为10mg/ml，20mg/ml，40mg/ml，50mg/ml，60mg/ml，70mg/ml，80mg/ml，100mg/ml，120mg/ml的一系列不同浓度的电子烟烟液染毒浓度。
将CHO细胞株培养于含10％胎牛血清的1640培养基中，于37 ℃，5％C02培养箱中培养,当细胞生长至汇合率为70%-80%时，用0.25％胰蛋白酶消化法进行细胞接种。96孔板中，细胞接种密度为10000个/孔，接种后孵育24小时。吸出培养基，加入电子烟烟液染毒溶液，同时设立空白对照组、最大LDH释放组、溶剂背景组、培养基背景组，每组6孔平行。将细胞培养板放入细胞培养箱中染毒24小时。染毒结束前15分钟，在最大释放量孔中加入5μl裂解液。染毒结束后使用250g离心力对细胞培养板离心5分钟，每孔移取50μl上清至透明96孔板，加入100μlLDH基质液，反应15分钟后，加入50μl终止液，使用酶标仪检测每孔在490 nm 波长处的吸光值。检测得到培养基背景的吸光度值为0.4317，电子烟染毒溶液背景的吸光度值为0.4431，细胞LDH最大释放值为2.9357。根据染毒后各孔吸光度值得到电子烟样品2烟液细胞毒性的剂量效应曲线，如图5所示。可通过计算IC50值，实现不同电子烟烟液细胞毒性的比较。
Claims (3)
1.一种基于乳酸脱氢酶测定的电子烟烟液细胞毒性评价方法，其特征在于：包括以下步骤：
1） 配制实验试剂：
（1）LDH基质液的配制：用0.2 mol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐-盐酸（Tris-HCl）缓冲液（pH8.2）配制LDH基质液，其中各成分及其终浓度分别为：乳酸锂5×10-2 mol/L、硝基氯化四氮唑（INT） 6.6×10-4 mol/L、吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS） 2.8×10-4 mol/L、氧化型辅酶Ⅰ（NAD）1.3×10-3 mol/L，LDH基质液应在临用前配制；
（2） 细胞裂解液： 20%的曲拉通100（Triton-100）；
（3）终止液：4M的盐酸（HCl）溶液；
（4）细胞培养基：溶剂为RPMI-1640 培养基，其中胎牛血清的体积百分比为10%，L-谷氨酰胺的浓度为2 mM，青霉素的浓度为100 IU/ml，链霉素的浓度为100μg/ml；
（5）电子烟烟液染毒溶液：用分析天平对电子烟烟液进行准确称量，然后使用细胞培养基溶液配制，电子烟烟液染毒浓度范围10mg/ml~120 mg/ml，设置不少于7个非零染毒浓度；
2）细胞接种：所用细胞系为中国仓鼠卵巢细胞CHO细胞，向96孔板的每孔中加入100 μL细胞悬液，按照优化好的细胞接种密度进行细胞接种，96 孔板的最外周36 个孔中每孔加入100 μl 生长培养液作为空白对照，其余每孔加入100 μl 细胞悬液，于37 ℃、5% CO2 条件下培养24 h；在开展细胞毒性评价前，需对染毒所用细胞株的细胞接种密度进行优化，选择LDH最大释放量与空白对照组吸光度值相差最大，且细胞处于指数增长期的细胞个数作为最优细胞接种密度，本发明中CHO细胞的最佳接种密度为10000个/孔；
3）电子烟烟液染毒：细胞培养至指数增长期后，吸去培养液，96 孔板（除最外周36 孔）每6 孔为一组，分别设置正常对照组、7个不同剂量的电子烟烟液染毒组和LDH最大释放组，正常对照组和LDH最大释放组均每孔加入100 μl的细胞培养基，电子烟烟液染毒组每孔加入100 μl不同浓度的电子烟烟液染毒溶液，96 孔板的最外周36 个孔中选择其中6个孔作为培养基背景对照，再选择6个孔加入7个剂量中的最高剂量电子烟烟液染毒溶液作为染毒溶液背景对照，于37 ℃、5% CO2 条件下培养24 h；
4）LDH测定：染毒结束前15分钟，在LDH最大释放量孔中加入5μl裂解液，染毒结束后使用250g离心力对细胞培养板离心5分钟，每孔移取50μl上清至透明96孔板，加入100μlLDH基质液，反应一段时间后，加入50μl终止液，使用酶标仪检测每孔在490 nm 波长处的吸光值；
5）结果与分析
原始吸光值A ：A = A490 nm
A(染毒孔吸光度值)=6个平行孔的吸光度平均值
A(染毒溶液背景)=6个平行孔的吸光度平均值
A(培养基背景)=6个平行孔的吸光度平均值
A(空白对照组)=6个平行孔的吸光度平均值
A(最大释放组)=6个平行孔的吸光度平均值
。
2.根据权利要求1所述的基于乳酸脱氢酶测定的电子烟烟液细胞毒性评价方法，其特征在于：细胞裂解液使用时其终浓度为1%。
3.根据权利要求1所述的基于乳酸脱氢酶测定的电子烟烟液细胞毒性评价方法，其特征在于： LDH基质液的反应时间为15min。
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